Food Analysis

Efendi Oulan Gustav Hakim Nata Buana, S.TP. M.Eng.

Aprilia Fitriani, S.TP., M.Sc.

Analisis Pangan 2017/2018 1

Analisis Pangan 2017/2018 2
 Definisi Antioksidan?

1.Substansi yang dalam konsentrasi rendah

dapat digunakan untuk melindungi substrat
yang mudah teroksidasi, secara signifikan
dapat menunda atau menghambat reaksi
oksidasi pada substrat tersebut.

2.Antioksidan merupakan senyawa yang

dapat berinteraksi dengan radikal bebas
serta mampu memutus reaksi oksidasi
berantai, sehingga dapat mencegah
kerusakan molekul-molekul penting
Analisis Pangan 2017/2018 3
 Antioxidant

Berdasarkan • Enzimatik
perannya • Non enzimatik

Berdasarkan • Natural
komponennya • Synthetic

Berdasarkan • Endogenous
sumbernya • exogenous

Analisis Pangan 2017/2018 4

Analisis Pangan 2017/2018 5
Mekanisme Antioksidan dalam
Mencegah Reaksi Oksidasi
Mencari senyawa yang dapat menginisiasi
terjadinya reoksidasi

Melapisi ion logam sebagai prooksidan

(mencegah munculnya senyawa reaktif)

Mencegah terbentuknya peroksida dengan

menangkap *O2-

Memecah rantai reaksi autooksidasi

Mengurangi konsentrasi penggunaan O2

Analisis Pangan 2017/2018 6

Mekanisme Determinasi
Antioksidan
• Kemampuan antioksidan untuk
mengkelat radikal bebas

HAT • Reaksi antara atom H dari

komponen fenolik untuk
menyeimbangkan radikal
peroksil (ROO*)

• Kemampuan antioksidan dalam

mereduksi oksidan.

SET

Analisis Pangan 2017/2018 7

 Metode Determinasi
Antioksidan
• Orac (Oxygen Radical Absorbance Capacity)
• LPIC (Lipid Peroxidation Inhibition

HAT
Capacity)
• TRAP (Total Radical Trapping Antioxidant
Parameter)
• IOC (Inhibited Oxygen Uptake)
• ABTS radical scavenging

• TEAC (Trolox Equivalent Antioxidant

Capacity)
• FRAP (Ferric Reducing Antioxidant Power)

SET • DPPH Free Radical Scavenging

• Copper (II) Reduction Capacity

Analisis Pangan 2017/2018 8

Metode Determinasi
Antioksidan

Analisis Pangan 2017/2018 9

Metode Determinasi
Antioksidan

Analisis Pangan 2017/2018 10

Metode Determinasi
Antioksidan

Analisis Pangan 2017/2018 11

Metode Determinasi
Antioksidan

Analisis Pangan 2017/2018 12

Faktor yang Mempengaruhi
Pemilihan Metode Analisis
Matriks Sampel

Jenis Antioksidan (Mekanisme)

Nilai BDE dan IP

Ekonomis

Ketersedian bahan dan instrumen

Analisis Pangan 2017/2018 13

Mekanisme Determinasi Antioksidan

Analisis Pangan 2017/2018 14

 Mekanisme Determinasi
Antioksidan
HAT

•Berdasarkan pada nilai BDE (Bond Dissociation Enthalpy)

•simplified model of R-tocopherol
(6-hydroxy-2,2,5,7,8-pentamethylchroman (HPMC)

Analisis Pangan 2017/2018 15

 Mekanisme Determinasi
Antioksidan
ET

•Berdasarkan pada nilai IP (Ionization Potensoal)

Analisis Pangan 2017/2018 16

 Preparasi Sampel
Deproteinated fraction

• 0,5 M asam perklorat

• Centrifus
• Supernatan diambil

Cell cultured dan tissue lysate

• Lisis sel
• Supernatan diambil

Lipophilic fraction

• Dilarutkan ke dalam sistem solvent

• 100% acetone
• 7% betacyclodextrin & 50% acetone

Plasma dan serum

• Sentrifus
• Diambil plasma / serum
• Dilarutkan sebelum analisis

Analisis Pangan 2017/2018 17

 Preparasi Sampel
Urin

• Langsung digunakan
• Dilarutkan saat akan analisis

Sampel padat

• Extraction sample
• Dilarutkan saat akan analisis

Sampel cair

• Hilangkan pengotor
• Dapat langsung dianalisis

Analisis Pangan 2017/2018 18

ORAC (Oxygen Radical Absorbance
Capacity)

