Anda di halaman 1dari 8

A.

PENDAHULUAN

DNA adalah molekul utama yang mengkode semua informasi yang dibutuhkan untuk
proses metabolisme dalam organisme. DNA ini tersusun atas 3 komponen utama yaitu gula
deoksiribosa, basa nitrogen, dan fosfat yang tergabung membentuk nukleotida. DNA terdapat di
dalam setiap sel makhluk hidup yang sangat berperan penting sebagai pembawa informasi
hereditas yang menentukan stuktur protein dan proses metabolisme lain. Dewasa ini telah
banyak dilakukan isolasi DNA yang bertujuan untuk mengembangkan.
Dewasa ini telah banyak dilakukan isolasi DNA yang bertujuan untuk mengembangkan
ilmu pengetahuan terutama dalam ilmu Genetika. Isolasi DNA telah banyak dilakukan dan
dikembangkan di dunia ilmiah karena teknologi – teknologi modern telah menjamah ilmu
genetika. Isolasi DNA ini dapat dilakukan dengan cara dan bahan sederhana, hingga dengan
teknologi modern. Mengenai hal ini, pada dasarnya isolasi DNA dapat dilakukan dari berbagai
sumber, antara lain organ manusia, darah, daun, daging buah, kalus, akar batang, daging dan
sisik ikan. Pengisolasian DNA pada sumber dilakukan terutama untuk pengenalan DNA secara
lebih jelas karena dari isolasi ini DNA dapat terpisah dari kumpulannya, yaitu kromosom.
Setelah dilakukan isolasi, biasanya DNA akan dielektroforesis.
Langkah awal yang sangat menentukan dalam keberhasilan penelitian molekuler yang
berbasis pada DNA adalah kualitas DNA yang diperoleh dari tahapan isolasi. Kemurnian dan
kualitas DNA yang diperoleh dari tahap ini akan sangat menentukan dalam penelitian penelitian
biologi molekuler. Tiga langkah utama dalam isolasi DNA adalah perusakan dinding sel atau
lisis, pemisahan DNA dari bahan padat seperti selulosa dan protein, serta pemurnian DNA
(Surzycki, 2000).
Meskipun isolasi DNA dapat dilakukan dengan berbagai cara, akan tetapi pada setiap
jenis atau bagian tanaman dapat memberikan hasil yang berbeda, hal ini dikarenakan adanya
senyawa polifenol dan polisakarida dalam konsentrasi tinggi yang dapat menghambat pemurnian
DNA. Jika isolasi DNA dilakukan dengan sample buah, maka kadar air pada masing-masing
buah berbeda, dapat memberi hasil yang berbeda-beda pula. Semakin tinggi kadar air, maka sel
yang terlarut di dalam ekstrak akan semakin sedikit, sehingga DNA yang terpretisipasi juga akan
sedikit.
Ada 5 tahap untuk melakukan isolasi DNA, yaitu: isolasi sel, pelisisan dinding dan
membran sel, pengekstraksian dalam larutan, purifikasi, dan presipitasi. Tahap pertama yang
dilakukan yaitu mengisolasi sel yang ingin digunakan, yaitu sel darah. Tahap selanjutnya yaitu
melisiskan dinding dan membran sel dengan larutan pelisis sel. Setelah dilakukan inkubasi,
sitoplasma sel yang telah bercampur dengan pelisis sel tersebut lalu disentrifugasi selama 15
menit dengan kecepatan 3000 rpm. Selanjutnya supernatan yang terbentuk dibuang dan
kemudian dilakukan ekstraksi di dalam larutan. Hal tersebut bertujuan agar didapat ekstrak
nukleus sel. Tahap berikutnya adalah purifikasi. Tahap ini bertujuan untuk membersihkan
nukleus sel dari zat-zat lainnya, dan tahap terakhir, yaitu presipitasi bertujuan untuk
mengendapkan protein, sehingga untai-untai DNA tidak lagi menggulung (coiling), yang
menyebabkan DNA menjadi terlihat.
Elektroforesis adalah suatu cara analisis kimiawi yang didasarkan pada pergerakan
molekul-molekul protein bermuatan di dalam medan listrik (titik isoelektrik). Pergerakan
molekul dalam medan listrik dipengaruhi oleh bentuk, ukuran, besar muatan dan sifat kimia dari
molekul (TITRAWANI 1996). Pemisahan dilakukan berdasarkan perbedaan ukuran berat
molekul dan muatan listrik yang dikandung oleh makro-molekul tersebut. Bila arus listrik
dialirkan pada suatu medium penyangga yang telah berisi protein plasma maka komponen-
komponen protein tersebut akan mulai bermigrasi (Ricardson dkk. 1986).
Menurut Stenesh dalam TITRAWANI (1996) teknik elektroforesis dapat dibedakan
menjadi dua cara, yaitu : elektroforesis larutan (moving boundary electrophoresis) dan
elektroforesis daerah (zone electrophoresis). Pada teknik elektroforesis larutan, larutan
penyangga yang mengandung makro-molekul ditempatkan dalam suatu kamar tertutup dan
dialiri arus listrik. Kecepatan migrasi dari makro-molekul diukur dengan jalan melihat terjadinya
pemisahan dari molekul (terlihat seperti pita) di dalam pelarut. Sedangkan teknik elektroforesis
daerah adalah menggunakan suatu bahan padat yang berfungsi sebagai media penunjang yang
berisi (diberi) larutan penyangga.
Media penunjang yang biasa dipakai adalah gel agarose, gel pati, gel poliakrilamida dan
kertas sellulose poliasetat. Adapaun menurut Sargent & George (1975) elektroforesis daerah
disebut sebagai elektroforesis gel dengan dua buah model yaitu horizontal dan vertikal. Metode
yang biasa digunakan adalah model horizontal, karena mempunyai beberapa keuntungan yaitu
peralatan yang digunakan sangat sederhana, relatif murah dan pemisahan untuk enzim tertentu
dapat menghasilkan pemisahan yang lebih baik.

