En C todas las moléculas de enzima están combinadas

Efecto de la concentración de sustrato y con el sustrato. Tan pronto reacciona una molécula de
de inhibidores sustrato y se separa de enzima, se combina con otro
sustrato. Un aumento de la enzima no puede acelerar la
reacción debido a que la enzima ya está siendo utilizada
Castro López Rodrigo Iván
por completo.
Gutiérrez García Abel Alejandro El valor de Vmax (velocidad máxima) es un parámetro
cinético de importancia, característico de una enzima y
Grupo: 3IV1 Sección: 2 substrato en una temperatura y pH determinados.

Introducción
La cinética de los procesos que ocurren en el organismo
viviente se comprende mejor cuando se consideran en
términos de velocidades de reacción enzimáticas. Esto
se debe principalmente al gran número de clases de
enzimas implicadas y a las innumerables maneras que
tiene de trabajarlos principios de las velocidades de
reacciones enzimáticas no difieren de la cinética
química clásica.
Efecto de la concentración de sustrato
Para una concentración fija de enzima, la velocidad
inicial (antes de que se consuma bastante sustrato)
aumenta primero incrementando la concentración del
sustrato. Con el tiempo alcanza un máximo y la adición
de más sustrato no tiene influencia adicional en la
velocidad. Esto se muestra en el diagrama. La curva se
conoce como hipérbola rectangular y es característica
de todas las enzimas alostéricas.
C por las cantidades dadas de enzima y las
B la mitad de ésta velocidad máxima. Ésta concentración
A se conoce como la constante de Michaelis (Km) para la
Km es una constante característica de una enzima y un
sustrato en particular. Es independiente de las
concentraciones de enzima y sustrato.
Efecto de inhibidores.
Se pueden disminuir las velocidades de la mayoría de
las reacciones catalizadas por enzimas por una serie de
sustancias llamadas en conjunto inhibidores. Pueden
ser generales en su acción (por ejemplo, la urea y otros
agentes desnaturalizantes), específicos (que actúan, por
ejemplo, contra las fosforilasas) o específicos para una
enzima (como son los análogos al sustrato). También se
clasifican según la forma como afectan la cinética
observada.
Mediciones cuantitativas de la actividad de enzima son
necesarias para comprender su función biológica y para
determinar la cantidad presente en muestras biológicas.
Una manera de hacer lo complejo más fácil es asumir
que sólo los sustratos, y no los productos, están
presentes, de modo que la reacción transcurre sólo en
una dirección. Bajo este supuesto, se pueden hacer
estimaciones de la velocidad máxima (Vmax) alcanzable
concentraciones de sustrato necesarias para conseguir
enzima.

Ilustración 1 Gráfica de Michaelis-Menten

En el segmento A: Lineal, cinética de primer orden con

relación al sustrato y enzima ( V=k[E]So ); la
concentración inicial del sustrato es baja y limita la
velocidad

En el segmento B: Curvo, cinética de primer orden con

relación a la enzima; orden mixto (primer orden y orden
cero) con relación al sustrato.

