Anda di halaman 1dari 91

BUKU PANDUAN PRAKTIKUM

BIOKIMIA

LABORATORIUM DASAR PROSES KIMIA


DEPARTEMEN TEKNIK KIMIA
FAKULTAS TEKNIK UNIVERSITAS INDONESIA
DEPOK 2019
KATA PENGANTAR

Puji syukur kami panjatkan ke hadirat Allah Swt, karena dengan rahmat dan
hidayahNya kami dapat menyelesaikan penyusunan buku petunjuk praktikum Biokimia ini.
Praktikum Biokimia merupakan salah satu mata kuliah dasar yang diberikan
departemen Teknik Kimia FTUI pada semester genap. Buku petunjuk praktikum Biokimia
ini dibuat dengan maksud membantu mahasiswa agar lebih mudah mendalami materi praktikum
yang akan dilaksanakan.
Kemudian pada kesempatan ini kami ingin menyampaikan ucapan terima kasih yang
sebesar-besarnya kepada semua pihak yang telah membantu dalam penyusunan buku ini.
Kami menyadari bahwa buku ini masih jauh dari sempurna, oleh karena itu kami dengan
senang hati menerima kritik dan saran yang membangun.
Akhimya kami mengharapkan semoga buku ini dapat memberikan manfaat bagi para
pembacanya.

Depok, 15 Januari 2019


Editor,

Eko Anjang Budi P


DAFTAR ISI

KATA PENGANTAR ............................................................................................................... 2


DAFTAR ISI.............................................................................................................................. 3
TATA TERTIB PRAKTIKUM ................................................................................................. 4
ASPEK KESELAMATAN ........................................................................................................ 6
I. Pemanasan....................................................................................................................... 6
II. Penyaringan..................................................................................................................... 7
III. Pembacaan skala ......................................................................................................... 8
IV. Pencucian alat .............................................................................................................. 8
SUSUNAN PENULISAN LAPORAN PRAKTIKUM BIOKIMIA ........................................ 9
MODUL 1 REAKSI-REAKSI PADA HIDROKARBON ...................................................... 11
MODUL 2 ANALISIS POLISAKARIDA ALAMI ................................................................ 22
MODUL 3 IDENTIFIKASI SIFAT FISIKA DAN KIMIA MINYAK................................... 29
MODUL 4 EKSTRAKSI DNA DARI KACANG HIJAU ...... Error! Bookmark not defined.
MODUL 5 EKSTRAKSI DAN KUANTIFIKASI PROTEIN DARI SUMBER MAKANAN 3
MODUL 6 PERHITUNGAN MIKROSKOPIS ...................................................................... 15
MODUL 7 KLOROFIL DAN KAROTENOID ...................................................................... 21
MODUL 8 TEKNIK ASEPTIK DAN PEMBUATAN BIAKAN MURNI ............................ 28
MODUL 9 ESTIMASI PANJANG DAN KONSENTRASI DNA ......................................... 36
MODUL 10 POLYMERASE CHAIN REACTION (PCR) .................................................... 42
TATA TERTIB PRAKTIKUM

