LAPORAN RESMI

PRAKTIKUM MIKROBIOLOGI FARMASI

PRAKTIKUM I : TEKNIK PENGECATAN

Disusun oleh:
1. Cintya Ekaputri 18/423510/FA/11643
2. Dhiya Ulhaq S. 18/423511/FA/11644
3. Dian Putri Wulansari 18/423513/FA/11646
4. Dita Listya C. 18/423514/FA/11647
5. Elisabet Guwanto 18/423516/FA/11649
6. Elisabetha Ela A. 18/423517/FA/11650
7. Evia Farrah Affifa 18/423518/FA/11651
8. Farah Raisyaputri A. 18/423519/FA/11652
Kelas/Golongan : A/II
Tanggal Praktikum : 27 September 2018
Dosen Jaga :
Asisten Jaga :

Dosen Koreksi :

LABORATORIUM MIKROBIOLOGI FARMASI

BAGIAN BIOLOGI FARMASI
FAKULTAS FARMASI
UNIVERSITAS GADJAH MADA
YOGYAKARTA
2018
I. TUJUAN
Menentukan jenis bakteri uji berdasarkan pewarnaan Gram: Gram positif atau Gram
negatif bakteri.

II. DASAR TEORI

2.1 Pewarnaan Gram
Pewarnaan gram atau metode gram adalah suatu metode empiris untuk
membedakan spesies bakteri mejadi dua kelompok besar, yaitu gram positif dan gram
negatif, berdasarkan sifat kimia dan fisik dinding sel mereka. Metode tersebut diberi
nama berdasarkan penemunya, ilmuwan Denmark Hans Christian Gram (1853-1938)
yang mengembangkan teknik tersebut pada tahun 1884 untuk membedakan antara
Pneumococcus dan bakteri Klebsiella Pneumonia (Karmana,2008).
Pewarnaan gram dibagi menjadi dua hasil, yaitu gram positif dan gram negatif,
tergantung dari reaksi dinding sel terhadap tinta safranin atau Kristal violet. Beberapa
bakteri tidak terwarnai dengan pewarnaan gram karena dinding selnya mengandung
banyak lipid, sehingga digunakan pewarnaan tahan asam untuk mengidentifikasinya.
Pada pewarnaan tersebut, sel bakteri akan berwarna merah tetapi sel jaringan akan
berwarna hijau (James, 2002).

Terdapat tiga tipe pengecatan bakteri yaitu :

1. Pengecatan sederhana, adalah pengecatan sel-sel mikrobia dengan satu

tahap pengecatan saja. Pengecatan ini dapat mewarnain sel atau latar belakang
sehingga memungkinkan untuk mengamati bentuk sel dan susunan sel.
Biasanya suatu bahan kimia ditambahkan ke dalam larutan pewarna untuk
mengintensifkan warna dengan cara meningkatkan afinitas pewarna pada
spesimen mikroorganisme. Bahan kimia tersebut adalah mordant atau
penajam. Contoh pewarna sederhana adalah carbol fuchsin, methylen blue,
gentian violet.
2. Pengecatan differensial/majemuk, merupakan pengecatan sel mikrobia yang
menggunakan kombinasi pewarna. Pengecatan ini dapat digunakan untuk
identifikasi karena masing-masing mirobia memiliki reaksi tertentu. Misal:
pengecatan gram, ZN/Acid fast.
3. Pengecatan khusus, merupakan pengecatan yang hanya mewarnai satu
bagian dari sel sehingga dapat digunakan untuk membedakan bagian yang satu
dengan bagian lain bakteri. Contoh: pengecatan Gram untuk melihat flagella
dan pengecatan Burri untuk melihat kapsula (Pratiwi, 2005).
 Berbagai macam tipe morfologi bakteri (kokus, basil, spirilum, dan sebagainya)
dapat dibedakan dengan menggunakan pewarna sederhana. Istilah ”pewarna
sederhana” dapat diartikan dalam mewarnai sel-sel bakteri hanya digunakan satu
macam zat warna saja (Gupte, 1990). Kebanyakan bakteri mudah bereaksi dengan
pewarna-pewarna sederhana karena sitoplasmanya bersifat basofilik (suka akan basa)
sedangkan zat-zat warna yang digunakan untuk pewarnaan sederhana umumnya
bersifat alkalin (komponen kromoforiknya bermuatan positif). Faktor-faktor yang
mempengaruhi pewarnaan bakteri yaitu fiksasi, peluntur warna , substrat, intensifikasi
pewarnaan dan penggunaan zat warna penutup. Suatu preparat yang sudah meresap
suatu zat warna, kemudian dicuci dengan asam encer maka semua zat warna terhapus.
sebaliknya terdapat juga preparat yang tahan terhadap asam encer. Bakteri-bakteri
seperti ini dinamakan bakteri tahan asam, dan hal ini merupakan ciri yang khas bagi
suatu spesies (Dwidjoseputro, 1994).