B. TUJUAN PRAKTIKUM

Tujuan dari praktikum ini adalah agar praktikan dapat mengetahui cara mengisolasi dan
elektroforesis serta dapat mengisolasi DNA dan elektroforesis DNA dari darah.
C. ALAT dan BAHAN
Peralatan yang digunakan pada praktikum ini adalah tabung mikrosentrifus, incubator,
yellowtip, bluetip, sentrifuge, mikropipet, waterbath, vortex, beaker glass besar, tisu, sarung
tangan, masker, timbangan analitik, stirrer dan hot plate, beaker glass kecil, box ice, apparatus
elektroforesis, kertas parafilm, sisiran, gel doc, penghantar listrik, kertas label, dan botol limbah.
Bahan-bahan yang digunakan adalah sampel darah, buffer lisis A, buffer lisis B, buffer lisis C,
fenol, larutan campuran fenol : kloroform (1:1), etanol absolute, etanol 70%, buffer D, aquades,
larutan TAE, agarose, , loading dye, dan larutan ETBR.

D. PROSEDUR KERJA
1. Isolasi DNA
1.1 Tahap Lisis
Sampel darah yang akan diisolasi disiapkan, kemudian buffer lisis a diambil
sebanyak 500 µl lalu dimasukan kedalam tabung mikrosentrifus berukuran 1,5 mL.
Setelah itu sampel darah dimasukan sebanyak 500 µl kedalam mikrosentrifus yang
sudah terdapat buffer lisis a kemudian di bolak-balik dengan kuat sampai semua
larutan larut. Setelah dibolak-balik tabung mikrosetrifus di inkubasi disuhu ruang
selama 10 menit dan kemudian di sentrifuge dengan kecepatan 13.000 Rpm dalam
suhu 4oC selama 3 menit. Setelah itu supernatant (bagian atas) dibuang, sisakan pellet
dan tambahkan buffer lisis b sebanyak 500 µl dan diinkubasi di waterbath pada suhu
37oC selama 15 menit, kemudian tabung mikrosentrifus dibolak-balik dan di vortex
dengan kuat selama 2 menit sampai larut.
1.2 Tahap Presipitasi Protein
Setelah sampel tercerna semua, larutan fenol sebanyak 200 µl dalam tabung
mikrosentrifus, kemudian dibolak-balik dan di vortex lagi dengan kuat selama 5
menit sampai larut. Setelah itu disentifrus dengan kecepatan 13.000 Rpm dengan
suhu 4oC selama 3 menit, dan ambil supernatant (bagian atas) lalu pindahkan ke
dalam tabung mikrosentrifus baru. Dalam tabung mikrosentrifus yang baru
ditambahkan larutan fenol : kloroform 1:1 sebanyak 400 µl lalu tabung dibolak-balik
secara perlahan sampai semua larutan bercampur dengan baik dan terlihat benang-
benang putih. Setelah itu tabung divortex secara perlahan selama 5 menit sampi lrut
dan disentrifus dengan kecepatan 13.000 Rpm, pada shu 4oC selama 2 menit sampai
terlihat pellet kecil berwarna putih.
1.3 Tahap Pemurnian DNA
Setelah selesai disentrifus tabung mikrosentrifus dikeluarkan dan supernatant
dibuang dan ditambahkan 500 µl larutan etanol absolut, lalu dibolak-balik secara