1. Semua praktikan wajib mengenakan jas lab yang berwarna putih selama
melaksanakan praktikum.
2. Semua praktikan wajib hadir 10 menit sebelum tes awal dimulai, dan menandatangani
daftar hadir.
3. Semua praktikan wajib menyerahkan berkas Laporan Pendahuluan dan Jurnal
Praktikum kepada asisten sebelum praktikum dimulai. Berkas tersebut dapat diminta
lagi kepada asisten setelah mengikuti tes awal.
4. Semua praktikan wajib mengikuti tes awal sebelum percobaan dilakukan sampai
asisten yang bertanggung jawab menilai bahwa yang bersangkutan pantas dan mampu
melaksanakan modul percobaan yang telah ditentukan. Apabila praktikan tidak
mengikuti tes awal, percobaan dinyatakan GUGUR. Tes awal berlangsung 10-20
menit.
5. Semua praktikan wajib mencatat semua hasil pengamatan dari percobaan yang
dilakukan di dalam Jurnal Praktikum. Pada akhir percobaan semua hasil pengamatan
harus diketahui dan ditandatangani oleh asisten.
6. Laporan Praktikum harus diserahkan kepada asisten satu minggu setelah praktikum.
Keterlambatan penyerahan akan dikenai sanksi yaitu tidak boleh mengikuti praktikum
pada hari penyerahan Laporan Praktikum.
7. Laporan praktikum yang belum memenuhi persyaratan harus diperbaiki, dan
diserahkan kepada asisten yang bersangkutan paling lambat satu minggu setelah
dinyatakan perluperbaikan.
8. Peminjaman alat-alat praktikum harus seijin petugas laboratorium dan dikembalikan
kepada petugas dalam keadaan yang sama.
9. Sebelum meninggalkan laboratorium, praktikan harus membersihkan meja kerja dan
alat-alat praktikum serta mengatur kembali letak bahan dan alat praktikum.
10. Penggunaan alat-alat dan pemakaian bahan kimia harus hati-hati, tidak boleh sampai
ada bahan kimia yang tercecer atau tumpah.
11. Kerusakan alat atau bahan yang terbuang yang terjadi karena kesalaha kerja dan atau
kelalaian praktikan, wajib diganti oleh praktikan dengan alat/bahan yang sama.
12. Bersikap sopan pada petugas laboratorium dan asisten.
13. Ketidakhadiran praktikan pada waktu yang telah dijadwalkan mendapatkan sanksi
dinyatakan GUGUR, kecuali ada alasan kuat seperti musibah/kemalangan yang tidak
terhindarkan.
14. Ketidakhadiran karena sakit, percobaannya dapat dilakukan di luar jadwal praktikum
dengan persetujuan asisten, setelah mendapat ijin dari Dosen Kordinator Praktikum.
Dispensasi penjadwalan ulang karena sakit hanya diperbolehkan satu kali selama
periode praktikum.
15. Ketentuan lulus praktikum:
− Telah mengikuti tes awal dan menyerahkan Laporan Pendahuluan dan Jurnal
sebelum praktikum dimulai.
− Telah melaksanakan semua percobaan pada semester yang sama dan dinyatakan
lulus oleh asisten.
− Menyerahkan laporan praktikum untuk semua percobaan yang telah dilaksanakan
dan dinilai oleh asisten.
− Lulus ujian akhir praktikum.
ASPEK KESELAMATAN

Untuk memperoleh hasil percobaan yang benar maka haruslah diketahui lebih dulu
cara-cara pokok dalam penggunaan alat-alat laboratorium.

I. Pemanasan
Kebanyakan dari proses pemanasan dalam laboratorium dilakukan dengan
menggunakan alat pembakar gas, meski demikian untuk beberapa hal dipakai peralatan oven.
Pembakaran atau bunsen seperti tergambar di bawah ini pada umumnya memiliki sebuah
katup pengatur gas dan pengatur udara.
Untuk menyalakan bunsen, dilakukan tahap sebagai berikut :
1. Katup udara dalam keadaan tertutup dan katup gas terbuka.
2. Nyalakan dengan korek api, pada tahap ini akan dihasilkan nyala berwarna merah
yang tak terlalu panas.

3. Untuk mendapatkan nyala yang baik dan temperatur pembakaran yang lebih tinggi,
katup udara dibuka perlahan-lahan hingga didapat nyala biru.
4. Setelah selesai digunakan, matikan bunsen dengan cara menutup katup aliran gas.
5. Jika bunsen digunakan untuk memanaskan zat dalam tabung reaksi/beaker gelas, tata
caranya dapat dilihat dalam gambar di bawah ini :
Pemanasan dan pendidihan larutan Pemanasan gelas beker pada standar
dalam sebuah tabung reaksi dengan bunsen pembakar.

Perhatikan mulut tabung jangan mengarah ke wajah atau kearah orang lain !