Zat warna yang digunakan dalam pewarnaan bersifat basa dan asam. Pada zat
warna basa, bagian yang berperan dalam memberikan warna disebut disebut kromofor
dan memiliki muatan positif. Sebaliknya, pada zat warna asam bagian yang berperan
memberikan zat warna mempunyai muatan negatif zat warna basa lebih banyak
digunakan karena muatan negatif banyak ditemukan di dinding sel, membran sel dan
sitoplasma, sewaktu proses pewarnaan muatan positif pada zat warna basa akan
berkaitan dengan muatan negatif dalam sel, sehingga mikroorganisme lebih jelas
terlihat (Dwidjoseputro, 2005). Zat warna asam yang bermuatan negatif lazimnya
tidak digunakan untuk mewarnai mikroorganisme, namun biasanya dimanfaatkan
untuk mewarnai latar belakang sediaan pewarnaan. Zat warna asam yang bermuatan
negatif ini tidak dapat berkaitan dengan muatan negatif yang terdapat pada struktur
sel. Kadangkala zat warna negatif digunakan untuk mewarnai bagian sel yang
bermuatan positif, perlu diperhatikan bahwa muatan dan daya ikat zat warna terhadap
struktur sel dapat berubah bergantung pada pH sekitarnya sewaktu proses pewarnaan
(Dwidjoseputro, 2005).

Prinsip pewarnaan Gram adalah kemampuan dinding sel mempertahankan zat

warna dasar (Kristal violet) setelah pencucian alkohol 96%. Bakteri Gram positif
terlihat berwarna ungu karena dinding selnya mengikat Kristal violet lebih kuat,
sedangkan sel Gram negatif mengandung lebih banyak lipid sehingga pori-pori mudah
membesar dan Kristal violet mudah larut saat pencucian alkohol (Fardiaz, 1989).
Pewarnaan gram dilakukan bertujuan sama dengan uji gram yaitu untuk
membedakan bakteri apakah gram positif atau gram negatif, bakteri dicampur dengan
tetesan air steril pada gelas objek, kemudian disebarkan ditengah gelas objek sehingga
membentuk lapisan tipis dan difiksasi. Dengan kristal violet, olesan bakteri digenangi
selama dua menit, lalu dicuci dengan air mengalir, dan dikering anginkan. Diberi
yodium selama dua menit, dicuci dengan air mengalir dan dikeringanginkan.
Selanjutnya diberi larutan pemucat yaitu alkohol 96%, tetes demi tetes sampai zat
warna ungu tidak terlihat lagi, lalu dicuci pada air mengalir dan dikering anginkan.
Kemudian digenangi lagi dengan safranin selama 30 detik, lalu dicuci dan dibiarkan
kering di udara (Pelczar, 2007).
Warna merah pada olesan bakteri menujukkan bakteri gram negatif. Karena
dinding peptidoglikannya tipis dan lapisan lipidnya tebal, warna akan hilang ketika
diberi alkohol. Hal ini disebabkan karena alkohol memperbesar permeabilitas bakteri
gram negatif dan memudahkan senyawa Kristal Violet-Iodin untuk keluar dari sel.
Ketika diwarnai lagi dengan fuschin, bakteri gram negatif menjadi berwarna merah
muda. Jika warna ungu, menunjukkan bakteri gram positif. Bakteri gram positif
memiliki lapisan peptidoglikan yang tebal dan ketika direaksikan dengan alkohol,
dinding sel yang tebal ini terdehidrasi sehinga pori-porinya tertutup dan warna tidak
bisa keluar dari sel dan etanol tidak dapat menghilangkan molekul Kristal Violet-
Iodin yang terikat pada dinding peptidoglikan (Pelczar, 2007).
Pewarnaan Gram (Gram Stain) dapat digunakan untuk memisahkan anggota-
anggota dominan bakteria ke dalam dua kelompok berdasarkan perbedaan dinding
selnya. Bakteri gram positif memiliki dinding sel yang lebih sederhana, dengan
jumlah peptidoglikan yang relatif banyak. Dinding sel bakteri gram-negatif memiliki
peptidoglikan yang lebih sedikit dan secara struktural lebih kompleks. Membran
bagian luar pada dinding sel gram-negatif mengandung lipopolisakarida, yaitu
karbohidrat yang terikat dengan lipid (Campbell, 2003).

Perbedaan lainnya antara bakteri gram-positif dan bakteri gram-negatif adalah:

Gram positif Gram negatif

- Dinding sel tebal, berlapis tunggal
(mono)
- Kandungan lipid dalam sel rendah
- Peptidoglikan sebagai lapisan
tunggal
- Dinding sel 90% berat kering
- Sensitif terhadap penisilin
- Racun eksotosin
- Isoelektrik poin 2-3
- Terdiri dari Mg ribonukleat
- Nutrisi lebih rumit
- Umumnya bentuk batang dan bulat
- Dinding sel tipis, berlapis tiga
(umbi)
- Kandungan lipid tinggi
- Peptidoglikan sebagai lapis dalam
- Dinding sel 10% berat kering
- Sensitif dengan streptomisin
- Racun endotoksin
- Isoelektrik poin pH 4-5
- Tidak terdiri dari Mg ribonukleat
- Nutrisi lebih sederhana
- Umumnya tidak berbentuk batang,
spiral, beberapa coccus
 - Sangat sensitif dengan zat warna, - Kurang sensitif dengan zat warna
misal : kristal violet

Yang termasuk ke dalam bakteri gram positif adalah bakteri yang

mempertahankan warna metil ungu sewaktu proses pengecatan. Bakteri ini tahan
erhadap alkohol (yang merupakan komponen cat Gram C dan cat Gram D) sehingga
tetap mengikat cat Gram A dan cat Gram B. Maka hasil akhir dari pengecatan, bakteri
akan berwarna ungu (Waluyo, 2010).