perlahan untuk mencuci pellet DNA selama 10 menit. Kemudian tabung disentrifus
dengan kecepatan 13.000 Rpm dalam suhu 4oC selama 3 menit, lalu buang etanol
dengan hati-hati, jangan sampai pelletnya terbuang, kemudian kering anginkan
selama 2 menit. Setelah itu tambahkan etanol 70% sebanyak 5 µl, dan bolak-balik
secara perlahan untuk mencuci pellet DNA. Kemudian disentrifus lagi dengan
kecepatan 13.000 Rpm dalam suhu 4oC selama 4 menit sampai terlihat pellet kecil
berwarna putih, lalu dikeluarkan, dan buang etanol dengan hati-hati lalu kering
anginkan selama 2 menit. Tahap terakhir yaitu buffer d (buffer TE) ditambahkan
sebanyakn100 µl, lalu inkubasi di waterbath pada suhu 37oC selama 60 menit
kemudian simpan sampel pada temperatur 20oC.
2. Elektroforesis
Larutan TAE dibuat, kemudian buffer TAE 50x diencerkan sampai
konsentrasinya 1x dalam akuades sebanyak 50 ml, TEA 50x diambil sebanyak 10 ml
dicampur dengan akuades sebanyak 490 ml. setelah itu buatlah agarose dengan
menimbang agar : - konsentrasi gel 0,8%
Larutan TAE 1x sebanyak 80 ml
Agar yang ditimbang 0,64 gr
- konsentrasi gel 1%
larutan TAE 1x sebanyak 80 ml
agar yang ditimbang 0,8 gr.
Setelah itu magnetic stirrer dicuci dengan akuades yang sudah disterilkan lalu
masukan kedalam larutan agarose, lalu panaskan garose dalam hot plate sampai
berubah jernih. Kemudian setelah jernih agar diangkat dan ditunggu hingga suam-
suam kuku lalu di cetak di aparatus elektroforesis dengan memberikan sisiran
pencetak sumur terlebih dahulu, dan tunggu hingga agar mengeras kemudian
pencetak sumur diangkat. Setelah itu siapkan sampel DNA dalam box ice serta
siapkan juga yellowtip beserta alat lainnya. DNA marker yang digunakan sebanyak
5 µl, untuk sampel DNA jika yang digunakan sebanyak 10 µl maka loading dye
sebanyak 2 µl, jika sampel DNA sebanyak 5 µl maka loading dye sebanyak 1 µl.
loading dye diambil dan ditempatkan pada kertas parafilm, lalu sampel DNA diambil
sebanyak 10 µl dan campurkan dengan loading dye sampai tercampur lalu masukan
dalam tiap sumuran sampai samua sampel salesai. Setelah semua sampel telah siap
dalam sumuran maka siap di-running dengan volt sebesar ± 40-40, current 90-100,
dan dalam waktu running ±3-4 jam. Setelah di-running 3-4 jam, agar diambil dan
direndam dalam larutan E-TBR dulemari asam selama 15-20 menit, lalu agar
dimasukan kedalam gel doc untuk proses visualisasi dengan bantuan sinar UV. Agar
yang sudah digunakan lalu dimasukan dalam beaker glass lalu diencerkan dengan
cara dipanaskan diatas hot plate, kemudian dibuang kedalam botol limbah yang
sudah diberi label.