II. Penyaringan
Penyaringan bertujuan untuk memisahkan suatu cairan dari bahan padat dengan cara
melewatkan cairan pada bahan penyaring, misalnya kertas saring. Tata cara penyaringan
adalah sebagai berikut :
- Lipat kertas saring seperti gambar di bawah ini :

(a) (b) (c)


Cara melipat kertas saring

(d)

Penyaringan
- Pasanglah di atas corong, lalu basahi kertas saring tersebut dengan air suling dan
hindari adanya rongga udara dibalik kertas saring.
- Perhatikan posisi tepi kertas saring harus 1/2 sampai 1 sentimeter dari tepi atas corong
dan jumlah endapan 2/3 dari ketinggian kertas saring (maksimum).
- Pasang corong pada penyangga dan taruhlah wadah penampung di bawahnya.
- Tuanglah cairan melalui batang pengaduk dengan hati-hati.
- Bilaslah beberapa kali dengan air suling hingga benar-benar bersih.

III. Pembacaan skala


Pada alat-alat pengukur volume cairan tertera tanda garis-garis melingkar yang
menunjukkan batas tinggi cairan pada volume tertentu. Sebagai batas pembacaan adalah
bagian permukaan lengkung cairan, kecuali untuk cairan yang berwarna pekat/gelap, dibaca
pada bagian atas permukaan lengkung cairan. Untuk lebih jelasnya dapat dilihat pada gambar
di bawah ini:

IV. Pencucian alat


Alat-alat yang digunakan dalam laboratorium kimia harus dalam keadaan bersih. Alat
yang bersih dapat diketahui bila permukaannya dibasahi maka akan terdapat suatu lapisan
cairan yang merata. Adanya lemak atau debu akan menyebabkan lapisan tersebut tidak
merata.
Pencucian/pembersihan alat dilakukan dengan cara pencucinya dengan ditergen dan
bila perlu digosok dengan sikat dan akhimya dibilas dengan air suling. Untuk mencuci alat-
alat yang sangat kotor digunakan larutan Kalium dikromat dalam asam sulfat. Cara membuat
larutan tersebut dapat ditanyakan pada asisten.
SUSUNAN PENULISAN LAPORAN PRAKTIKUM BIOKIMIA

PENULISAN LAPORAN PENDAHULUAN DAN JURNAL

PENULISAN LAPORAN PRAKTIKUM


A. KULIT LUAR
B. ISI
MODUL 1
REAKSI-REAKSI PADA HIDROKARBON

I. Tujuan Percobaan
- Menguji kelarutan dan flammability hidrokarbon
- Mengetahui sifat-sifat kimia dan reaksi-reaksi pada hidrokarbon

II. Teori
Banyaknya jenis senyawa organik tidak terlepas dari kemampuan atom karbon untuk
mengikat satu sama lain dan jumlah unsur-unsur yang mampu membentuk ikatan dengan
gugus karbon yang sudah ada. Untuk menyederhanakan masalah ini, maka disepakati bahwa
senyawa hidrokarbon adalah senyawa dengan ikatan hidrogen dan karbon saja.
Hidrokarbon memiliki jumlah ikatan yang sangat banyak, tetapi dapat dikelompokkan
sesuai dengan ciri khas strukturnya. Dimana struktur-struktur ini juga disesuaikan dengan
kereaktifan kimia secara umum. Sehingga tiap kelompok dapat dikelompokkan dari struktur
maupun kereaktifannya. Pada percobaan ini, praktikan akan mengujicobakan kereaktifan
kimia dari hidrokarbon jenuh, tidak jenuh dan aromatik.

Stuktur Hidrokarbon
Hidrokarbon dikatakan jenuh apabila jumlah hidrogen yang terikat pada karbonnya
sudah maksimal. Hal ini terjadi bila atom karbon terikat satu sama lain dengan ikatan tunggal
atau yang dikenal sebagai ikatan sigma (). Etana merupakan contoh hidrokarbon jenuh
berdasarkan kriteria ini.