En el segmento C: Casi lineal, cinética de primer orden

con relación a la enzima, muy cercana al orden cero con
relación al sustrato ( V= k [E] )
El análisis de éstos parámetros cinéticos permite
Resultados y Discusión
reconocer inhibidores de competencia, cuyos efectos
pueden aliviarse por aumento de la concentración de
sustrato, e inhibidores no competitivos, que no se 1.- Efecto de la
afectan por la concentración el sustrato y tienen el
efecto de separar parte de la enzima. concentración de
sustrato sobre la
velocidad de reacción.
Testi
# Tubo go
Problemas
1 2 3 4 5 6
SAC 0.2 M 0.5 0.1 0.2 0.3 0.5 0.8 1
(mL)
Regulador 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5
de aceatos
0.005 M pH
4.7
Agua (mL) 0.5 0.9 0.8 0.7 0.5 0.2 0
Preincubació 5 min a temperatura ambiente
n
Enzima 0 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5
Ilustración 2 Gráfica de Lineweaver-Burk para inhibición 10µg/mL
enzimática. Se muestran los posibles comportamientos de un (mL)
Incubación 5 min a temperatura ambiente
inhibidor. La línea roja es con inhibidor y la azul sin inhibidor.
Inactivació 0.5 mL DNS + 0.5 0.5 mL de DNS a cada tubo
n enzima
Desarrollo 5 minutos a 92 ° C (en baño maría)
de color
Dilución Enfriar en baño de hielo y diluir con 2.0 mL de agua a
Objetivos de la práctica cada tubo
Leer en un espectrofotómetro a 540 nm
Absorbanci 0 0.0 0.39 0.52 0.43 0.77 0.72
-Analizar la velocidad de reacción de una enzima de a
63 0 8 2 7 8
acuerdo a su absorbancia. Azúcar 0 2 4 6 10 16 20
reductor
-Interpretar la gráfica y ecuación de Michaelis-Menten. (µmoles)
Velocidad 0 0.2 0.4 0.6 1 1.6 2
-Indicar que tipo de inhibidor es la anilina en base al (UI)
comportamiento de la gráfica de Lineweaver-Burk. Concentració 0 0.0 0.02 0.02 0.02 0.02 0.029
n del
sustrato 291 918 919 921 923 25 M
(moles/L= M) 7M M M M M

Cálculos azúcar reductor, velocidad y concentración de

sustrato.

Azúcar reductor (µmol)

Para tubo 1
0.2mol ----- 1000 mL
x ---------------- 0.1 mL x= 0.000002 mol
Para tubo 2
0.2mol ----- 1000 mL
x ---------------- 0.2 mL x=0.000004 mol
Para tubo 3
0.2mol ----- 1000 mL
x ---------------- 0.3 mL x=0.000006 mol
Para tubo 4
0.2mol ----- 1000 mL
x ---------------- 0.5 mL x=0.000010 mol
Para tubo 5
0.2mol ----- 1000 mL
x ---------------- 0.8 mL x=0.000016 mol
Para tubo 6
0.2mol ----- 1000 mL
x ---------------- 1 mL x=0.00002 mol
 Cálculo de la constante de Michalelis –
Menten por el procedimiento gráfico de
Velocidad (U.I.) Lineweaver – Burk.
[S] [S]-1 V V-1
1 𝜇𝑚𝑜𝑙 𝑑𝑒 𝑠𝑎𝑐𝑎𝑟𝑜𝑠𝑎 𝜇𝑚𝑜𝑙 𝑑𝑒 𝑎𝑧ú𝑐𝑎𝑟 𝑟𝑒𝑑𝑢𝑐𝑡𝑜𝑟 (M) (M) (UI) (UI)
𝑉=( )( )
2 𝜇𝑚𝑜𝑙 𝑑𝑒 𝑎𝑧ú𝑐𝑎𝑟 𝑟𝑒𝑑𝑢𝑐𝑡𝑜𝑟 (5𝑚𝑖𝑛) 0.568603 2 0.5
T1 1.75869631
T2 0.568667 1.75849838 4 0.25
Entonces:
T3 0.568730 1.75830359 6 0.166
T1 = 0.00002/10 0.2 UI T4 0.568856 1.75791413 10 0.1
T2 = 0.00004/10 0.4 UI T5 0.569046 1.75732718 16 0.0625
T3 = 0.00006/10 0.6 UI 0.569172 20 0.05
T4 = 0.00010/10 1cUI
T6 1.75693815
T5 = 0.000016/10 1.6 UI
T6= 0.0002/10 2 UI
Gráfico de Lineweaver – Burk ( V-1 VS S-1 )

Concentración (M) (Sin inhibidor) 0.6

Utilizando la ec. lineal tenemos que: 0.5

Y=a + bx Donde a= 0.180 y b= 0.3166

0.4
y = 200.37x - 352.06
0.3

V-1
Acomodando datos entonces:
0.2
[S]= (A+0.180)/0.3166
0.1
[S]= (A+0.180)/0.3166 [S] (M)
T1 [2x10-6 + 0.180] / 0.3166 0.568603 0
T2 [4x10-6 + 0.180] / 0.3166 0.568667 1.7565 1.757 1.7575 1.758 1.7585 1.759
-0.1
T3 [6x10-6 + 0.180] / 0.3166 0.568730 [S]-1
T4 [10x10-6 + 0.180] / 0.3166 0.568856
T5 [16x10-6 + 0.180] / 0.3166 0.569046
T6 [20x10-6 + 0.180] / 0.3166 0.569172 Extrapolando:

