Anda di halaman 1dari 9

LAPORAN PRAKTIKUM REKAYASA GENETIKA

UJI SEGREGASI BIJI TEMBAKAU (Nicotiana tabacum)


TRANSGENIK YANG MENGANDUNG GEN MmCu-ZnSOD
PADA GENERASI T1

Kelompok 1:

Hanifah Fuadi (P051180101)


Khoirun An Nisaa (P051180151)
Sylvere Nshimiyimana (P0501881071)

PROGRAM STUDI BIOTEKNOLOGI


SEKOLAH PASCASARJANA
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2019

1
PENDAHULUAN

Latar Belakang

Keadaan masam merupakan salah satu faktor lingkungan yang dapat membatasi
produksi pertanian. Menurut CSAR (1997), Indonesia mempunyai sekitar 47,5 juta ha
tanah Podsolik Merah Kuning yang bersifat asam dengan kelarutan aluminium (Al)
yang tinggi. Foy (1988) menjelaskan bahwa konsentrasi Al yang tinggi di dalam
tanah merupakan salah satu faktor utama yang membatasi pertumbuhan tanaman pada
tanah asam. Pada pH kurang dari 5, Al menjadi terionisasi dan menjadi sangat
beracun bagi tanaman (Kinraide dan Parker 1990; Kochian et al. 2004). Salah satu
gen yang terlibat dalam toleransi tanaman terhadap tanah asam dan Al tinggi adalah
gen SOD penyandi superoksida dismutase. Aktivitas SOD meningkat dengan adanya
cekaman abiotik, seperti intensitas cahaya tinggi dan suhu rendah (Allen et al. 1997),
aluminium (Cakmak dan Horst 1991; Du et al. 2010), kekeringan (Fu dan Huang
2001; Bian dan Jiang 2009), dan sulfur dioksida (Tseng et al. 2008). Cekaman abiotik
menginduksi timbulnya cekaman oksidatif pada tanaman akibat dari akumulasi
spesies oksigen reaktif (ROS), misalnya superoksida (Yammamoto et al. 2001; Kuo
dan Kao 2003). Spesies oksigen reaktif (ROS) merupakan bentuk oksigen yang
tereduksi oleh elektron dan memiliki sifat yang sangat reaktif. Superoksida dismutase
(SOD) merupakan enzim antioksidan yang mampu menetralkan radikal bebas dengan
cara mengkatalisis radikal superoksida menjadi molekul H2O2, sehingga SOD
menjadi salah satu sistem pertahanan terhadap radikal superoksida dari spesies
oksigen reaktif (Bowler et al. 1992; Fridovich 1995; Tseng et al. 2008).
Gen SOD telah diintroduksikan di tanaman kentang menghasilkan tanaman
kentang transgenik yang toleran terhadap cekaman aluminium secara in vitro (Luthfi
2017). Gen tersebut telah berhasil diintroduksikan ke dalam genom tanaman
tembakau (Nicotiana tabacum) sehingga menghasilkan tanaman tembakau transgenik
generasi T0 oleh Kono (Dwiningsih, 2018). Tanaman transgenik generasi T0, yaitu
galur NTS59 dan NTS68, telah melakukan penyerbukan sendiri dan menghasilkan
biji T1 (Dwiningsih, 2018). Namun, uji segregasi gen MmCu/Zn-SOD generasi T1
belum pernah dilakukan. Gen MmCu/ZnSOD yang didapat dari tanaman transgenik,
kemudian ditransformasi dengan vektor ekspresi pGWB5-MmCu/ZnSOD pada E.
coli DH5α, selanjutnya diintegrasikan gen pGWB5-MmCu/ZnSOD ke bakteri
Agrobacterium tumefaciens, perlu dilakukan segregasi untuk memastikan sifatnya
menurun pada anakannya atau tidak. Hasil analisis persilangan genetik pada tanaman
transformasi memiliki sifat resisten terhadap kanamisin sebagai penanda seleksi dan
bersegregasi sesuai hukum Mendel pada generasi F1 (Paszkowski et al. 1984).
Hukum Mendel mengenai segregasi menyatakan bahwa kedua alel dari masing-
masing sifat individu terpisah selama pembentukan gamet sehingga gamet masing-
masing individu hanya mendapat satu dari dua alel. Alel berpadu bebas pada saat
pembuahan (Mendel1865). Ratio hasil persilangan mengikuti hukum Mendel dapat
dianalisis dengan menggunakan sebaran khi-kuadrat (χ2) (Mood et al.1974). Untuk
menguji hipotesis hasil persilangan digunakan formula: H0: α1 = α2 vs H1 : α1 ≠ α2;

