Anda di halaman 1dari 9

Pemeriksaan kadar besi dalam serum meliputi pemeriksaan serum iron(SI), Total Iron

Binding Capacity (TIBC, ferritin serum, dan hemosiderin dari hapusan sumsum
tulang.
1. Standar yang digunakan
Mengunakan Standar dari ICSH (International Council for Standardization in
Haematology)
2. Metode yang banyak digunakan
 Pemeriksaan serum iron (SI) banyak menggunakan metode
Colorimetric-Ferrozine
 Pemeriksaan Total Iron Binding Capacity (TIBC) banyak
menggunakan metode Saturasi
 Pemeriksaan Ferritin serum banyak menggunakan metode Elisa
Double Sandwich dan IRMA (Immunoradiometric Assay)
 Hemosiderin banyak menggunakan metode Prussian Blue

B. Prinsip Pemeriksaan
1. Pemeriksaan Serum Iron
 menurut ICSH (International Council for Standardization in Haematology)
Besi dilepaskan dari ikatannya dengan transferrin, direduksi dari bentuk
Fe3+ menjadi Fe2+ dan serum protein dipresipitasi dengan menggunakan
reagen asam campuran (mixed acid reagent). Besi ferro dalam supernatan
direaksikan dengan larutan kromogenakan membentuk komplek warna
(pink solution)dan dibaca dengan fotometer pada panjang gelombang 562
nm.
 Dengan metode Colorimetric-Ferrozine
Ikatan antara ferri (Fe3+) dan transferin dilepaskan oleh guanidine dalam
suasana pH 4,8. Selanjutnya asam askorbat akan mereduksi ion ferri
(Fe3+) menjadi ferro (Fe2+), kemudian Fe2+ akan bereaksi dengan ferrozine
membentuk komplek berwarna.
2. TotaL Iron Binding Capacity (TIBC)
 menurut ICSH (International Council for Standardization in Haematology)
Pada serum ditambahkan besi yang berlebih (ferri klorid). Besi yang tidak
terikat transferin akan diabsorbsi oleh magnesium carbonate, kemudian
kadar besi serum diukur.
 Metode Saturasi
TIBC dievaluasi setelah saturasi transferin oleh larutan besi, dan kelebihan
besi akan diabsorbsi oleh magnesium hydroxide carbonate. Setelah
disentrifus, konsentrasi besi dalam supernatan diukur.
3. Ferritin Serum
 Metoda Elisa Double Sandwich
Pemeriksaan feritin serum memakai metode ELISA dengan cara double
sandwich. Antibodi dengan high affinity terhadap feritin (antiferitin Ig G)
akan berikatan dengan feritin serum dan selanjutnya dilabel dengan enzim
horseradish peroxidase dan dibaca absorbannya pada panjang gelombang
492 nm.
 Metode IRMA (Immunoradiometric Assay)
Antibodi yang dilabel dengan radioaktif yang berlebih direaksikan dengan
ferritin. Ferritin yang tidak berikatan dengan antibodi akan dihilangkan
dengan immunoadsorbent
4. Hemosiderin
Reagen Prussian blue akan mewarnai besi menjadi berwarna biru terang atau
hijau, sedangkan inti dan eritrosit tercat warna merah atau merah muda oleh
neutral red.

C. Bahan Pemeriksaan
1. Utama
Bahan utama pemeriksaan yang digunakan untuk pemeriksaan besi adalah serum
2. Pilihan
Selain menggunakan bahan pemeriksaan serum, dapat juga menggunakan bahan
pemeriksaan berupa plasma heparin dan plasma EDTA.

D. Cara Pemeriksaan
a. Reagen
1. Reagen pemeriksaan Serum Iron
a) Menurut ICSH (International Council for Standardization in Haematology)
- Protein precipitant
100 g/L trichloracetic acid (0,61 M) dan 30 ml/L thioglycollic acid
dalam 1 mol/L HCl. Larutan ini stabil selama 2 bulan dalam
gelap.Karena pertimbangan masalah kesehatan dan keamanan pada
penggunaan thioglycollic acid, maka ascorbic acid digunakan sebagai
alternatif agen reduktor, meskipun mungkin lebih dipengaruhi oleh
adanya copper.
Dalam 45 ml HCl 1mol/L ditambahkan 5 ml larutan trichloracetic acid
6,1 mol/L, kemudian ditambahkan lagi dengan 200 mg ascorbic acid
kemudian dicampur.
- Larutan kromogen
25mg ferrozine dilarutkan dalam 100 ml sodium acetate 1,5 mol/L.
Larutan ini dapat stabil hingga 4 minggu bila disimpan dalam gelap.
- Larutan standar besi (80 μmol/l)
o Tambahkan 200 μL HCl 2 mol/L dalam 22,1 ml deionized
water, dan campur.
o Tambahkan 100 μL larutan standar besi (1000 μg Fe/mL dalam
1 % HCl) dan campur.
o Stabil hingga 2 bulan pada suhu ruangan

