VALIDASI METODE ANALISA

1. Definisi
Validasi metode analisis adalah suatu tindakan penilaian terhadap parameter tertentu
berdasarkan percobaan laboratorium, untuk membuktikan bahwa parameter tersebut memenuhi
persyaratan untuk penggunaannya (Harmita, 2004). Validasi merupakan suatu proses evaluasi
kecermatan dan keseksamaan yang dihasilkan oleh suatu prosedur dengan nilai yang dapat
diterima. Validasi memastikan bahwa suatu prosedur tertulis memiliki detail yang cukup jelas.
Definisi validasi:
a. Menurut SK Menkes RI No.43/MENKES/SK/1998 tentang CPOB adalah tindakan
pembuktian dengan cara yang sesuai bahwa bahan, prosedur, kegiatan, sistem, perlengkapan
atau mekanisme dalam produksi dan pengawasan senantiasa mencapai hasil yang
diinginkan.
b. Menurut ISO (International Standarts Organization) 17025 validasi adalah konfirmasi
dengan pemeriksaan dan penyediaan bukti obyektif bahwa persyaratan tertentu untuk suatu
maksud khusus yang terpenuhi.
c. Menurut Quality Assurance Standarts for Forensic DNA Testing Laboratories, validasi
adalah proses dimana prosedur dievaluasi untuk menentukan kemanjuran dan keandalan
untuk analisis, untuk menunjukkan metode tersebut cocok untuk tujuan yang dimaksudkan.
d. Menurut USP, validasi metode fdilakukan untuk menjamin bahwa metode analisis bersifat
akurat, spesifik, reprodusible dan tahan pada kisaran analitik yang akan dianalisis.
Istilah validasi pertama kali dicetuskan oleh Dr. Bernard T. Loftus, Direktur Food and
Drug Administration (FDA) Amerika Serikat pada akhir tahun 1970-an, sebagai bagian penting
dari upaya untuk meningkatkan mutu produk industri farmasi. Hal ini dilatar belakangi oleh
berbagai masalah mutu yang timbul pada saat itu yang mana masalah-masalah tersebut tidak
terdeteksi dari pengujian rutin yang dilaksanakan oleh industri farmasi yang bersangkutan.
Biasanya validasi digunakan untuk metode analisa yang baru dibuat dan dikembangkan.
Sedangkan untuk metode yang memang telah tersedia dan baku (misal AOAC,ASTM) namun
metode tersebut baru pertama kali akan digunakan di laboratorium tertentu, biasanya tidak perlu
dilakukan validasi namun hanya verifikasi. Verifikasi adalah konfirmasi ulang dengan cara

1
 2

menguji suatu metode dengan melengkapi bukti-bukti yang objektif dan sudah memenuhi
persyaratan.
2. Pentingnya Validasi
Validasi metode sangat diperlukan karena beberapa alasan yaitu validasi metode
merupakan elemen penting dari kontrol kualitas, validasi membantu memberikan jaminan bahwa
pengukuran akan dapat diandalkan. Dalam beberapa bidang, validasi metode adalah persyaratan
peraturan.
3. Tujuan
Adapun tujuan validasi metode analisi adalah sebagai berikut:
1. Validasi metode analisis bertujuan untuk memastikan dan mengonfirmasikan bahwa
metode analisis tersebut sudah sesuai untuk peruntukannya.
2. Untuk menghasilkan hasil analisis yang paling baik.
4. Proses validasi
Proses validasi dilakukan dengan 4 langkah:
1. Validasi perangkat lunak (software validation)
2. Validasi perangkat keras/ instrumen (instrumen/ hardware validation)
3. Validasi metode
4. Kesesuaian system (system suitability)
 3

Parameter Validasi

Menurut USP beberapa langkah dalam validasi metode analisis sebagai berikut:
1. Akurasi (ketepatan)
2. Presisi
3. Selektifitas (spesifisitas)
4. Linearitas dan rentang
5. Batas deteksi dan batas kuantitasi
6. Ketangguhan metode
7. Kekuatan metode
 4

PRESISI (KESEKSAMAAN)
1. Definisi
Keseksamaan adalah ukuran yang menunjukkan derajat kesesuaian antara hasil uji
individual, diukur melalu penyebaran hasil individual dari rata-rata jika prosedur diterapkan
secara berulang pada sampel-sampel yang diambil dari campuran yang homogeny (Harmita,
2004). Keseksamaan diukur sebagai simpangan baku atau simpangan baku relatif (koefisien
variasi). Keseksamaan dapat dinyatakan sebagai keterulangan (repeatability) atau ketertiruan
(reproducibility).
Merupakan kemampuan suatu metode analisis untuk menunjukkan kedekatan dari suatu
seri pengukuran yang diperoleh dari sampel yang homogen.

 Terdapat 3 kategori pengujian presisi, yaitu :

1. Keterulangan (repeatability), dinilai dengan menggunakan minimum 9 penentuan
dalam rentang penggunaan metode analisis tersebut (misalnya 3 konsentrasi/3
replikasi).
2. Presisi Antara, yaitu perbedaan antar operator/analis dengan sumber reagensia dan
hari yang berbeda.
3. Reprodusibilitas, dengan menggunakan beberapa laboratorium untuk validasi
metode analisis, agar diketahui pengaruh lingkungan yang berbeda terhadap
kinerja metode analisis.

 5

Presisi dinyatakan dalam bentuk RSD (relative standart deviation) atau SRB (sebaran
baku relatif) .