2
χ2= Σ [(oi – ei)2/ei]: dimana oi : hasil observasi dan ei : nilai harapan observasi. Jika
χ2 hitung ≤ χ2 tabel terima H0 dan χ2hitung > χ2 tabel tolak H0. Penerimaan H0 berarti
hasil persilangan mengikuti hukum Mendel, sedangkan penolakan H0 berarti tidak
mengikuti hukum Mendel (Winchester 1958; Mendenhall & Scheaffer 1973).

Tujuan

Penelitian ini bertujuan melakukan uji segregasi biji tembakau (Nicotiana


tabacum) transgenik yang mengandung gen MmCu/Zn-SOD pada generasi T1.

METODE
Waktu dan Tempat

Praktikum dilaksanakan pada tanggal 20 Maret 2019 di Laboratorium


Biotechnology Research Indonesia-The Netherlands (BIORIN), Pusat Antar
Universitas (PAU), Institut Pertanian Bogor (IPB).
Bahan Praktikum

Bahan yang digunakan pada praktikum adalah biji T1 tembakau transgenik, biji
tembakau wild type, bayclin 100%, air steril, media NSO, higromisin 30 mg/L.
Alat Praktikum

Alat yang digunakan pada praktikum adalah mikropipet, mikro tip, tube tabung
Eppendorf, tissue steril, petri dish, pinset, laminar.

PROSEDUR
Penanaman Biji pada Media NSO+ higromisin 30 mg/L

Biji T1 tembakau transgenik dan biji tembakau wild type dipersiapkan terlebih
dahulu. Kedua jenis biji tersebut masing-masing dimasukan kedalam tabung
Eppendorf kemudian ditambahkan larutan bayclin 100% untuk membunuh
mikroorganisme kontaminan, selanjutnya dibolak-balik selama 10 menit. Setelah
ditambahkan larutan bayclin 100% kedua biji tembakau tersebut dibilas
menggunakan air steril, proses pembilasan dilakukan selama 5 kali. Jika proses
pembilasan sudah selesai kedua biji tersebut dituangkan pada tissue steril dipetri dish
agar mempermudah dalam proses pengeringan. Kedua biji tersebut kemudian ditanam
pada media MSO+ higromisin 30 mg/L. Pada proses penanaman digunakan 20 biji T1
tembakau transgenik dan 5 biji tembakau wild type, seperti yang ditunjukkan pada
Gambar 1. Semua tahapan tersebut dilakukan dalam laminar. Kedua biji yang ditanam
pada media MSO+ higromisin 30 mg/L kemudian disimpan pada ruang inkubasi.

20 Transgenik

3
5 Wild Type

Gambar 1. Penyebaran biji tembakau Wild Type dan Transgenik.

HASIL DAN PEMBAHASAN


Gen MmCu/Zn-SOD di daerah T-DNA diletakkan di antara RB (pembatas
kanan) dan gen hpt (Hannum 2012) (Gambar 2) sehingga tanaman yang resisten
terhadap higromisin yang disandi oleh gen hpt, juga mengandung gen MmCu/ZnSOD
karena proses integrasi gen dimulai dari RB.

Peta fisik daerah T-DNA dalam pGWB-MmCu/Zn-SOD. RB: right border,


LB: left border

Gambar 2. Peta fisik daerah T-DNA dalam pGWB-MmCu/Zn-SOD. RB: right


border, LB: left border (Hannum 2012).

Gen hpt dan gen MmCu/Zn-SOD cenderung menyisip bersama-sama di dalam


genom tanaman tembakau transgenik karena lokusnya berdampingan. Analisis pola
pewarisan gen hpt pada tanaman transgenik dilakukan dengan melakukan uji
resistensi populasi tanaman tertentu terhadap antibiotik higromisin. Tanaman dari
populasi T1 yang sensitif terhadap higromisin mempunyai karakter yang sama
dengan tanaman non transgenik. Tanaman atau kecambah yang sensitif tidak mampu
bertahan pada media yang mengandung higromisin. Kecambah yang sensitif hanya
mempunyai daun kotiledon, akarnya tidak berkembang sehingga tidak ada cabang
akar. Daun kotiledon berwarna putih kekuningan, kemudian berubah menjadi cokelat.
Sebaliknya, tanaman atau kecambah yang resisten mampu tumbuh dengan baik pada

4
media seleksi yang mengandung higromisin dengan ciri-ciri akarnya berkembang
dengan rambut-rambut halus, membentuk cabang akar, dan mempunyai lebih dari
satu pasang helai daun yang berwarna hijau (Gambar 3). Berdasarkan hasil
percobaan, terdapat 6 kecambah resisten dan 9 kecambah sensitif, 5 wild type dan 4
transgenik.