H H

H C C H

H H

Gambar 2.1 Struktur hidrokarbon, Etana

Hidrokarbon tak jenuh memiliki jumlah hidrogen yang terikat lebih sedikit daripada
jumlah maksimal yang mampu diikatnya. Senyawa jenis dipastikan memiliki ikatan rangkap
sehingga jumlah total ikatan kovalen pada tiap atom karbon sebanyak empat. Contoh
senyawa jenis ini adalah etilen dan asetilen
H H

C C H C C H

H H Acethylene
Ethylene

Gambar 2.2 Struktur Etilen dan Asetilen

Ikatan karbon rangkap pada etilen terdiri dari sebuah ikatan  seperti yang terdapat
pada hidrokarbon jenuh dan sebuah ikatan jenis pi (). Keduanya bersama-sama membentuk
ikatan rangkap. Sedangkan acetilen memiliki ikatan rangkap tiga yang terdiri dari satu ikatan
 dan dua ikatan .
Hidrokarbon aromatik memiliki ikatan yang unik antara karbonnya yang susah untuk
dideskripsikan. Pada benzene, salah satu jenis hidrokarbon aromatik, semua ikatan karbon-
karbonnya (6 ikatan) identik. Dua contoh jenis ikatan benzene, a dan b, memiliki ikatan
tunggal dan double yang bervariasi.

(a) (b) (c)

Gambar 2.3 Struktur benzena

Akan tetapi, keduanya mewakili jenis molekul yang berbeda. Strutur c, yang
menggunakan lingkaran dalam heksagon, dapat lebih diterima. Lingkaran ini mewakili enam
elektron yang terdistribusi secara merata pada ikatan  aromatik di keenam atom karbonnya.
Ikatan yang diwakili oleh sisi-sisi hexagonal adalah ikatan . Struktur c dapat digunakan
untuk mewakili semua jenis ikatan karbon-karbon dalam benzen secara benar.

Kereaktifan Hidrokarbon
Ikatan  pada hidrokarbon jenuh (alkana) sangat stabil sehingga sangat tidak reaktif.
Pada temperatur tinggi, hidrokarbon jenuh bereaksi dengan oksigen (pembakaran). Pada
reaksi tersebut, ikatan karbon-karbon diputus dan produknya adalah karbondioksida dan air.
Jika pembakarannya tidak efisien, maka yang terbentuk adalah karbon monoksida atau
bahkan karbon tunggal (soot). Tetapi secara umum hidrokarbon jenuh terbakar dengan lebih
efisien daripada jenis hidrokarbon lainnya.
Ikatan karbon-hidrogen dari alkana dapat digantikan oleh halogen. Persamaan reaksi
yang umum dengan bromin adalah sebagai berikut :
heat
R H + Br2 R Br + HBr (2.1)

Perhatikan bahwa HBr adalah produk dari reaksi tersebut. Untuk bereaksi dengan
halogen diperlukan heat ataupun energi yang ringan.
Ikatan  pada hidrokarbon tak jenuh (alkena dan alkuna) bersifat reaktif dan
mempermudah terjadinya reaksi tambahan. Pada reaksi ini, sebuah molekul seperti bromin
membentuk dua ikatan tunggal karbon-bromin yang setara dengan energi ikatan . Etilen
bereaksi dengan bromin membentuk 1,2-dibromoetana.

H H
H H

C C + Br2 Br C C Br (2.2)
H H
H H
(colorless) (red-brown) (colorless)

Reaksi tersebut dapat terjadi pada suhu ruang. Sebagai hasilnya, karakteristik warna
merah kecoklatan pada bromin menghilang. Perlu diperhatikan juga bahwa tidak terbentuk
HBr seperti pada reaksi substitusi hidrokarbon jenuh pada reaksi ini. Acetilen yang memiliki
dua ikatan  juga mengalami reaksi lanjutan :
H H

H C C H + 2Br Br C C Br (2.3)
Br Br
(colorless) (red-brown)
(colorless)

Ikatan  juga merupakan pusat serangan oleh oxidizing agents. Sebagai contoh, larutan
potasium permanganat yang netral bereaksi dengan alkena dan akuna sehingga menghasilkan
dialkohol. Secara visual, reaksi ini diikuti dengan hilangnya warna ungu dari potasium
permanganat dan terbentuknya warna coklat sebagai wujud dari manganese dioxide.
Percobaan untuk menguji reaksi tak jenuh disebut test Baeyer.
OH OH