Metode pengukuran kapasitas antioksidan pada sampel biologis

secara in vitro

• Prinsip: Mengukur aktivitas antioksidan dalam

menghambat radikal peroksil yang diinduksi dengan 2,2’-
azobis-(2-amidino-propane) dihydrochloride (AAPH), pada
37 oC.
• Probe fluorosence digunakan untuk bereaksi dengan
AAPH.
• Hilangnya perpendaran digunakan sebagai indikator reaksi
radikal peroksil.
• Aktivitas antioksidan dilihat dari kemampuannya
mempertahankan perpendaran yang dihasilkan.
Analisis Pangan 2017/2018 19
ORAC (Oxygen Radical Absorbance
Capacity)

• Senyawa radikal peroksil yang direaksikan dengan

larutan cair berasal dari 2,2`-azobis-2-metil-
propanimidamida (AAPH).

• Radikal peroksil bereaksi dengan indikator

fluorescent untuk membentuk produk non-fluorescent.

• Antioksidan akan bereaksi dengan radikal peroksil

dan menghambat degradasi pendaran zat warna

Analisis Pangan 2017/2018 20

ORAC (Oxygen Radical Absorbance
Capacity)

• Trolox equivalent digunakan sebagai standar

kalibrasi karena trolox dapat menghambat
radikal peroksil yang dijadikan sebagai bahan
uji dalam metode ORAC
• Umumnya trolox yang digunakan merupakan
analog vit. E yang larut air.
• Nilai total ORAC dinyatakan sebagai jumlah
dari fraksi antioksidan larut lipid dan larut air
sebagai TE/100 g sampel

Analisis Pangan 2017/2018 21

 Kekurangan ORAC
• Reaksi ORAC sensitif terhadap suhu, kontrol
suhu di seluruh plat sangat penting.
• Perbedaan suhu yang kecil pada bagian luar
microplate dapat menurunkan reproduktifitas
dari pengujian
• Fluoresescent markers (penanda) bersifat sensitif
dan hanya dapat dideteksi dengan fluorometer
(tidak umum tersedia di laboratorium analisis)
• Waktu analisis tergolong lama (± 1 jam)
• Analisis hanya dilakukan secara in vitro
sehingga tidak mencerminkan efek biologis yang
sesungguhnya dari aktivitas antioksidan dalam
tubuh
Analisis Pangan 2017/2018 22
 Kekurangan ORAC
• Nilai ORAC dipengaruhi oleh unit yang
digunakan dan jenis pangan yang dibandingkan
dan tidak lagi dianggap relevan oleh EFSA dan
USDA
• Pengukuran hanya dilakukan untuk aktivitas
antioksidan terhadap radikal tertentu, terutama
peroksil, namun pembentukannya belum pernah
dibuktikan
• Sifat reaksi yang menyebabkan kerusakan tidak
dikarakterisasikan
• Tidak ada bukti yang menunjukkan reaksi
melibatkan radikal bebas

Analisis Pangan 2017/2018 23

 Kelebihan ORAC

• Metode otomatis, efisien, dan akurat

• Dapat mendeteksi antioksidan hidrofobik dan
hidrofilik dengan mengubah sumber radikal dan
pelarut
• Menyediakan sumber radikal peroksil yang
terkontrol yang menyerupai (memperagakan)
reaksi antioksidan dengan lipid, baik pada
makanan maupun sistem fisiologi
• Dapat digunakan untuk sampel yang memiliki
kapasitas antioksidan, baik dengan maupun tanpa
fase lag

Analisis Pangan 2017/2018 24

 ORAC Assay Kit

Analisis Pangan 2017/2018 25

Perhitungan ORAC

Analisis Pangan 2017/2018 26

Analisis Pangan 2017/2018 27
Analisis Pangan 2017/2018 28
 TRAP
• Total Radical-Trapping Antioxidant Parameter :
pengukuran penggunaan oksigen selama reaksi
oksidasi lipid terkontrol yang diinduksi oleh
hasil dekomposisi AAPH untuk mengukur
aktivitas antioksidan