Gráfico: Velocidad VS Concentración de Valores Y

Sustrato 5000
y = 200.37x - 352.06
0
25
-120 -100 -80 -60 -40 -20 0 20
-5000
20
Velocidad (UI)

V-1

-10000
15
-15000
10
-20000
5
-25000
0 [S]-1
0.5684 0.5686 0.5688 0.569 0.5692 0.5694
Concentración de Sustrato (M) Cálculos:

x= 1/ [S]
Interpretación: una vez realizados los cálculos y
elaborada la gráfica; se llegó a la conclusión de la y= 1/V
velocidad (UI) tiene una relación DIRECTACTEMENTE
y= mx + b
PROPORCIONAL a la concentración Molar de Sustrato;
ya que como se puede observar en el gráfico, A mayor y = 200.37x - 352.06
concentración de sustrato, hay mayor velocidad.
 1 Km 1 1 Cálculos azúcar reductor, velocidad y concentración de
= ∗ +
Vo vmax [s] Vmax sustrato.
1
y=
vo
=0
Azúcar reductor (µmol)
0 = 200.37x − 352.37 Para tubo 1
0.2mol ----- 1000 mL
352.37 x ---------------- 0.1 mL x= 0.0002 mol
X=
200.37 Para tubo 2
0.2mol ----- 1000 mL
−1
x = 1.7585 = x ---------------- 0.2 mL x=0.0004 mol
km Para tubo 3
0.2mol ----- 1000 mL
𝐊𝐦 = −𝟎. 𝟓𝟔𝟖𝟔𝟑 x ---------------- 0.3 mL x=0.00006 mol
Para tubo 4
2.- Inhibición Enzimática 0.2mol ----- 1000 mL
x ---------------- 0.5 mL x=0.00010 mol
Testigo
# Tubo Problemas Para tubo 5
1 2 3 4 5 6 0.2mol ----- 1000 mL
SAC 0.2 M 0.5 0.1 0.2 0.3 0.5 0.8 1 x ---------------- 0.8 mL x=0.00016 mol
(mL) Para tubo 6
Inhibidor de 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5
regulador 0.2mol ----- 1000 mL
de acetatos x ---------------- 1 mL x=0.0002 mol
pH 4.7
Agua (mL) 0.5 0.9 0.8 0.7 0.5 0.2 0
Pre 5 min a temperatura ambiente Velocidad (U.I.)
incubación
Enzima 0 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5
10µg/mL
(mL) 1 𝜇𝑚𝑜𝑙 𝑑𝑒 𝑠𝑎𝑐𝑎𝑟𝑜𝑠𝑎 𝜇𝑚𝑜𝑙 𝑑𝑒 𝑎𝑧ú𝑐𝑎𝑟 𝑟𝑒𝑑𝑢𝑐𝑡𝑜𝑟
Incubación 5 min a temperatura ambiente 𝑉=( )( )
2 𝜇𝑚𝑜𝑙 𝑑𝑒 𝑎𝑧ú𝑐𝑎𝑟 𝑟𝑒𝑑𝑢𝑐𝑡𝑜𝑟 (5𝑚𝑖𝑛)
Inactivación 0.5 mL 0.5 mL de DNS a cada tubo
DNS +
0.5 Entonces:
enzima
Desarrollo 5 minutos a 92 ° C (en baño maría)
de color T1 = 0.00002/10 2 UI
Dilución Enfriar en baño de hielo y diluir con 2.0 mL de agua a cada
tubo T2 = 0.00004/10 4 UI
Leer en un espectrofotómetro a 540 nm T3 = 0.00006/10 6 UI
Absorbanci 0 0.2 0.69 0.57 0.73 0.91 1.13 T4 = 0.00010/10 10 UI
a T5 = 0.000016/10 16 UI
33 9 7 4 7 2
Azúcar 0 20 40 60 100 160 20 T6= 0.0002/10 20 UI
reductor
(µmoles) 0
Velocidad 2 4 6 10 16 20
(UI) Concentración (M) (en presencia de
Concentración
del sustrato
8.5 8.5 8.5 8.5 8.5 8.5 inhibidor)
(moles/L= M) 18 181 181 181 181 181
1 Utilizando la ec. lineal tenemos que:

Y=a + bx Donde a= 0.3350 y b= 0.03933

Acomodando datos entonces:

[S]= (A+0.180)/0.3166

[S]= (A+0.3350 [S] (M)

)/0.03933
T1 [20x10-6 + 0.3350] / 0.03933 8.5181
T2 [40x10-6 + 0.3350] / 0.03933 8.5186
T3 [60x10-6 + 0.3350] / 0.03933 8.5191
T4 [100x10-6 + 0.3350] / 0.03933 8.5202
T5 [160x10-6 + 0.3350] / 0.03933 8,5217
T6 [200x10-6 + 0.3350] / 0.03933 8,5227
Gráfico: Velocidad VS Concentración de Extrapolando:
Sustrato (Presencia de Inhibidor)
0.6

25 y = 1.6851x + 0.0562 0.5

20 0.4
Velocidad (UI)

15 0.3

V-1
10 0.2

5 0.1

0 0
-50000 0 50000 100000 -0.15 -0.1 -0.05 0 0.05 0.1 0.15
-0.1
Concentración de Sustrato (M)
-0.2
[S]-1
Cálculo de la constante de Michalelis –
Menten por el procedimiento gráfico de
Cálculos:
Lineweaver – Burk.
x= 1/ [S]
[S] [S]-1 V V-1
(M) (M) (UI) (UI) y= 1/V
T1 8.5181 0.11739707 2 0.5
8.5186 4 0.25 y= mx + b
T2 0.11739018
T3 8.5191 0.11738329 6 0.166 y = 1.6851x - 352.06
T4 8.5202 0.11736814 10 0.1
16
1 Km 1 1
T5 8,5217 1.1735E-05 0.0625 = ∗ +
20
Vo vmax [s] Vmax
T6 8,5227 1.1733E-05 0.05
1
y= =0
vo
Gráfico de Lineweaver – Burk ( V-1 VS S-1 )
0 = 1.6851x + 0.0562
0.6 −0.0562
X=
0.5 1.6851
0.5 −1
x = −0.03335 =
km
0.4
𝐊𝐦 = 𝟐𝟗. 𝟗𝟖𝟑𝟗
y = 1.6851x + 0.0562
V-1

0.3 0.25

0.2 0.166

0.1
0.10.0625
0.05
0
-0.05 0 0.05 0.1 0.15

[S]-1

Vmax = 1/0.05 Vmax = 20 UI

La gráfica realizada se comportó de manera diferente a
las propuestas; por ende, es difícil determinar el tipo de
inhibición enzimática que tiene.

Conclusión

Como se puede observar en la sección de “resultados”,

el equipo no logró obtener los esperados, puesto que
ambos gráficos fueron arrojados con formas distintas las
que se reportan en la bibliografía consultada.

Por ende se llega a la conclusión de que es importante

realizar el trabajo experimental con sus debidas
precauciones; antes de comenzar, es importante
establecer los resultados que se esperan, para así
poder detectar el mínimo error y poder volver a hacer el
procedimiento, por ejemplo: las absorbancias obtenidas
deben de tener una valor en orden de menor a mayor; el
equipo tuvo el error de que al observar que no eran
arrojadas en dicho orden, así fueron anotadas para la
elaboración del reporte; cuando lo correcto era volver a
llevar a cabo la experimentación. Algunos factores
importantes a revisar son: reactivos contaminados,
precaución al colocar volúmenes, ser exactos con los
tiempos de baño de hielo, baño maría e incubación, etc.;
puesto que fallas en estos procesos pueden desviar los
resultados obtenidos de los esperados.

Fuentes de consulta

Bibliografía
Baghavan, N. V. (1978). Bioquímica. México:
Iberoamericana.

McGilvery, R. V. (1970). Bioquímica. México:

Iberoamericana.