b) Metode Colorimetric-Ferrozine
- Reagen 1 : R1
Acetate buffer, pH 4,8 100 mmol/L
Guanidine hydrochloride 5 mol/L
Thiourea 52,5 mmol/L
- Reagen 2 : R2
Ascorbic acid
- Reagen 3 : R3
Ferrozine 41 mmol/L
- Standar : Std
Iron 100 μg/dL
1mg/L
17,9 μmol/L
2. Reagen pemeriksaan TIBC
a) Direkomendasikan ICSH
- Basic magnesium carbonate
- Saturating solution (100 μmol Fe/L).
o Tambahkan 17,7 ml deionized water, 100 μL HCl 1mol/L, 100
μL larutan standar, homogenkan.
o Saturating iron solution mengandung 5,6 μg Fe/mL
o Stabil dalam 2 bulan pada suhu ruangan.
b) Metode Saturasi
- Reagen 1 : R1
Iron saturating solution 500 μg/dL
5 mg/L
89,5 μmol/L
- Reagen 2 : R2
Magnesium hydroxide carbonate(1 sendok takar = 100 mg)

3. Reagen pemeriksaan Ferritin Serum


Metode ELISA Double Sandwich
- Preparat antiferitin Ig G yang dikonjugasi dengan horseradish
peroxidase
- Larutan standar feritin.
Dibuat dengan cara
o Encerkan human ferritin 200 µg/ml ke dalam air.
Encerkan larutan feritin 200 µg/ml ke dalam 10 µl/ml
dalam 0,05 mol/l larutan sodium barbitone (yang terdiri
dari 0,1 mol/l NaCl, 0,02% NaN dan BSA 5 gr/dl), pH
disesuaikan sampai pH 8 dengan menambah HCl 5 mol/l.
o Bagi dalam 200 tabung kecil, masing-masing berisi 200
µl, tutup rapat dan tahan sampai 1 tahun pada suhu 40C
o Jika akan dipakai, encerkan dengan buffer B sampai 1000
µg/l dan siapkan larutan dalam range 0,2 – 25 µg/l
(bandingkan dengan standar WHO untuk uji serum
ferritin 94/572)
- Buffer A : Phosphate-buffered saline pH 7,2
- Buffer B : 5 gram BSA (Bovine Serum Albumin) dalam 1 liter buffer
A
- Buffer C: Carbonate buffer pH 9,6
- Buffer D : Citrate phosphate buffer pH 5.
- Larutan substrat

4. Reagen pemeriksaan Hemosiderin


Reagen yang digunakan Prussian blue

b. Prosedur Kerja
1. Pemeriksaan Serum Iron
a) Menurut ICSH (International Council for Standardization in
Haematology)
1. Masukkan ke dalam tabung, masing-masing 0,5 ml serum, 0,5
ml larutan kerja standar besi, dan 0,5 ml iron-free water sebagai
blanko.
2. Tambahkan ke dalam masing-masing tabung 0,5 ml protein
precipitant, kemudian campur, selanjutnya diamkan selama 5
menit
3. Sentrifugasi tabung yang berisi serum dengan microfuge pada
13.000 rpm selama 4 menit. untukmengendapkan protein dan
mendapatkan supernatan.Ambil 0,5 ml supernatan dan 0,5 ml
campuran pada tabung lainnya. Kemudian pada masing-masing
tabung ditambahkan 0,5 ml larutan kromogen dan campur
dengan baik.
4. Tunggu selama 10 menit
5. Ukur absorbans pada panjang gelombang 562 nm.
6. Penghitungan :
Serum iron = Atest-Ablanko x 80
Astandar-A blanko
Jika tak ada microfuge, gunakan volume dobel untuk reagen dan serum
dalam tabung 3 ml dan sentrifus pada 1500 g selama 15 menit
Terbentuknya komplek warna akan terlambat, bila menggunakan plasma
EDTA, dan harus ditunggu selama 15 menit sebelum diukur absorbansnya.
b) Menggunakan Metode Colorimetric-Ferrozine
1. Larutan kerja (Working reagent) : Larutkan 1 sendok takar R2
dalam 50 ml R1. Tunggu hingga tercampur dengan baik. Larutan
ini stabil selama 2 minggu pada suhu 2-8o C, dan 3 hari pada suhu
20-25o C.
2. Kemudian lakukan sesuai tabel dibawah ini :
Blanko Standar Sampel