2.2 Bacillus subtilis

Klasifikasi Bacillus subtilis

Kingdom : Bakteri
Filum : Firmicutes
Kelas : Bacilli
Orde : Bacillales
Famili : Bacillaceae
Genus : Bacillus
Spesies : Bacillus subtilis
Bacillus subtilis adalah bakteri Gram positif yang biasanya ditemukan di dalam
tanah. Bakteri ini tersusun atas peptidoglikan, yang merupakan polimer dari gula dan
asam amino. Peptidoglikan yang ditemukan di bakteri yang dikenal sebagai murein.
Sel membentuk tembok penghalang antara lingkungan dan bakteri sel yang berguna
untuk mempertahankan bentuk sel (Fajriana, 2008).
Bakteri ini mempunyai kemampuan membentuk pertahanan diri yang kuat,
dengan membentuk endospora yang bersifat melindungi sehingga dapat tahan pada
kondisi lingkungan yang ekstrim (Nakano dan Zuber, 1998). Bacillus subtilis tidak
secara langsung termasuk sebagai patogen pada manusia, bagaimanapun Bacillus
subtilis dapat mengkontaminasi makanan tetapi tidak sampai menyebabkan makanan
menjadi beracun (Ryan & Ray, 2004).
Sporanya dapat bertahan hidup pada pemanasan ekstrim yang seringkali
digunakan untuk memasak makanan dan juga mampu membuat produk pangan roti
menjadi busuk atau rusak (Gielen dkk., 2004).

2.3 Escherichia coli

Escherichia coli merupakan bakteri batang gram negatif, tidak berspora, motil
berbentuk flagel peritrik, berdiameter ± 1,1 –1,5 μm x 0,2 –0,6 μm. E. coli dapat
bertahan hidup dimedium sederhana menghasilkan gas dan asam dari glukosa dan
memfermentasi laktosa. Pergerakan bakteri ini motil, tidak motil, dan peritrikus, ada
yang bersifat aerobik dan anaerobik fakultatif (Elfidasari et al, 2011).
 Klasifikasi bakteri Escherichia coli:
Kingdom: Bacteria
Divisi: Proteobacteria
Classis: Gammaproteobacteria
Ordo: Enterobacteriales
Family: Enterobacteriaceae
Genus: Escherichia
Species: Escherichia coli
Bakteri E. coli adalah satu jenis spesies utama bakteri gram negative fakultatif
anaerobic yang mempunyai alat gerak berupa flagel dan tersusun dari sub unit protein
yang disebut flagelin, yang mempunyai berat molekul rendah dengan ukuran diameter
12-18 nm dan dengan panjang 12 nm, kaku dan berdiameter lebih kecil dan tersusun
dari protein, pili dapat berfungsi sebagai jalan pemindahan DNA saat konjugasi.
Selain itu, mempunyai kapsul atau lapisan lendir yang merupakan polisakarida tebal
dan air yang melapisi permukaan luar sel (Ikmalia, 2008).
Bakteri E. coli mempunyai tiga jenis antigen, yaitu antigen O, antigen K dan
atigen H. Antigen-O yang merupakan inti dari lipopolisakarida dan unit-unit
polisakarida, biasnya antigen-O berhubungan dengan penyakit khusus pada manusia,
misalnya tipe spesifik O dari E. coli ditemukan pada diare. Antigen-K yang
merupakan kapsul dari polisakarida, sedangkan antigen-H merupakan antigen flagella
(Wibowo et al, 2008).

2.4 Agrobacterium sp.

Agrobacterium sp adalah suatu jenis bakteri gram negatif yang memiliki
bentuk batang / bacil dan masih memiliki hubungan dengan bakteri-bakteri bintil akar.
Klasifikasi dari Agrobacterium sp :

Kingdom: Bacteria
Filum: Proteobacteria

Kelas: Alpha Proteobacteria

Ordo: Rhizobiales
Famili: Rhizobiaceae
Genus: Agrobacterium
Spesies: Agrobacterium sp.

Agrobacterium dikenal secara alami mempunyai kemampuan transfer DNA

antar kingdom. Pada tanaman, Agrobacterium biasanya digunakan sebagai agen
rekayasa genetik untuk menghasilkan tanaman transgenik. Selain itu Agrobacterium
juga dapat digunakan untuk transformasi gen antar sel hidup, misalnya dari sel
prokariot ke dalam sel fungi atau sel manusia.Kemampuan Agrobacterium melakukan
transformasi genetik ke dalam sel inang telah dipelajari selama beberapa dekade
(Tzfira, 2004).

