Anda di halaman 1dari 4

Nama : Yusuf Mufti Bimantara

NIM : 186040200011005

In Vitro Elimination of Piper Yellow Mottle Virus from Infected Black Pepper through Somatic
Embryogenesis and Meristem-tip Culture

Piper virus belang kuning ( PYMoV) (genus: Badnavirus) adalah virus penting yang
menginfeksi lada hitam dan spesies tanaman terkait yang ada di India dan bagian lain dunia.
Tanaman yang terinfeksi menunjukkan gejala yang beragam seperti mosaik, bintik klorosis, vena
kliring, bintik-bintik kuning, ukuran daun mengecil, deformasi, pengurangan panjang ruas, dan
pengerdilan tanaman. Lada hitam adalah perrenial vine yang dapat diperbanyak secara vegetatif
melalui stem cuttings, yang menyebabkan penumpukan konsentrasi virus dari waktu ke waktu,
dan virus translokasi melalui perbanyakan vegetatif. Selain itu, PYMoV juga ditularkan melalui
biji. metode kultur jaringan seperti kultur meristem-tip dan embriogenesis somatik sendiri atau
dalam kombinasi dengan antivirus yang telah berhasil digunakan untuk produksi tanaman bebas
virus tanaman dari tanaman yang terinfeksi yang telah di lakukan di banyak tanaman ( Panattoni
et al., 2013 ). Tujuan dari penelitian ini adalah untuk mengembangkan metode berbasis budaya
jaringan seperti embriogenesis somatik dan kultur meristem-tip untuk eliminasi PYMoV dari lada
hitam.
Metode :
Sepuluh tanaman lada hitam masing-masing dari 6 varietas (IISR Malabar Excel, IISR
Shakthi, IISR Thevam, Panniyur-1, Sreekara, dan Subhakara) yang menunjukkan gejala virus
Piper yellow mottle virus (PYMoV) diamati dengan PCR dan digunakan sebagai bahan sumber
untuk embriogenesis somatik. Pucuk tunas dari lada hitam var. Sreekara yang terinfeksi PYMoV
digunakan sebagai eksplan untuk kultur pucuk meristem. Disebut sebagai PYMoVinfected dan
tanaman lada hitam sehat digunakan sebagai kontrol.
Identifikasi tanaman induk PYMoV yang terinfeksi dengan PCR menggunakan primer
spesifik dianalisis menggunakan elktroforesis. Embrio somatic tanaman yang digunakan
dihasilkan dari enam varietas lada hitam dengan menggunakan metode Nair dan Gupta (2006).
Inokulasi embrio scooped-out bersama dengan mikropilar (biji masak yang dikumpulkan dari
tanaman lada hitam yang terinfeksi PYMoV) pada media S30 (Medium SH mengandung sukrosa
3%) dan inkubasi pada suhu 28oC dalam gelap untuk induksi embryogenesis somatic primer.
Kemudian embrio somatic primer Bersama dengan seluruh eksplan diinokulasi dalam SH07 (
untuk var Panniyur-1), SH10 (untuk var. IISR Shakthi, IISR Thevam, Sreekara, dan Subhakara),
dan SH15 (untuk var. IISR Malabar Excel) untuk induksi embriogenesis somatik sekunder dan
siklik somatic embriogenesis. Setiap embrio somatik siklik diregenerasi menghasilkan planlet
dalam medium cair SH35 (mengandung medium SH Sukrosa 3,5%) dengan vibrator 110 rpm
selama 30 hari. Planlet yang terdiferensiasi dengan baik dipindahkan ke media tanaman berkayu
(WPM) mengandung 2% arang untuk rooting, dan planlet yang di-root dikeraskan di rumah kaca.
Tumbuhan yang berasal dari embrio somatic dari semua enam varietas diuji untuk ada / tidaknya
PYMoV oleh PCR bersama dengan yang diketahui positif dan kontrol negatif.
Embriogenesis somatik dikombinasikan dengan kemoterapi dan pengujian tanaman untuk
PYMoV. 7 Embrio somatik siklik dari var. Sreekara diperoleh seperti dijelaskan di atas digunakan
sebagai bahan awal untuk percobaan ini. Sekitar 100 mg dari embrio somatik siklik diinokulasi
dalam media SH yang mengandung 1% sukrosa dilengkapi dengan konsentrasi yang berbeda
ribavirin (0, 10, 20, 30, dan 50 mg / l). Dua subkultur dilakukan pada interval 15 hari di media
yang sama. Pengamatan seperti perubahan warna, tingkat proliferasi, dan nekrosis embrio somatik
siklik dicatat pada hari ke-30 inkubasi. Ribavirin-diperlakukan embrio somatik siklik kemudian
diubah menjadi planlet di SH cair (SH35) menengah, dan planlet yang terdiffferensiasi dengan
baik dipindahkan ke WPM bebas hormon untuk organogenesis yang tepat. Planlet berakar
dipindahkan pengerasan dalam pot steril di rumah kaca. Percobaan diulang tiga kali, dan jumlah
planlet yang selamat setelah pengerasan pada setiap konsentrasi ribavirin tercatat. Tanaman yang
telah di aklimatisasi diuji untuk kehadiran / adanya PYMoV dengan PCR.