Persyaratan RSD sebagai berikut :

Reapitibility (keterulangan) adalah keseksamaan metode jika dilakukan berulang kali oleh
analis yang sama pada kondisi sama dalam interval waktu yang pendek. Repeatibility dinilai
melalui pelaksanaan penetapan terpisah lengkap terhadap sampel-sampel identik yang terpisah
lengkap terhadap sampel-sampel identik yang terpisah dari batch yang sama, jadi memberikan
ukuran keseksamaan pada kondisi yang normal.
Reproducibility (ketertiruan) adalah keseksamaan metode jika dikerjakan pada kondisi
yang berbeda. Biasanya analisis dilakukan pada laboratorium-laboratorium yang berbeda
menggunakan peralatan, pereaksi, pelarut dan analis yang berbeda pula. Analisis dilakukan
terhadap sampel-sampel yang diduga identik yang dicuplik dari batch yang sama.
Reproducibility dapat juga dilakukan dalam laboratorium yang sama dengan menggunakan
peralatan, pereaksi dan analis yang berbeda.
Kesesuaian dengan ICH, presisi harus dilakukan pada 3 tingkatan yang berbeda yaitu:
a. Keterulangan yaitu ketepatan (precision) pada kondisi percobaan yang sama (berulang)
baik orangnya, peralatannya, tempatnya maupun waktunya.
b. Presisi antara yaitu ketepatan (precision) pada kondisi percobaan yang berbeda, baik
orangnya, peralatannya, tempatnya, maupun waktunya.
c. Ketertiruan merujuk pada hasil-hasil dari laboratorium yang lain. (Gandjar dan
Rohman, 2009)
 6

Pengujian presisi pada saat awal validasi metode seringkali hanya menggunakan 2
parameter pertama yaitu keterulangan dan presisi antara. Reprodusibilitas biasanya dilakukan
ketika akan melakukan uj banding antar laboratorium (Gandjar dan Rohman, 2009).
Menurut Harmita (2009), keterulangan adalah keseksamaan metode jika dilakukan
berulang kali oleh analis yang sama pada kondisi sama dan dalam interval waktu yang pendek.
Keterulangan dinilai melalui pelaksanaan penetapan terpisah lenglap terhadap sampel-sampel
identik yang terpisah dari batch yang sama, jadi memberikan ukuran keseksamaan pada kondisi
yang normal. Sedangkan yang dimaksud ketertiruan adalah keseksamaan metode jika dikerjakan
pada kondisi yang berbeda. Biasanya analisis dilakukan dalam laboratorium-laboratorium yang
berbeda menggunakan peralatn, pereaksi, pelarut dan analis yang berbeda pula. Analis dilakukan
terhadap sampel-sampel yang diduga identik yang dicuplik dari batch yang sama. Kriteria
seksama diberikan jika metode meberikan simpangan baku relatif atau koefisien variasi 2% atau
kurang. Akan tetapi kriteria ini sangat fleksibel tergantung pada konsentrasi analit yang
diperiksa, jumlah sampel, dan kondisi laboratorium. Ditemukan bahwa koefisien variasi eningkat
dengan menurunnya konsentrasi analit. Pada kadar 1% atau lebih, standart deviasi relatif antara
laboratorium adalah sekitar 2,5% ada pada satu per seribu adalah %%. Pada kadar satu per sejuta
(ppm) RSDnya adalah 16%, dan pada kadar part per billion (ppb) adalah 32%. Pada metode yang
snagat kritis, secara umum diterima bahwa RSD harus lebih dari 2% (Harmita, 2004).
Untuk menentukan metode ketertiruan sebagai berikut:

RSD < 2 (1-0,5 log c)

untuk metode keterulangan sebagai berikut:

RSD < 2 (1-0,5 log c) x 0,67

c = konsentrasi analit sebagai fraksi desimal (contoh: 0,1% = 0,001)

(Harmita, 2004).

Keseksamaan dapat dihitung dengan cara sebagai berikut:

 7

1. Hasil analisis adalah x1, x2, x3, x4,.....................xnmaka simpangan bakunya adalah:

2. Simpangan baku relatif atau koefisisen variasi (KV) adalah:

Percobaan seksama dilakukan terhadap palig sedikit enam replika sample yang diambil
dari campuran sampel dengan matriks yang homogen. Sebaiknya keseksamaan ditentukan
terhadap sampel sebenarnya yaitu berupa campuran dengan bahan pembawa sediaan farmasi
(plasebo) untuk melihat pengaruh matriks pembawa tterhadap keseksamaan ini. Demikian juga
harus disiapkan sampel untuk menganalisis pengaruh pengotor dan hasil degradasi terhadap
keseksamaan ini (Harmita, 2004).
Menurut American Pre-veterinary medical association (APVMA) (2004) tingkat presisi
yang sebaiknya dipenuhi berdasarkan konsentrasi analit yang dianalisis dapat dilihat pada tabel
dibawah ini:
Jumlah komponen terukur dalam sampel Tingkat presisi (y)
X ≥ 10,00 % y ≤ 2%
1,00% ≤ x ≤ 10,00 % y ≤ 2%
0,10% ≤ x ≤ 1,00% y ≤ 10%
X ≤ 0,10% y ≤ 20%

2. Tujuan
Uji presisi dilakukan untuk mengetahui kedekatan atau kesesuaian antara hasil uji yang
satu dengan yang lainnya pada serangkaian pengujian presisi hasil pengkuran digambarkan
dalam bentuk persentase Relative Standart Deviation (%RSD).