Larutan kerja 500 μL 500 μL 500 μL

Akuades 150 μL - -

Standar - 150 μL -

Sampel - - 150
3. Campurkan dan baca absorbans (A) pada panjang gelombang 560
nm setelah 50 detik
Blanko Standar Sampel

- A1 A2

4. Kemudian tambahkan :
Blanko Standar Sampel

Reagen 3 (R3) 25 μL 25 μL 25 μL

5. Campurkan dan baca absorbance (A) pada panjang gelombang


560 nm setelah 325 detik
Blanko Standar Sampel

- A3 A4

6. Penghitungan :
A4-A2
X konsentrasi standar
A3-A1
2. Pemeriksaan TIBC
a) Direkomendasikan oleh ICSH
1. Masukkan 0,5 ml serum ke dalam tabung
2. Kemudian tambahkan 0,5 ml saturating iron solution, campur
dengan hati-hati, dan diamkan selama 15 menit pada suhu
ruangan.
3. Tambahkan 100 mg light magnesium carbonate, tutup tabung
dan bolak-balik tabung, diamkan selama 30 menit dengan
sekali-kali diaduk
4. Sentrifugasi tabung yang berisi serum dengan microfuge pada
13.000 rpm selama 4 menit. untuk mengendapkan protein dan
mendapatkan supernatan.
5. Periksa supernatan, jika masih sisa magnesium carbonate harus
disentrifus ulang.
6. Ambil supernatannya sebanyak 0,5 ml dan perlakukan seperti
pada pemeriksaan serum iron.
7. Hasil akhir dikalikan 2
Jika tak ada microfuge, gunakan volume dobel untuk reagen
dan serum dalam tabung 3 ml dan sentrifus pada 1500 g
selama 15 menit
b) Metode Saturasi
1. Sampel 0,5 ml dicampurkan dengan 1 ml reagen R1, diinkubasi
selama 5 menit
2. Kemudian tambahkan 1 sendok takar ( kira-kira 100 mg)
reagen R2, dan diinkubasi selama 20 menit, dengan sekali-kali
dikocok.
3. Sentrifus selama 10 menit dengan 3000 rpm
4. Ambil supernatannya.
5. Periksa supernatan seperti pada penentuan SI.
Dengan 1 bagian supernatan : 3 bagian reagen R1 (pada SI).

3. Pemeriksaan Ferritin Serum


Metode ELISA Double Sandwich
1. Lapisi microtitreplate, dengan cara :
- Preparat antiferitin Ig G diencerkan dengan 2 µg/ml buffer C,
tambahkan 200 µl ke dalam tiap-tiap sumuran.
- Tutup dan inkubasi semalam pada suhu 40C. Kosongkan
sumuran dengan cara dibalik dan di-tapping pada handuk
kering.
- Tambahkan 200 µl 0,05% BSA dalam buffer C, diamkan 30
menit dalam suhu ruangan.
- Cuci tiap sumuran dengan buffer A sampai 3x. plate dapat
disimpan sampai 1 minggu pada tempat kering dan suhu 40C
2. Encerkan 50 µl serum pasien dengan 1 ml buffer B.
3. Tambahkan 200 µl larutan standard dan serum pasien ke dalam
tiap sumuran dalam waktu 20 menit.
4. Tutup dan diamkan selama 20 menit pada suhu kamar dan
jauhkan dari sinar matahari
5. Kosongkan sumuran dan cuci 3x dengan buffer A.
6. Tambahkan 200 µl preparat konjugasi antiferitin Ig G dengan
horseradish peroxidase yang sudah diencerkan, tutup dan
diamkan selama 2 jam pada suhu kamar.
7. Cuci 3x dengan buffer A
8. Tambahkan 200 µl larutan substrat pada tiap-tiap sumuran,
inkubasi selama 30 menit.
9. Tambahkan 50 µl asam sulfur 4M pada tiap-tiap sumuran untuk
menghentikan reaksi
10. Tunggu 30 menit dan baca absorbannya pada 492 nm dengan
microtitre plate reader, atau ambil 200 µl larutan dari tiap
sumuran dan masukkan dalam 800 µl air, baca dengan
fotometer.

4. Pemeriksaan Hemosiderin
Prosedur Kerja :
1) Hapusan darah difiksasi dengan metanol, tunggu 10 – 20 menit
2) Masukkan hapusan dalam larutan potassium ferrocyanide selama
10 menit pada suhu 200C.
3) Cuci dengan air kran selama kira-kira 20 menit, kemudian bilas
dengan distilled water.
4) Cat dengan neutral red atau eosin selama 10-15 detik
5) Tuangi dengan HCl 3 mol/l dan cuci dengan air kran.

Anda mungkin juga menyukai