Kultur meristem-tip dan pengujian tanaman turunan meristem untuk PYMoV. Tunas ujung
PYMoV terinfeksi tanaman lada hitam dari var. Sreekara dicelupkan dalam 1,5% bavistin 2 hari
sebelum pengumpulan eksplan. Eksplan dikumpulkan dan diperlakukan lagi dengan bavistin
selama 10 menit, dilanjutkan dengan pengobatan dengan air yang mengandung 1% Tween 20
selama 10 menit dan dicuci di bawah air keran selama 10 menit. Eksplan permukaan disterilkan
dengan 0,1% merkuri klorida selama 10 menit dan dibilas dengan air steril tiga kali. Meristem
sekitar 2-3mm kemudian dikeluarkan dari ujung tunas di bawah laminar air flow modul dengan
menggunakan, pisau bedah bersih steril dan diinokulasi awalnya menjadi media WPM yang
mengandung 3 mg / l benzil adenin (BA) þ 1 mg / l kinetin (KN) ( Babu et al., 1997 ). Untuk
mencegah kematian meristem diinokulasi karena kontaminasi bakteri endofit, antibiotik seperti
tetrasiklin, penisilin G, dan spectromycin diuji secara individu dan dalam kombinasi untuk
mengontrol pertumbuhan bakteri endofit. Sebuah ose yang penuh masing-masing dua bakteri yang
diisolasi digoreskan pada media LB yang mengandung 1% dari masing-masing antibiotik dan
diinkubasi pada 28 C selama 3 hari. Setelah menentukan antibiotik yang sesuai, meristem yang
akhirnya diinokulasi kedalam WPMmedium mengandung 3 mg / l BA þ 1 mg / l KN dan masing-
masing dari tetrasiklin dan spectromycin 1%, diikuti dengan inkubasi pada 28 C dengan
penyinaran 16-jam dan kemudian dipantau setiap hari. Budaya dibiarkan tumbuh selama 2-3
minggu untuk meristem elongasi. meristem diperpanjang kemudian ditransfer ke medium
antibiotik sampai tunas terbentuk. Tunas kemudian dipindahkan ke perakaran menengah (WPM
dengan 3 mg / l BA þ 1mg / l NAA) ( Babu et al., 1997 ), dan planlet yang mulai berakar di
pindahkan rumah kaca. Percobaan diulang tiga kali, dan jumlah planlet yang selamat di WPM dan
planlet yang selamat setelah pengerasan tercatat. Semua tanaman yang telah di aklimatisasi diuji
untuk kehadiran / adanya PYMoV dengan PCR.
Kultur meristem-tip dikombinasikan dengan kemoterapi dan pengujian tanaman untuk
PYMoV. Meristem dipotong dari tunas pucuk tanaman yang terinfeksi virus dari var. Sreekara,
seperti dijelaskan di atas, diinokulasi dalam media meristem regenerasi (WPM dengan 3 mg / l BA
þ 1 mg / l KN þ 1% tetrasiklin þ 1% spectromycin) mengandung ribavirin pada 0, 10, 20, 30, dan
50 mg / l untuk jangka waktu 30 hari, dengan dua subkultur di media yang sama pada interval 15
hari. meristem Perlakuan ribavirin kemudian ditransfer ke medium tanpa ribavirin dan antibiotik
untuk tunas yang tepat, diikuti oleh perakaran seperti yang dijelaskan sebelumnya. plantlet yang
telah berakar di pindahkan di rumah kaca. Percobaan diulang tiga kali, dan jumlah planlet yang
selamat di WPM dan pengerasan di masing-masing ribavirin meristem konsentrasi-diperlakukan
berbeda tercatat. Semua tanaman diuji untuk kehadiran / adanya PYMoV dengan PCR
Hasil :
Hasil identifikasi 10 tanaman induk yang terinfeksi PYMoV didapatkan bahwa 10 tanaman
dari tiap enam varietas terbukti positif dan dikonfirmasi olehh produk PCR yang menunjukkan
100% identitas dari PYMoV. Keseluruhan DNA diisolasi dari 227 tanaman embrio somatik yang
diturunkan milik enam varietas diamati menggunakan PCR. 65 tanaman menunjukkan reaksi
positif, menunjukkan bahwa 28% dari tanaman terinfeksi PYMoV, sedangkan tanaman yang
tersisa (78%) adalah tanaman bebas dari PYMoV. Virus terutama terbatas pada jaringan pembuluh
darah, sementara embrio somatik timbul dari jaringan non-vaskular, sehingga meningkatkan
kemungkinan virus eliminasi ( Guiderdoni dan Demarly 1988 ). Dalam penelitian ini, tingkat
eliminasi virus bervariasi dari 55% sampai 100% dalam varietas yang berbeda dari lada hitam.