2. 5 Klebsiella sp.
Klasifikasi bakteri Klebsiella sp.:
Kingdom: Bacteria
Divisi: Proteobacteria
Classis: Gammaproteobacteria
Ordo: Enterobacteriales
Family: Enterobacteriaceae
Genus: Klebsiella
Species: Klebsiella sp.
Klebsiella sp. pertama kali diteliti dan diberi nama oleh bacteriologist Jerman
yang bernama Edwin Jklebs (1834 – 1913). Klebsiella sp. merupakan bakteri gram
negatif dari family Enterobactericeae yang dapat ditemukan di traktus gastrointestinal
dan traktus respiratori. Beberapa species Klebsiella sp. antara lain Klebsiella
pneumonia, Klebsiella oxytoca, Klebsiella ozaenae, dan Klebsiella rhinoscleromatis.
Pada manusia, Klebsiella pneumoniae hidup secara saprofit dalam sistem pernafasan
dan tinja manusia normal sebesar 5%, dengan 1% dapat menyebabkan radang paru-
paru. Berdasarkan kebutuhannya akan oksigen, Klebsiella sp. merupakan bakteri
fakultatif anaerob (Kusuma, 2013)
Klebsiella sp. merupakan kuman berbentuk batang pendek, tidak memiliki
spora, dan tidak memilki flagella. Klebsiella sp. menguraikan laktosa dan membentuk
kapsul baik invivo atau invitro dan koloninya berlendir. Kapsul Klebsiella sp. terdiri
dari antigen O yang merupakan liposakarida yang terdiri atas unit polisakarida yang
berulang. Polisakarida O-spesifik mengandung gula yang unik. Antigen O tahan
terhadap panas dan alcohol dan bisa dideteksi dengan aglutinasi bakteri. Antibodi
terhadap antigen O terutama adalah IgM. Antigen kedua adalah antigen K. Antigen K
ini berada di luar antigen O dan merupakan suatu kapsular polisakarida. Antigen K
dapat mengganggu aglutinasi melalui antiserum O dan berhubungan dengan virulensi.
Kedua antigen ini meningkatkan patogenitas Klebsiella sp.
III. ALAT BAHAN
Alat
1. Gelas preparat
2. Gelas penutup
3. Spidol
4. LAF
5. Alat pemanas/ pengering rambut
6. Mikroskop cahaya

Bahan
1) Biakan murni bakteri : Bacillus subtilis, Escherichia coli, dan 2 jenis
bakteri A (Agrobacterium) dan B (TOLONG ISIIN NAMA
BAKTERINYA)
2) Biakan murni jamur : Aspergillus sp dan Rhizopus sp.
3) Larutan cat Gram
Cat Gram A (Ungu) : 1. Kristal Violet 2gr
2. Alkohol 96% 20 Ml
3. Ammonium oksalat 1% in aqua 80 mL
Cat Gram B (Coklat) : 1. Iodium 1 gr
2. Kalium Iodid (KI) 2 gr
3. Aquadest 800 mL
(Larutan KI dalam air, kemudian ditambahkan
Iodium. Simpan dalam botol warna coklat.)
Cat Gram C (Tidak berwarna) : 1. Aceton 70 mL
2. Alkohol 96% 70 mL
Cat Gram D (Merah) : 1. Safronin 1 gr
2. Alkohol 96% 10 Ml
3. Aquadest 90 Ml
I. CARA KERJA
Dibersihkan gelas benda dan gelas penutup dengan alkohol

Diberi label pada ujung gelas benda dengan nama mikroba yang akan dicat

Dibawah Gelas benda digambar bulatan berdiameter 1 cm dengan spidol

(daerah pengecatan)

Gelas dibalik sehingga gambar bulatannya ada di sisi yang berbeda

 Diletakkan satu tetes aquadest pada permukaan gelas benda di daerah yang
digambar

Diambil sedikit biakan bakteri dengan ose bermata aseptis, dicampur pada
awuadest tadi, diratakan pada seluruh area bulatan

Dikeringanginkan hingga terbentuk noda

Dilewatkan gelas benda pada nyala api beberapa kali (Jangan sampai terkena
apai secara langsung)

Digenangi preparat cat Gram A selama 1-3 menit

Dibbuang cat tanpa dibilas dengan air

Digenangi preparat dengan cat gram B selama 1 menit

Dicuci sisa cat Gram B dengan air yang mengalir, di kering anginkan

Digenangi preparat dengan cara diteteskan pada permukaan noda sampai

warna cat tepat dilunturkan kurang lebih 30 detik

Tutup dengan gelas penutup, amati hasil dibawah mikroskop , Gram positif
berwarna biru ungu, dan gram negatif berwarna merah muda

Catat hasilnya, gambar beberapa sel, tulis perbesarannya.