• Prinsipnya adalah menghilangkan fluorensi R-

phycoerythin yang dilakukan AAPH (2,2’-
Azobis (2-aminidopropana)hidroklorida) yang
berperan sebagai sumber radikal. Proses
penghilangan warna (decolorisasi) menjadikan
pengukur dari aktivitas antioksidan

Analisis Pangan 2017/2018 29

 TRAP
• AAPH  N2+ 2R
.
.
• 2R + 2O  2RO
.
2
• Reaksi antara dekomposisi termal dari AAPH [2,2-
azobis (amidinoprpane) dihydrochloride] dengan
oksigen menghasilkan peroxyl radikal. Pembentukan
peroxyl radikal ditandai dengan sampel akan
berflouresen. Adanya aktivitas antioksidan ditandai
dengan decolorisasi sampel.
• Lag period sebelum peroksidasi dihitung, dan
dikalibrasi dengan Trolox C. Nilai TRAP dinyatakan
sebagai angka mikromolekul dari peroxyl radikal yang
terjebak per liter plasma
Analisis Pangan 2017/2018 30
 Kelebihan TRAP

• Digunakan untuk pengukuran kapasitas antioksidan

secara in vivo dalam serum atau plasma karena
TRAP merupakan pengukuran antioksidan non
enzimatik seperti glutation dan asam askorbat
• Mampu memberikan hasil data yang cukup baik
terhadap antioksidan yang tersusun atas polifenol

Analisis Pangan 2017/2018 31

 Kekurangan TRAP

• Kemampuan elektroda yang tidak stabil seiring

waktu
• Relatif kompleks
• Membutuhkan waktu analisa yang relatif lama

Analisis Pangan 2017/2018 32

 Perhitungan TRAP

• Nilai TRAP diperoleh dari durasi waktu yang

diperlukan sampel (Tsampel) untuk mengurangi
fluorosent yang diproduksi karena adanya
aktivitas antioksidan.
• Digunakan Trolox (0,8 nmol) sebagai inhibitor
referensi.
• Persamaan :
• TRAP = 2 [Trolox]. Tsample/f . Ttrolox
• Dimana, 2 = faktor stoikiometri dari trolox
(jumlah radikal peroksil yang terperangkap
dalam 1 molekul trolox), f = faktor pengenceran.
• Dinyatakan sebagai Trolox eq./ g bahan kering

Analisis Pangan 2017/2018 33

 Aplikasi TRAP

• Sampel hasil in vivo

• Lemak tinggi
• Ekstrak tanaman yang mengandung flavonoid
seperti lidah buaya
• Ekstrak tanaman yang mengandung fenol dan
turunan asam hidroksibenzoat & hidroksikinamik

Analisis Pangan 2017/2018 34

FRAP (Ferric Reducing Antioxidant
Power)
• Prinsip : reduksi analog ferric, kompleks Fe 3+
dengan penambahan Fe (TPTZ)3+ menjadi komplek
Fe2+ yang berwarna biru dan dilakukan absorbansi
pada panjang gelombang 598nm
• Pengujian pada ph 3.6 untuk menjaga kestabilan Fe
yang digunakan selama analisa
• Jenis pengujian yang hampir sama dapat
menggunakan TEAC untuk kondisi analisi dengan
pH netral
• Fe (TPTZ)3+ (ferric 2,4,6-tripyridyl-s-triazine)
ditambahkan sebagai reducing agent dan dapat
memberikan warna pada sampel
Analisis Pangan 2017/2018 35
FRAP (Ferric Reducing Antioxidant
Power)

Analisis Pangan 2017/2018 36

FRAP (Ferric Reducing Antioxidant
Power)

• Fe (TPTZ)3+ ditambahkan dalam sampel untuk

menginduksi terjadinya proses oksidasi.
• Selama proses oksidasi, FE 3+ akan tereduksi
menjadi Fe 2+
• Total aktivitas antioksidan diukur dari ketahanan
perubahan warna biru. Semakin biru sampel yang
dihasilkan maka aktivitas antioksidan didalam
sampel semakin kecil

Analisis Pangan 2017/2018 37

 Kelebihan FRAP

• Analisis berjalan cepat sekitar 4-6 menit

• Tidak terlalu banyak membutuhkan instrumen
untuk analisis
• Dapat dilakukan secara otomatis, semiotomatis
atau manual

Analisis Pangan 2017/2018 38

 Kekurangan FRAP

• Tidak dapat mengukur antioksidan yang memiliki

reaksi transfer hidrogen seperti golongan protein
dan thiol, contohnya glutation
• Keakuratan hasil dapat bergantung dengan lama
waktu analisa, contoh : jenis senyawa fenol
hasilnya bagus jika waktu analisa dilakukan
sekitar 4 menit, dan jenis senyawa polifenol
(caffeic acid, tannic acid, ferulic acid, ascorbic
acid, and quercetin) membutuhkan waktu yang
lebih lama, sekitar 30 menit.