Semua tanaman embrio yang diturunkan somatik dari var. IISR Thevam bebas dari PYMoV,
sementara hanya 55% dari tanaman var. IISR Malabar Excel bebas dari PYMoV.
Embriogenesis somatik dikombinasikan dengan kemoterapi dan pengujian tanaman untuk
PYMoV. Proliferasi embrio somatik siklik tidak terpengaruh pada 10 dan 20 mg / l ribavirin,
sementara pada 30 mg / l ribavirin, proliferasi lambat, dan pada 50 mg / l ribavarin, nekrosis
lengkap dan kematian embrio somatik diamati. Secara umum, regenerasi planlet lebih lambat pada
embrio somatik siklik ribavirin-diperlakukan daripada di kontrol. Jumlah tanaman yang dihasilkan
juga menurun (sampai 50% dalam 30 mg / l ribavarin) pada konsentrasi yang berbeda dari
ribavirin. Efek phytotoxic ribavirin memperlambat laju multiplikasi embrio somatik siklik dan
membunuh jaringan pada konsentrasi tinggi. Hasil yang sama dari mengurangi tingkat perkalian
dan kematian selentingan tunas karena ribavirin dilaporkan oleh Usus et al. (2014).
Tiga puluh tanaman dari masing-masing perlakuan diuji untuk kehadiran / adanya PYMoV
dengan PCR. 7 dari 30 tanaman dari / l kelompok perlakuan ribavirin 10 mg dinyatakan positif
PYMoV. Semua 30 tanaman masing-masing dari 20 ke / l kelompok perlakuan ribavirin 30 mg
diuji negatif untuk PYMoV menunjukkan bahwa pengobatan dengan 20 mg / l ribavirin adalah
suffisien untuk penghapusan lengkap PYMoV dari embrio somatik siklik lada hitam. Ribavirin
menghambat capping RNA virus dengan mengurangi guanosin intraseluler, sehingga menghambat
pergerakan virus dan mengakibatkan eliminasi ( Cassells dan Long, 1982 ). Penelitian ini adalah
Laporan pertama produksi tanaman bebas virus dengan menggabungkan embriogenesis somatik
dengan ribavirin.
Kultur meristem-tip dan pengujian tanaman turunan meristem untuk PYMoV. Infeksi
PYMoV pada tanaman lada hitam var. Sreekara dengan menggunakan PCR. Eksplan meristem
diambil dari tanaman tersebut kemudian dikultur dalam medium WPM yang mengandung 3 mg /
l BA þ 1 mg / l KN menyebabkan kematian meristem karena kontaminasi bakteri endogen.Dari
tiga antibiotik diuji secara individu dan dalam kombinasi, 1% masing-masing tetrasiklin dan
spectromycin efektif dalam mengendalikan bakteri endogen. Meristem dikultur di WPM yang
mengandung 3 mg / l BA þ 1 mg / l KN 1% tetra silkin dan 1% specmatrocyn. Kehadiran arang
aktif di WPM dapat mencegah akumulasi fenol dan telah digunakan di in vitro budidaya lada
hitam. Dalam penelitian ini didapatkan planlet turunan meristem sebanyak 26 tanaman. Setelah
diuji PCR didapatkan bahwa 84% dari tanaman hasil Kultur meristem bebas dari PYMoV.
Hasil dari kultur meristem pucuk dikombinasikan dengan kemoterapi untuk PYMoV.
Pemberian ribavirin kecuali dengan dosis 10 mg/l ribavirin, semua perlakuan lain mengakibatkan
pemanjangan dan regenerasi meristem yang lambat. Jumlah hari regenerasi meristem perlakuan
20 dan 30 mg/l ribavirin sekitar (60-80 hari) dibandingkan dengan control sekitar (35-50 hari).
Pada perlakuan 10 mg/l didapatkan 10 planlet dan pada perlakuan 50 mg/l didapatkan 6 planlet.
Konsentrasi 50 mg/l adalah racun bagi tunas dan menyebabkan nekrosis pada planlet. Setelah
aklimatiasi tanaman tidak menunjukkan perbedaan pertumbuhan dan perkembangan. Semua
tanaman hasil kultur meristem yang dikombinasikan dengan ribavirin 100 % negatif adanya
PYMoV .
Kesimpulannya, Temuan dari penelitian ini menunjukkan bahwa somatik embriogenesis
atau meristem-tip budaya telah sukses untuk penghapusan PYMoV dari lada hitam. perbaikan
lebih lanjut atau penghapusan lengkap PYMoV itu mungkin ketika somatik embriogenesis atau
meristem-tip budaya dikombinasikan dengan kemoterapi. Untuk embriogenesis somatik, setelah
embrio somatik siklik diperoleh, mereka dapat digunakan untuk produksi tanaman berkelanjutan
setidaknya selama satu tahun. Peningkatan jumlah siklus subkultur mengarah ke peningkatan
eliminasi virus.