V. HASIL PENGAMATAN

Hasil pengamatan penulis terdiri atas 3 hasil pengamatan bakteri Bacillus subtilis,
3 hasil pengamatan bakteri A (Agrobacterium), serta 1 hasil pengamatan bakteri
Escherichia coli, dan 1 hasil pengamatan bakteri A (Klebsiella sp.)

5.1 Bakteri Bacillus subtilis

Bacillus subtilis (I)

Bentuk : Batang
Tipe Koloni : Koloni
Warna : Ungu
Gram : Positif (+)
Perbesaran : 10 X 100
Sesuai teori (gram positif, berbentuk batang)
Terlihat 2-3 bakteri dengan bentuk batang di bawah mikroskop dengan jelas

Bacillus subtilis (II)

Bentuk : Batang
Warna : Ungu
Gram : Positif (+)
Perbesaran : 10 X 100
Sesuai teori (gram positif, berbentuk batang)
Bacillus subtilis (III)

Bentuk : Batang (Bacil)

Tipe Koloni : Koloni
Warna : Ungu
Gram : Positif (+)
Perbesaran : 10 X 100
Sesuai teori (gram positif, berbentuk batang)

5.2 Bakteri A (Agrobacterium)

Bakteri A (Agrobacterium) (I)

Tidak teramati oleh mikroskop

Perbesaran 10 X 100

Agrobacterium (II)

Bentuk : Batang
Warna : Merah muda
Gram : Negatif (-)
Perbesaran : 10 X 100
Sesuai teori (gram negatif, berbentuk batang)

Agrobacterium (III)

Tidak ada bakteri Agrobacterium yang teramati oleh mikroskop

Perbesaran 10 X 100

5.3 Bakteri Escherichia coli

Bentuk : Basil / batang

Warna : Merah muda
Jenis : Gram negative
Perbesaran : 10 x 100
Sesuai teori (gram negative, berbentuk batang)

5.4 Bakteri Klebsiella sp.

Bentuk : Basil / batang

Warna : Merah muda
Jenis : Gram negative
Perbesaran : 10 x 100
Sesuai teori (gram negative, berbentuk batang)

VI. PEMBAHASAN

Praktikum ini bertujuan untuk menentukan penggolongan jenis uji bakteri

berdasarkan pewarnaan gram: gram positif atau gram negatif bakteri. Pada praktikum
kali ini, diamati 4 jenis bakteri, yaitu bakteri Bacillus subtilis, Escherichia coli,
bakteri sampel A dan B yang belum diketahui. Pembuatan preparat dan teknik
pengecatan yang dilakukan pada keempat bakteri sama.