Analisis Pangan 2017/2018 39

 Perhitungan FRAP

Nilai FRAP sampel diperoleh dengan

memasukkan nilai absorbansi sampel pada
persamaan yang diperoleh dari kurva standart
(TROLOX), sehingga dinyatakan sebagai μmol
ekuivalen troloks/g ekstrak.

Analisis Pangan 2017/2018 40

 Aplikasi FRAP

• Plasma darah
• Urin
• Ekstrak tumbuhan dalam bentuk cair
• Sel / tissue

Analisis Pangan 2017/2018 41

 DPPH

• Prinsip : mengukur kemampuan

antioksidan dalam mereduksi senyawa
radikal DPPH (2,2-Diphenyl-1-
picrylhydrazyl) yang ditandai dengan
decolorisasi sampel dari warna ungu
menjadi kuning/putih, dan dilakukan
absorbansi pada panjang gelombang 515
nm.

Analisis Pangan 2017/2018 42

 DPPH-Reaksi

Analisis Pangan 2017/2018 43

 DPPH-Mekanisme

• DPPH merupakan radikal yang akan

bereaksi dengan antioksidan pada sampel.
• Yang diukur dari analisis DPPH adalah
kadar fenolik pada sampel.
• Perubahan warna: ungu → putih/kuning
pucat
• Standar yang digunakan: asam askorbat/
alfa-tokoferol (digunakan karena
antioksidan ini sudah diketahui dengan
baik (positive-control)

Analisis Pangan 2017/2018 44

 IC50 pada Uji DPPH
• IC50 merupakan nilai konsentrasi antioksidan
(mg/mL) yang mampu menghambat 50%
aktivitas radikal bebas dalam hal ini DPPH.
• Nilai IC50 dari pengujian dengan sampel dapat
dibandingkan dengan nilai IC50 dari antioksidan
standar.
• %IC = (Absorbansi larutan kontrol - Absorbansi
larutan uji) / Aborbansi larutan kontrol x 100%
• IC50 diperoleh dari persamaan regresi linear
antara %IC (Y) dengan konsentrasi (X)
• Semakin kecil nilai IC50 maka menandakan
semakin aktif fraksi uji tersebut berperan sebagai
penangkap senyawa radikal DPPH.

Analisis Pangan 2017/2018 45

 Aplikasi DPPH

• Makanan dalam bentuk padat maupun cair.

• Jus buah-buahan dan sayuran (Sendra et.al. 2006)
• Gandum
• Rempah
• Minyak nabati
• Wine
• Cocok untuk uji antioksidan pada sistein,
glutathione, asam askorbat, tokoferol, senyawa
aromatik polihidroksil.

Analisis Pangan 2017/2018 46

 Kelebihan DPPH

• Sensitif  Pengujian tidak membutuhkan

sampel dengan jumlah yang banyak (± 4,5 ml)
• Cepat dan sederhana  Prosedur kerjanya
hanya memerlukan pengukuran absorbansi
dengan spektrofotometri. Waktu pengujian
berkisar antara 5-10 menit.
• Murah  Alat yang digunakan mudah didapat
dan murah, cukup dengan menggunakan kuvet
plastik.

Analisis Pangan 2017/2018 47

 Kelemahan DPPH

• Sensitif terhadap cahaya. Sehingga absorbansi

dapat menurun apabila terkena cahaya.
• Sensitif terhadap oksigen dan tipe pelarut.
• Absorbansi terpengaruh pH.
• DPPH bukan satu-satunya zat yang dapat
diabsorbansi pada 517 nm.
• Tidak dapat digunakan untuk mengukur aktivitas
antioksidan dari plasma karena protein dapat
mengalami pengendapan.
• Hasil yang didapatkan kurang menggambarkan
aktivitas antioksidan karena yang diukur hanya
kadar fenolik pada sampel.

Analisis Pangan 2017/2018 48