Hasil Segregasi tanaman Transgenik dan Wild Type Kelompok 1

resisten sensitif

sensitif

sensitif

Wild Type semua


resisten
sensitif

sensitif resisten

Gambar 3. Hasil Segeregasi tanaman Transgenik dan Wild Type Kelompok 1.

Higromisin dihasilkan oleh Streptomyces hygroscopicus, sebuah bakteri yang


diisolasi dari sampel tanah. Sejak penemuan pada tahun delapan puluhan higromisin
telah menjadi agen seleksi standar dalam percobaan transfer gen dalam berbagai sel
prokariotik dan eukariotik (Gritz & Davies 1983; Kaster et al. 1983). Higromisin
menghambat sintesis protein pada proses penerjemahan mRNA (Cabanas et al. 1987;
Lacal & Carrasco 1983). Higromisin juga mempengaruhi proses translokasi ribosom
(Cabanas et al. 1987; Gonzalez et al. 1978; Hausner et al. 1988). Seperti antibiotik
aminoglikosida lainnya, higromisin menginduksi salah membaca aminoasil-tRNA
dengan mengikat situs ribosom A (decoding site) (Cabanas et al. 1987; Davies &
Davis 1968; Moazed & Noller 1987; Spahn & Prescott 1996).
Higromisin merupakan antibiotik aminoglikosida yang menghambat sintesis
protein dan bersifat mematikan bagi bakteri, fungi dan eukariot tingkat tinggi
(Gonzales et al. 1978). Enzim hygromycin phosphotransferase yang disandi oleh gen
hpt mampu memfosforilasi gugus hidroksil dari antibiotik higromisin (Brasileiro dan
Aragou 2001) sehingga menjadi tidak beracun bagi tanaman transgenik. Hasil analisis
Khi-kuadrat terhadap tanaman transgenik generasi T1 dan Wild Type galur Resisten
higromisin (resisten) dan Rentan higromisin (sensitif) menunjukkan bahwa gen hpt

5
bersegregasi dengan perbandingan 3:1. Nilai Khi-kuadrat untuk perbandingan 3:1
pada populasi generasi T1 dari Resisten higromisin (resisten) dan Rentan higromisin
(sensitif) masing-masing adalah 0,794 dan 2,382 (Tabel 1). Nilai tersebut jauh lebih
kecil jika dibandingkan dengan nilai Khi-kuadrat tabel, yaitu 3.841 dengan derajat
bebas satu dan taraf nyata 5%. Nilai khi-kuadrat yang lebih kecil dari nilai khi-
kuadrat tabel menunjukkan bahwa rasio pada populasi T1 sesuai dengan rasio 3:1.
Hasil tersebut menunjukkan bahwa gen hpt yang terpaut dengan gen MmCu/Zn-SOD
diwariskan mengikuti hukum Mendel.
Pola pewarisan Mendel 3:1 pada generasi T1 dari tanaman N. tabacum
transgenik menunjukkan bahwa tetua dari generasi T1 yaitu generasi T0 dari masing-
masing galur Resisten higromisin (resisten) dan Rentan higromisin (sensitif)
merupakan tanaman transgenik heterozigot untuk gen hpt dan mengandung satu
salinan gen hpt fungsional. Gen hpt dipautkan sangat dekat dengan gen MmCu/Zn-
SOD, sehingga kedua gen ini mempunyai kecenderungan diwariskan ke generasi
berikutnya secara bersamasama, sehingga kedua galur tersebut juga merupakan
heterozigot untuk gen MmCu/Zn-SOD dan mengandung satu salinan gen MmCu/Zn-
SOD. Karena T0 heterozigot, maka populasi T1 yang resisten terhadap higromisin
terdiri dari tanaman transgenik homozigot dan heterozigot untuk gen hpt dan
MmCu/Zn-SOD. Tanaman yang sensitif terhadap higromisin pada generasi T1 adalah
tanaman yang tidak mengandung gen hpt yang frekuensinya adalah 25% dari populasi
T1.