E. HASIL PENGAMATAN
Gambar Hasil Pengamatan

a. Sampel yang siap disimpan setelah dimurnikan

b. Hasil elektroforesis sampel

F. PEMBAHASAN
Sampel yang digunakan pada praktikum kali ini adalah sampel darah, dari
beberapa praktikan.
Tahap pertama dalam isolsi DNA adalah proses pengrusakan membrane dan
dinding sel. Tahap ini bertujuan untuk mengeluarkan isi sel. Pada tahap ini kita
menggunakan buffer lisis a yang terdiri dari ; sutros 0,32 molar, SDS 10%, MgCl2 5
µmolar, trisHCl 10 µmolar dan Ph 7,4. SDS (sodium dodecyl sulphate) merupakan
detergen yang berfungsi untuk melisiskan membrane sel dan juga dapat mengurangi
aktivitas enzim nuclease yang bertugas mendegradasikan DNA. pH dari buffer yang
digunakan harus berada pada rentang pH 5-12, karena jika terlalu rendah dapat
mengakibatkan depurifikasi sedangkan jika terlalu tinggi dapat menyebabkan
pemisahn untai ganda DNA. Pada tahap lisis kita juga mengunakan buffer lisis b
yang terdiri dari; NaCl dan EDTA, buffer lisis b berfungsi untuk mencuci DNA.
NaCl sendiri berfungsi menghilangkan polisakarida, dan EDTA (ethylenediamine
tetraacetic acid) berfungsi menginkativasi enzim DNase yang dapat
mendenaturasikan DNA yang terisolasi. Selain buffer lisis a, dan b ada juga buffer
lisis c yang terdiri dari ; NaCl, trisHCl, EDTA, SDS, buffer lisis c ini berfungsi untuk
mengendaokan DNA. Fungsi utama buffer adalah untuk menjaga struktur DNA
selama penghancuran dan purifikasi sehingga memudahkan dalam menghilangkan
protein dan RNA serta mencegah aktivitas enzim pendegradasi DNA. Untuk
mengoptimalkan fungsi larutan buffer, dibutuhkan konsentrasi, pH, kekuatan ion,
dan penambahan inhibitor DNAase dan detergen (Surzycki, 2000). Pada tahap lisis
kita juga mengunakan buffer lisis b yang terdiri dari; NaCl dan EDTA, buffer lisis b
berfungsi untuk mencuci DNA. NaCl sendiri berfungsi menghilangkan polisakarida.
Selain buffer lisis a, dan b ada juga buffer lisis c yang terdiri dari ; NaCl, trisHCl,
EDTA, SDS, buffer lisis c ini berfungsi untuk mengendapkan DNA.
Tahap selanjutnya yaitu tahap presipitasi, pada tahap ini kita mengunakan larutan
fenol yang fungsinya sebagai pendenaturasi protein, sehingga protein kehilangan
kelarutannya, selanjutnya di sentrifus agar terpisah antara bahan organic yang akan
terletak di lapisan bawah (fase organic) dan air dilapisan bagian atas (fase aqueous),
DNA akan berada pada interfase atau diantara air dan bahan organic. Larutan
campuran antara fenol dan kloroform berfungsi untuk mendenaturasi protein. Pada
tahap presipitasi ini DNA akan terpisah dari residu dan protein. Dan pellet kecil
berwarna putih yang terlihat pada tahap ini merupakan DNA pekat.
Tahap terakhir yaitu tahap pemurnian. Setelah tahap presipitasi maka harus
dilakukan pencucian dengan etanol dimana prosedurnya bagian atas pada tabung
mikrosentrifus dibuang kemudian ditambahkan etanol pekat yang bertujuan mencuci
kemudian etanol dibuang agar tidak ada residu dari etanol. Setelah pellet DNA
dikering anginkan selama 2 menit makan ditambahakan buffer TE yang bertujuan
untuk menjaga DNA agar dapat bertahan selama beberapa waktu yang lama.
Dalam elektroforesis ada beberapa larutan yang digunakan salah satunya larutan
TAE yang memiliki fungsi sebagai perendam agar dan juga penghantar aliran lisrik
saat running. Agarose yang digunakan dalam metode elektroforesis juga merupakan
suatu fraksi dari agar-agar yang memiliki polimer netral dan sedikit mengandung
sulfat. Konsentrasi agarose sangat berpengaruh dalam elektroforesis karena semakin
tinggi konsentrasi maka ruang antar molekul pada agarose lebih kecil sehingga dapat
mempersulit pergerakanmolekul yang melewatinya. Loading dye sendiri berfungsi
menambah densitas DNA, pewarna, da tanda perpindahan DNA, sedangkan ETBR
yang merupakan cairan yang bersifat karsinogenik ini berfungsi untuk mengikat
molekul DNA dan dapat menangkap sinar UV. Elektroforesis memiliki prinsip kerja
bahwa suatu molekul (DNA) yang bermuatan negatif jika dialiri listrik akan bergerak
menuju kutub positif
Hasil dari praktikum kali ini hanya 6 sampel yang kelihatan, namun 3 sampel
diantaranya tidak terlalu jelas. Kemungkinan terbesar mengapa ada sampel yang
gagal yaitu karena terjadi kesalahan pada bagian pemurnian DNA, mungkin saja
ketika dibuang etanol sampel DNA ikut juga terbuang sehingga hasilnya negative,
dan untuk yang hanya kelihatan sedikit bisa diakibatkan sampel FNA yang tertinggal
sedikit pula. Untuk sampel yang kelihatan jelas merupakan sampel DNA yang telah
diisolasi oleh laboran sedangkan 3 lainnya merupaka sampel DNA dari hasil isolasi
kelompok a dan c.