3 RHC CHR + 2 KMnO4 + 4 H2O 3R C C R + 2MnO2 (s) + 2 KOH


(purple) (brown)
H H (2.4)

Jaringan  dari senyawa aromatik dipertahankan selama reaksi. Bahkan grup yang
sudah jenuh yang terikat pada cincin benzene bisa diserang oleh axidizing agents dengan
energy yang sangat besar. Produk yang selalu dihasilkan ketika alkyl group tunggal terikat
pada cincin benzene adalah asam benzoid.
CH2CH2CH3 CO2H

oxidazing
+ 2 CO2 + 3 H2O (2.5)
agent

Benzoic Acid

Atom hidrogen dari benzene bisa disubstitusikan oleh bromin. Akantetapi, diperlukan
katalis Fe. Perhatikan bahwa reaksi berikut ini adalah reaksi substitusi dan HBr terbentuk.
Br

Fe
+ Br2
+ HBr (2.6)

III. Prosedur
III.1 Alat
 Tabung reaksi 10x 75 mm
 Tabung reaksi 16 x 150 mm
 Acetylene generator
 Pipet tetes
 Kaca arloji
 Rak tabung reaksi
III.2 Bahan
 Heptana
 1-oktana
 toluene
 xylena
 1-butanol
 karbon tetraklorida
 1% bromin dalam karbon tetraklorida
 paku payung
 1% larutan potasium permanganat
 sample hidrokarbon yang tidak diketahui
 kalsium karbida
 kertas lakmus biru
III.3 Prosedur Percobaan
Perhatikan bahwa limbah organik harus dibuang ke tempat yang tersedia.
Catatan :
1. Lakukan semua percobaan di bawah ini.
2. Percobaan A sampai D menggunakan tiga hidrokarbon yakni, heptana, 1-oktana dan
toluena. Gunakan tabung reaksi yang bersih dan kering untuk semua reaksi. Struktur
ketiga hidrokarbon tersebut adalah :

CH3

CH3(CH2)5CH3 CH2=CH(CH2)5CH3
Heptane 1-Octane Toluene

Gambar 4.1 Struktur hidrokarbon dalam percobaan


3. Kebanyakan alkana mengandung pengotor alkena. Untuk membersihkannya, alkana
dicampur dengan H2SO4 dengan perbandingan alkana : H2SO4 = 3:1. Terbentuk
lapisan, dimana lapisan bawah yang lebih gelap (H2SO4) dipisahkan. Lapisan alkana
yang tersisa diperlakukan ulang dengan H2SO4 hingga tidak terbentuk lagi lapisan
yang lebih gelap. Setelah itu, alkana dicuci dengan air. (Hati-hati dengan larutan
H2SO4, dikerjakan hanya oleh orang yang sudah berpengalaman)

A. Kelarutan Hidrokarbon.
1. Kocoklah secara perlahan 0.5 ml heptana dengan 5ml pelarut air dalam tabung reaksi
16x150 mm untuk menguji kelarutannya. Catatlah hasil pengamatan Anda.
2. Ulangi langkah 1dengan sampel 1-Oktana dan toluena, masing-masing dengan
takaran yang sama.
3. Ganti pelarut dengan 1-butanol dan ligroin (campuran alkana), ulangi langkah 1 dan
2 di atas dengan takaran yang sama.

B. Flammability Hidrokarbon
Hati-hati : hidrokarbon sangat mudah terbakar, dan uapnya sangat ekplosif di
udara. Berhati-hatilah dengan apinya. Jangan menambah kuantitas dari
hidrokarbon selain daripada yang sudah ditentukan.
1. Teteskan 3 tetes dari salah satu jenis sampel hidrokarbon pada kaca gelas, dengan
menggunakan korek, nyalakanlah hidrokarbon tersebut.
2. Amati type dan warna nyalanya, karbon yang terdapat dalam nyala tersebut dan
jumlah residu yang tertinggal.
3. Ulangi langkah di atas untuk kedua sampel hidrokarbon lainnya.
4. Catat hasil pengamatan Anda.