Tabel 1. Segregasi resistensi terhadap antibiotik higromisin pada populasi tembakau


transgenik generasi T1

Frekuensi percobaan Frekuensi hasi rasio mendel


Fenotip O-E (O-E)2/E
(O) (E)
Resisten higromisin
(resisten) 93 102 -9 0,794
Rentan higromisin
(sensitif) 43 34 9 2,382
2
X 3,176
Keterangan :
X2 tabel (db); α = 5%; X2(1) = 3,84

Analisis Pola Segregasi


Segregasi gen MmCuZnSOD pada tembakau transgenik generasi T1 dianalisis
menggunakan uji khi kuadrat (χ2) dengan rumus :

χ2 = Σ[(oi-ei)2/ei]

Keterangan : χ2= uji khi-kuadrat


o= observasi
e= harapan
Rasio segregasi ideal sesuai pola pewarisan Mendel pada tanaman (T1) adalah 3:1.
Kesesuaian antara nilai pengamatan dan nilai harapan dilihat dari nilai χ 2 yang

6
diperoleh. Nilai hitung χ2 dibandingkan dengan nilai tabel χ2 dengan derajat
kebebasan (p-1), bila χ2hitung < χ2tabel maka H0 diterima, jika χ2hitung > χ2tabel
maka H0 ditolak.

SIMPULAN
Pewarisan gen hpt yang terpaut sempurna dengan MmCu/Zn-SOD mengikuti
pola pewarisan Mendel dengan perbandingan 3:1 yang mengindikasikan bahwa
tanaman generasi T0 adalah heterozigot dan mengandung satu salinan gen hpt dan
MmCu/Zn-SOD. Karena T0 heterozigot, maka populasi T1 yang resisten terhadap
higromisin terdiri dari tanaman transgenik homozigot dan heterozigot untuk gen hpt
dan MmCu/Zn-SOD. Tanaman yang sensitif terhadap higromisin pada generasi T1
adalah tanaman yang tidak mengandung gen hpt yang frekuensinya adalah 25% dari
populasi T1.

DAFTAR PUSTAKA

Allen RD, Webb RP, Schake SA. 1997. Use of transgenic plants to study antioxidant
defenses. Free Radical Biol Med. 23(3):473-479.
Bian S, Jiang Y. 2009. Reactive oxygen species, antioxidant enzyme activities and
gene expression patterns in leaves and roots of Kentucky bluegrass in response
to drought stress and recovery. Sci Hort. 120:264–270.
Bowler C, Montagu MV, Inze D. 1992. Superoxide dismutase and stress tolerance.
Annu Rev Plant Physiol Plant Mol Biol. 43:83-116.
Brasileiro ACM, Aragou FJL. 2001. Marker genes for in vitro selection of transgenic
plants. J Plant Biotech. 3(3):113-121.
Cabanas MJ, Vasquez D, Modelell J. 1987. Dual interference of hygromycin B with
ribosomal translocation and with aminoacyl-tRNA recognition. Eur J Biochem
87(1): 21-27.
Cakmak I, Horst WJ. 1991. Effect of aluminium on lipid peroxidation, superoxide
dismutase, catalase, and peroxidase activities in root tips of soybean (Glycine
max). Physiol Plant 83:463-468.
[CSAR] Center for Soil and Agroclimate Research. 1997. Statistik Sumberdaya
Lahan/Tanah Indonesia dan Agroklimat. Jakarta (ID): Badan Litbang
Departemen Pertanian.
Davies J, Davis BD. 1968. Misreading of ribonucleic acid code words indiced by
aminoglycoside antibiotics. The effect of drug concentration. J Biol Chem 243
(12): 3312-3316.
Du B, Nian H, Zhang Z, Yang C. 2010. Effects of aluminum on superoxide dismutase
and peroxidase activities, and lipid peroxidation in the roots and calluses of
soybeans differing in aluminum tolerance. Acta Physiol Planta. 32(5):883-890.
Dwiningsih Y. 2018. Analisis Tanaman Tembakau Transgenik Generasi T1 yang
Mengandung Gen MmCu/Zn-SOD Penyandi Superoksida Dismutase. [tesis].
Bogor (ID): Sekolah Pascasarjana Institut Pertanian Bogor.