Pembuatan preparat dilakukan dalam laminar air flow (LAF) agar media bakteri
tempat pembuatan preparat tetap steril. Sebelumnya, sinar ultraviolet pada LAF
dinyalakan selama 30 menit untuk sterilisasi LAF. Kemudian, kaca preparat tempat
mensuspensikan bakteri digambar lingkaran berdiameter 1 cm dengan spidol. Hal ini
bertujuan supaya pengamatan menjadi lebih fokus dan mudah dilakukan. Memegang
kaca preparat hanya diperbolehkan pada bagian yang agak buram karena apabila
memegang di sembarang tempat, preparat dapat terkontaminasi oleh mikroba yang
berasal dari tangan praktikan. Kemudian, kaca preparat dan tangan praktikan
disemprot dengan menggunakan etanol 70% untuk memperkecil kemungkinan
terjadinya kontaminasi mikroba dari lingkungan. Setelah itu, bakteri diambil dari
media agar menggunakan ose. Sebelumnya, ose dipanaskan pada pembakar spiritus
hingga membara dan berwarna merah. Hal ini bertujuan agar ose steril dan tidak
mengontaminasi bakteri dalam media agar saat dilakukan pengambilan bakteri.
Setelah ose dipanaskan, ose dimasukkan ke dalam tabung reaksi yang berisi media
bakteri dan disentuhkan ke media agar untuk mengambil bakteri.Tabung reaksi yang
berisi media juga dipanaskan mulutnya agar tetap steril. Pemanasan dilakukan dengan
memutar-mutar mulut tabung di atas pembakar spiritus. Pemanasan tidak boleh terlalu
lama dilakukan karena dapat membunuh bakteri. Saat melakukan pengambilan
bakteri, hanya tangan praktikan yang masuk ke dalam LAF untuk menjaga kesterilan
media bakteri. Pengambilan bakteri dilakukan secukupnya karena apabila jumlah
bakteri terlalu banyak, bakteri akan menumpuk dan mempersulit pengamatan.
Kemudian, bakteri disuspensikan di atas kaca preparat yang sudah diberi aquades.
Preparat harus diberi aquades agar kaca objek dapat dapat menempel pada kaca
preparat. Setelah itu, preparat difiksasi hingga kering. Fiksasi dengan panas ini
bertujuan untuk membunuh sel bakteri agar dapat dilakukan pengecatan karena
bakteri yang masih hidup tidak dapat menyerap zat warna cat. Fiksasi juga bertujuan
untuk melekatkan bakteri pada kaca objek sehingga tidak mudah lepas dan siap untuk
dilakukan pengecatan. Bila pemanasan terlalu panas akan menyebabkan munculnya
noda saat pengamatan dibawah mikroskop. Proses fiksasi dirasa cukup jika tangan
praktikan dan kaca preparat mulai terasa panas. Setelah itu, preparat dikeringanginkan
dengan kipas angin hingga benar-benar kering. Setelah sampel sudah siap, selanjutnya
masuk ke proses pewarnaan.
Proses pewarnaan yang dilakukan pertama ialah pewarnaan dengan cat Gram A.
Genangi preparat dengan cat Gram A selama 1-3 menit dengan cara menetesi cat
Gram A keatas preparat menggunakan pipet tetes, dalam praktikum menggunakan
waktu selama 2 menit. Setelah itu dibuang cat tanpa dicuci air, dibuang pada tempat
yang sudah disediakan. Setelah itu dilanjutkan dengan pewarnaan kedua dengan cat
Gram B yang dilakukan dengan menggenangi lagi preparat dengan cat Gram B
selama 1 menit yang dilakukan dengan cara menetesi preparat dengan cat Gram B
dengan pipet tetes. Kemudian, dicuci dengan air mengalir dan dikeringanginkan.
Gram B mengandung Iodium dan merupakan pewarna Modarn, yaitu pewarna yang
berfungsi memfiksasi pewarna primer yang diserap mikroba target. Pemberian iodium
pada pengecatan Gram dimaksudkan untuk memperkuat pengikatan warna primer
(ungu) oleh bakteri (Wahyuningsih, 2008). Setelah itu, preparat dicuci dengan cat
gram C yang berisi alkohol dan aseton dimana cat ini merupakan decolorizing agent
yang akan melunturkan warna. Dinding sel yang lebih tebal pada bakteri gram positif
menyusut oleh perlakuan alkohol dan dehidrasi menyebabkan pori pori dinding sel
tertutup dan mencegah zat warna keluar. Sedangkan bakteri gram negatif memiliki
kandungan lipid tinggi pada dinding sel yang akan larut dalam aseton dan alkohol.
Larutan lipid ini akan memperbesar pori pori dinding sel dan menyebabkan zat warna
keluar. (Waluyo, 2008). Tahap terakhir adalah proses pengecatan dengan cat gram D.
Setelah dikeringkan, diberi tetesan larutan gram D lalu didiamkan selama 2 menit.
Jika sudah, dibilas dengan air dan dikeringkan. Larutan gram D berisikan zat pewarna
lawan yaitu berupa safranin yang berfungsi untuk memberikan warna pink atau merah
muda pada bakteru gram negative sedangkan pada bakteri gram positif tetap berwarna
ungu. Sebelum diamati, kaca preparat ditetesi terlebih dahulu menggunakan minyak
imersi yang berfungsi untuk memperjelas hasil pengamatan (tidak perlu ditutup
dengan cover glass karena akan mengganggu hasil pengamatan). Pengamatan
dilakukan dengan mikroskop cahaya dengan perbesaran 10 x 100.

Bakteri yang pertama kali diamati adalah Bacillus subtilis (I). Menurut teori,
Bacillus subtilis adalah bakteri gram positif yang berbentuk batang. Saat diamati
dengan mikroskop cahaya dengan perbesaran 10 x 100, terlihat bakteri yang
berbentuk batang dan berwarna ungu. Pengamatan dengan perbesaran 10 x 100
menggunakan minyak imersi pada preparat untuk memperjelas pengamatan karena
minyak imersi memiliki indeks refraksi yang lebih tinggi daripada air atau udara.
Hasil ini sesuai dengan teori bahwa Bacillus subtilis adalah bakteri gram positif yang
mampu mempertahankan warna ungunya karena memiliki dinding sel yang
peptidoglikannya tebal dan terdehidrasi sehingga pori-porinya menutup dan zat warna
tidak dapat keluar. Di bawah mikroskop cahaya perbesaran 10 x 100, terlihat 2-3
bakteri dengan jelas di antara zat-zat warna. Jumlah bakteri yang sedikit mungkin
disebabkan oleh kurang menempelnya ose pada media saat mengambil bakteri atau
media agar yang telah lama digunakan dan jumlah bakterinya tinggal sedikit.

Hasil praktikum Bacillus subtilis (II) setelah diamati oleh mikroskop cahaya
dengan perbesaran 10 x 100 ialah terlihat bahwa bakteri Bacillus subtilis memiliki
bentuk batang dengan warna ungu dan merupakan bakteri gram positif. Hasil yang di
dapatkan dalam praktikum ini sesuai dengan literature, dimana dalam literature
menjelaskan bahwa Bacillus subtilis adalah bakteri gram positif yang mampu
mempertahankan warna ungunya karena memiliki dinding sel yang peptidoglikannya
tebal dan terdehidrasi sehingga pori-porinya menutup dan zat warna tidak dapat
keluar. Jumlah bakteri yang tidak terlalu banyak serta letak bakteri dalam hasil
pengamatan tidak terlihat begitu jelas dikarenakan saat pengambilan bakteri dan
peletakan bakteri diatas preparat praktikan tidak melakukannya dengan teliti sehingga
sedikit bakteri yang terdapat dalam preparat serta letak bakteri saling bertumpuk satu
sama lain.