G. KESIMPULAN

Dari praktikum ini kita dapat menyimpulkan bahwa elektroforesis memiliki


prinsip kerja bahwa suatu molekul (DNA) yang bermuatan negatif jika dialiri listrik
akan bergerak menuju kutub positif milik elektroforesis melalui matriks membran gel
agarose. Panjang fragmen DNA dapat terlihat dengan menggunakan gel doc yang
pada saat didalamnya disinari dengan menggunakan sinar UV, setelah sebelumnya
dilakukan tahap elektroforesis. Hasil dari isolasi DNA yang terlihat pada
elektroforesis hanya 3 dikarenakan sampel yang lain kemungkinan bear DNAnya
sudah ikut terbuang ketika memasuki tahap pemurnian. Jadi dalam melakukan
praktikum ini kita sebagai praktikan juga harus selalu berhati-hati dalam
mengerjakan atau melakukan suatu tahapan agar tidak terjadi kesalahan yng sama.

H. DAFTAR PUSTAKA

Biosciences, Amersham. 1999. Protein Electrophoresis. Amersham Biosciences :


USA.
Birren, B., E. Lai. 1993. Pulsed field ge electrophoresis: a practical guide.
Academic Press, Inc., San Diego.
Boffey, S. A. (1984). Isolation of high molecular weight DNA, in Methods in
Molecular Biology, vol. 2: Nucleic Acids (Walker, J. M., ed.), Humana,
Totowa, NJ.
Campbell, N.A., J. B. Reece & L. G. Mitchell. 2002. BIOLOGI. Ed ke-5. Erlangga
: Jakarta.
Davis, L., M. Kuehl, & J. Battey. 1994. Basic methods: Molecular biology 2nd ed.
Appleton & Lange, Norwola.
Fairbanks, D.J., W.R. Andersen. 1999. Genetics: The continuity of life.
Brooks/Cole Publishing Company, New York.
Gardner, E.J., M.J. Simmons, & D.P Snustad. 1991. Principles of genetics 8th ed.
John Wiley & Sons Inc., New York.
Jean, Francois Giot. 2010. Agarose Gel Electrophoresis – Aplications in Clinical
Chemistry. Journal of Medical Biochemistry 2010; 29 (1).
Klug, W.S., M.R. Cummings. 1994. Concept of genetics 4th ed. Merrill Publishing
Co. : Columbus, Ohio.
Lee, S.V., Bahaman, A.R. 2010. Modified gel preparation for distinct DNA
fragment analysis in agarose gel electrophoresis. Tropical Biomedicine 27(2):
351-354 (2010).
Lisdiyanti. 1997. Polymerase Chain Reaction: Cara Mudah Memperbanyak DNA.
Warta Biotek : Bogor.
Magdeldin, Sameh. 2012. Gel Electrophoresis - Principles and Basics. InTech
Publisher : Rijeka, Croatia.
Martin, R. 1996. Gel electrophoresis: Nucleid acids. Bros Scientific Publishers
Ltd., Oxford.
Russell, P.J. 1994. Fundamentals of genetics. Harper Collins College Publishers,
New York.
Tarigan, Simson. 2011. Penggunaan Polymerase Chain Reaction Enzyme Linked
Oligonucelotide Sorbent Assay (PCR-ELOSA) untuk Deteksi Agen
Penyakit. WARTAZOA Vol. 21, No.1, Th.2011.
Wolfe, S. L. 1995. Introduction to cell and molecular biology. Wardworth
Publishing Company, Belmont.