7
Foy CD. 1988. Plant adaptation to acid, aluminum toxic soils. Commun Soil Sci Plant
Anal 19:959-987.
Fridovich I. 1995. Superoxide dismutase. Annu Rev Biochem. 44:147-159.
Fu J, Huang B. 2001. Involvement of antioxidants and lipid peroxidant in the
adaptation of two cool-season grasses to localized drought stress. Environ Exp
Bot. 45:105–114.
Gonzales A, Jimenez A, Vazquez D, Davies JE, Schindler D. 1978. Studies on the
mode of action of hygromycin B, an inhibitor of translocation in eukaryotes.
Biochem Biophys Acta. 521:459-469.
Gritz L, Davies J. 1983. Plasmid-encoded hygromycin B resistance : the sequence of
hygromycin B phosphotransferase gene and its expression in Escherichia coli
and Saccharomyces cerevisiae. Gene 25(2-3): 179-188.
Hannum S. 2012. Isolasi, pengklonan, dan analisis ekspresi gen penyandi copper zinc
superoxide dismutase (Cu/Zn-SOD) dari Melastoma malabathricum [disertasi].
Bogor (ID): Sekolah Pascasarjana Institut Pertanian Bogor.
Hausner TP, Geigenmuller U, Nierhaus KH. 1988. The allosteric three-site model for
the ribosomal elongation cycle. New insights into the inhibition mechanisms of
aminoglycosides, hiostrepton, and viomycin. J Biol Chem 263(26): 13103-
13111.
Kaster KR, Burgett SG, Rao RN, Ingolia TD. 1983. Analysis of a bacterial
hygromycin B resistance gene by transcriptional and translational fusions and
by DNA sequencing. Nucleic Acids Res 11(19): 6895-6911.
Kinraide TB, Parker DR. 1990. Apparent phytotoxicity of mononuclear hydroxyl
aluminium to four dicotyledenous species. Physiol Plant 79:283-288.
Kochian LV, Hoekenga OA, Piñeros MA. 2004. How do crop plants tolerate acid
soils? Mechanisms of aluminum tolerance and phosphorous efficiency. Annu
Rev Plant Biol. 55:459–493.
Kuo MC, Kao CH. 2003. Aluminium effects on lipid peroxidation and antioxidative
enzyme activities in rice leaves. Biol Plant. 46:149-152.
Luthfi M. 2018. Transformasi Genetik Kentang (Solanum tuberosum L.) Kultivar
Atlantic dengan Gen MmCu/Zn-SOD Penyandi Enzim Superoxide Dismutase
[tesis]. Bogor (ID): Sekolah Pascasarjana Institut Pertanian Bogor.
Mendel G. 1865. Mendel's paper in English: Experiments in Plant Hybridization.
Druery CT, the translator; Great Britain: the Royal Horticultural Society.
translation of Mendel's paper.
Mendenhall W, Scheaffer R. 1973. Mathematical Statistics and Applications.
University of Florida. Massachusctts. Duxbury Press Scituate. p. 501.
Moazed D, Noller HF .1987. Interaction of antibiotics with functional sites in 16S
ribosomal RNA. Nature 327(6121): 389-394.
Mood AM, Graybill FA, Boes DC. 1974. Introduction to the theory of statistics. 3nd.
MC Graw-Hill Kagarusha. Tokyo. LTD. p. 107.

Paszkowski J et al.1984. Direct gene transfer to plant. EMBO J 3(12): 2717-2722.


Spahn CM, Prescott CD.1996. Throwing a spanner in the works: antibiotics and the
translation apparatus. J Mol Med 74(8): 423-439.

8
Tseng MJ, Liu CW, Yiu JC. 2008. Tolerance to sulfur dioxide in transgenic Chinese
cabbage transformed with both the superoxide dismutase containing manganese
and catalase genes of Escherichia coli. Sci Hort. 115:101-110.
Winchester AM. 1958. Genetics A Survey of the Principles of Heredity. Second
Edition. Stetson University. Cambridge. The Riberside Press. p.65.
Yammamoto Y, Kobayashi Y, Matsumoto H. 2001. Lipid peroxidation is an early
symptom triggered by aluminium, but not the primary cause of elongation
inhibition in pae roots. J Plant Physiol. 125:199-208.