Bacillus subtilis (III) yang diamati dibawah mikroskop cahaya dengan perbesaran
10 x 100 telah sesuai dengan acuan teori / literature yang ada. Bakteri Bacillus subtilis
tampak memiliki bentuk batang / basil dengan menunjukkan warna ungu yang
menandakan bahwa bakteri Bacillus subtilis merupakan baktergi gram positif. Warna
ungu timbul karena bakteri gram positif memiliki dinding sel dengan peptidoglikan
tebal yang menyusut oleh perlakukan alkohol karena terjadi dehidrasi. Akibatnya, pori
pori pada dinding sel menjadi tertutup dan mencegah larutnya kompleks zat ungu
Kristal iodium pada langkah pemucatan. Kenampakan bakteri Bacillus subtilis yang
tidak terlalu banyak dibawah mikroskop diakibatkan karena ketidaktelitian pada saat
pengambilan bakteri dari media biakan bakteri dan peletakan bakteri diatas preparat.
Dengan begitu, proporsi penyebaran bakteri menjadi tidak merata disekitar preparat.

Bakteri selanjutnya yang diamati adalah bakteri A yaitu bakteri Agrobacterium

(I). Menurut teori, Agrobacterium adalah bakteri gram negatif yang memiliki bentuk
batang. Seharusnya, nampak bakteri berbentuk batang dan berwarna merah muda
karena zat warna ungu keluar saat pori-pori terekstraksi oleh alkohol dan safranin
kemudian memberi warna merah muda. Namun saat diamati dengan mikroskop
cahaya perbesaran 10 x 100, tidak teramati bakteri sama sekali, meskipun sudah
digunakan minyak imersi untuk memperjelas objek pengamatan. Hal ini mungkin
disebabkan oleh kurang menempelnya ose pada media bakteri sehingga bakteri tidak
terambil sama sekali, teknik pengecatan yang kurang tepat sehingga bakteri terlarut
dalam air saat zat warna pada preparat dibilas, atau media agar yang telah lama
digunakan sehingga jumlah bakterinya tersisa sedikit. Saat diamati di bawah
mikroskop, hanya terlihat kumpulan zat warna di berbagai tempat, namun tidak
terlihat bakteri sama sekali.

Hasil praktikum Agrobacterium (II) setelah diamati oleh mikroskop cahaya

dengan perbesaran 10 x 100 ialah terlihat bahwa bakteri Agrobacterium memiliki
bentuk batang dengan warna merah muda dan merupakan bakteri gram negatif. Hasil
yang di dapatkan dalam praktikum ini sesuai dengan literature, dimana dalam
literature menjelaskan bahwa Agrobacterium adalah bakteri gram negatif yang
memiliki bentuk batang dan berwarna merah muda karena zat warna ungu keluar saat
pori-pori terekstraksi oleh alkohol dan safranin kemudian memberi warna merah
muda. Jumlah bakteri yang tidak terlalu banyak serta letak bakteri dalam hasil
pengamatan tidak terlihat begitu jelas dikarenakan saat pengambilan bakteri dan
peletakan bakteri diatas preparat praktikan tidak melakukannya dengan teliti sehingga
sedikit bakteri yang terdapat dalam preparat serta letak bakteri saling bertumpuk satu
sama lain.

Agrobacterium (III) adalah jenis bakteri pada sampel ‘A’ pada saat praktikum.
Bakteri Agrobacterium ialah bakteri yang memiliki bentuk mikroskopis bacil / batang
dan menunjukkan warna merah muda sehingga menandakan bahwa Agrobacterium
merupakan bakteri gram negatif. Namun, saat dilakukan pengamatan dibawah
mikroskop cahaya dengan perbesaran 10 x 100 didapat hasil bahwa tidak ada bakteri
yang teramati. Penyebab tidak adanya bakteri yang tampak dapat dikarenakan adanya
kesalahan dalam pengambilan bakteri dari tabung biakan bakteri, dimana ose yang
digunakan kurang menempel pada tabung biakan bakteri sehingga menyebabkan
ketiadaan bakteri yang terambil. Kemungkinan lain, terdapat kesalahan dalam teknik
pengecatan sehingga bakteri dimungkinkan dapat likut terbilas. Media penumbuh
bakteri yang kurang layak digunakan karena terlalu lama dalam penyimpanan juga
dapat menjadi faktor tidak ditemukannya bakteri ketika dilakukan pengamatan.

Bakteri selanjutnya adah bakteri ‘B’ atau dapat didapat pula bakteri Klebsiells sp.
Menurut teori, bakteri Klebsiella sp. merupakan bakteri gram negative sehingga
dalam pewarnaan gram, diakan akan berwarna merah muda. Bentuk dari bakteri itu
sendiri adalah basil atau batang. Sedangkan bakteri terakhir yaitu Escherichia coli,
teori yang ada menunjukan bahwa bakteri E. coli merupakan bakteri gram negative
sehingga akan berwarna merah muda dan bentuk dari E. coli adalah basil. Hasil
pengamatan yang didapat sangat sesuai dengan teori yaitu bakteri E. coli berbentuk
basil dan memiliki warna merah muda. Hasil pengamatan yang didapat selalu
mengandung sedikit bakteri yang dapat teramati. Hal itu dapat disebabkan saat
persiapan preparat bakteri yang terambil sedikit atau karen adanya media yang telah
rusak sehingga bakteri terkontaminasi.

VII. KESIMPULAN

1. Pewarnaan gram bertujuan membedakan bakteri gram positif dan gram negatif.
2. Hasil akhir pewarnaan gram yaitu bakteri yang berwarna ungu digolongkan ke
dalam bakteri gram positif, sedangkan bakteri yang berwaran merah digolongkan ke
dalam bakteri gram negatif.
3. Penyebab perbedaan warna bakteri gram postif dan bakteri gram negatif yaitu
adanya perbedaan struktur dinding sel. Dinding sel bakteri gram positif banyak
mengandung peptidoglikan sedangkan bakteri gram negatif banyak mengandung
lipopolisakarida.
4. Bakteri Bacillus subtilis merupakan bakteri gram positif dengan bentuk batang dan
berwarna ungu, Agrobacterium merupakan bakteri gram negative dengan bentuk
batang serta berwarna merah muda.
5. Bakteri Escherichia coli merupakan bakteri gram negative dengan bentuk batang
dan earna merah muda setelah diwarnai cat.
6. Bakteri B yaitu bakter Klebsiella sp. merupakan bakteri gram negative yang
teramati berbentuk batang dan berwarna merah muda setelah diwarnai.
VIII. DAFTAR PUSTAKAs

Campbell, N, 2003, Biologi, Edisi 5 Jilid 2, Erlangga, Jakarta.

Dwidjoseputro, D, 2005, Dasar - Dasar Mikrobiologi, Penerbit Djambatan, Malang.

Elfidasari, D. et al., 2011, Perbandingan Kualitas Es di Lingkungan Universitas Al

Azhar Indonesia dengan Restoran Fast Food di Daerah Senayan dengan
Indikator Jumlah Escherichia coli Terlarut, Jurnal Al-Azhar Indonesia Seri Sains
dan Teknologi, Vol.1(No.1).
Fajriana, R, 2008, Mikrobiologi Umum Pewarnaan Gram, Erlangga, Jakarta.

Fardiaz, S, 1989, Mikrobiologi Pangan, Institut Pertanian Bogor, Bogor.

Gielen, S., Aerts, R., dan Seels, B., 2004. Biocontrol Agents of Botrytis Cinerea
Tested in Climate Chambers by Making Artificial Infection on Tomato Leaf,
Commun Agric Appl Biol Sci, Vol 69 no. 4, pp. 631-639, diakses tanggal 17
Oktober 2018 pukul 16.13 WIB dari US National Library of Medicine National
Institutes of Health.

Ikmalia, 2008, Analisa Profil Protein Isolat Escherichia coli S1 Hasil Iradiasi Sinar
Gamma [Skripsi], Fakultas sains dan Teknologi Universitas Islam Negeri Syarif
Hidayatullah, Jakarta.

James, J, 2002, Prinsip - Prinsip Sains Untuk Keperawatan, Erlangga, Jakarta.

Karmana, O, 2008, Biologi, PT Grafindo Media Pratama, Jakarta.

Kusuma, D.A., 2013, Tinjauan Pustaka Klebsiella, eprints.undip.ac.id diakses pada

23 Oktober 2018 pukul 01.50 WIB.

Nakano, M.M., Zuber, P, 1998, Anaerobic growth of a "strict aerobe" (Bacillus

subtilis), https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/9891797, diakses tanggal 17
Oktober 2018 pukul 16.07 WIB.

Pelczar, M.J., 2007, Dasar-Dasar Mikrobiologi, UI Press, Jakarta.

Pratiwi, S.T., 2005, Buku Ajar Mikrobiologi Farmasi, Erlangga, Jakarta.

Ryan, K.J., Ray, C.G., 2004, Sherris Medical Microbiology, edisi 4, McGraw Hill,
New York

Tzfira T., Jianxiong L., Benoit L., and Vitaly C. 2004. Agrobacterium T-DNA
Integration: molecules and models. Rev.Trends in Genetic. Vol. 20 : No.8.
Wahyuningsih. 2008 . Pengecatan Gram . Universitas Jenderal Soedirman , Fakultas
Pertanian .Purwokerto.

Waluyo, L, 2008, Teknik dan Metode Dasar Mikrobiologi, UMM Press, Malang.

Waluyo, L, 2010, Teknik dan Metode Dasar Mikrobiologi, UMM Press, Malang.

Wibowo,RM. haryadi & Wahyui, Agnesia Endang Trihapsari, 2008, Studi

Patogenisitas Eschericia coli Isolat Unggas pada Ayam Pedaging Umur 15 Hari,
Jurnal Veteriner, Vol.9 No.2, pp.87–93.