C. Perilaku Bromin dalam Karbon Tetraklorida.


1. Masukkan 1ml bromin dalam karbon tetraklorida dalam tabung reaksi kecil.
2. Tambahkan 10-20 tetes dari sampel hidrokarbon, perhatikan perubahan warnanya.
3. Bila tidak terjadi perubahan warna setelah tetes ke-20, tambahkan iron tack, dan
biarkan selama 5 menit.
4. Bila masih tidak terdapat perubahan warna, panaskan larutan tersebut dalam water
bath panas selama 15-20 menit.
5. Untuk mengetes terdapatnya kandungan hidrogen bromid, letakkan kertas lakmus
biru lembab di mulut tabung reaksi.
6. Ulangi percobaan dengan kedua sampel hidrokarbon lainnya.
7. Catatlah hasil pengamatan Anda.

D. Reaksi dengan Potassium Permanganat


1. Tempatkan 1ml sampel hidrokarbon dalam tabung reaksi kecil.
2. Tambahkan 3 tetes dari larutan 1% potasium permanganat.
3. Kocok tabung reaksi tersebut, perhatikan semua perubahan yang terjadi. Berapa
waktu yang dibutuhkan sebelum perubahan terjadi?
4. Ulangi dengan sampel hidrokarbon lainnya.
5. Catat hasil pengamatan Anda.

E. Pengelompokkan Zat
1. Dapatkan sampel hidrokarbon yang tidak diketahui dari asisten praktikum Anda.
2. Lakukan tes untuk menggelompokkann sampel-sampel tersebut menjadi hidrokarbon
saturated, unsaturated dan aromatik.

F. Preparasi dan Sifat-Sifat Kimia dari Acetylene.


1. Perhatikan alat percobaan acetylene yang terdiri dari sebuah botol kering 250 ml
dengan dua buah karet stopper, sebuah saluran dropping, tubing kaca dan karet yang
sesuai. (Lihat Gambar).
2. Beberapa potongan kalsium karbid (CaC2) dimasukkan dalam botol kering tersebut.
3. Penambahan air yang berhati-hati dan sedikit demi sedikit akan menghasilkan gas
acetylene.
4. Untuk mengeringkan tabung reaksi 16x150mm yang mengandung 10 tetes dari
larutan 1% bromin dalam karbon tetraklorida, tambahkan sekitas 3ml karbon
tetraklorida. Alirkan acetylene ke larutan tersebut. Perhatikan perubahan yang
terjadi.
5. Untuk tabung reaksi 16x150 mm yang mengandung 3 tetes dari larutan 1%
potasium permanganat, tambahkan sekitar 3ml air. Alirkan acetylene ke larutan
tersebut hingga warna permanganatnya menghilang. Jika reaksinya lamban, kocok
dan teruskan dengan aliran acetylene. Ulangi hingga terjadi penghilangan warna.
Perhatikan Perubahan yang terjadi.
6. Catatlah hasil pengamatan Anda.

IV. Potensi Bahaya


No. Alat Potensi Bahaya
1 Tabung Reaksi Pecah/meledak
2 Acetylene Generator Bocor/meledak
3 Pipet Tetes Pecah
4 Kaca Arloji Pecah/meledak
5 Rak Tabung Reaksi Patah

No. Bahan Potensi Bahaya


1 Heptana Dapat menyebabkan gangguan pada kulit jika terpapar.
Dapat menyebabkan akibat yang fatal jika tertelan atau
memasuki saluran pernapasan.
Sangat beracun bagi mahluk dalam air dengan dampak
jangka panjang.
Dapat menyebabkan rasa mengantuk dan pusing.
Mudah terbakar.
2 1-oktana Dapat menyebabkan gangguan pada kulit jika terpapar.
Dapat menyebabkan akibat yang fatal jika tertelan atau
memasuki saluran pernapasan.
Mudah terbakar jika terkena panas atau api.
3 Toluena Dapat menyebabkan gangguan pada kulit jika terpapar.
Dapat menyebabkan akibat yang fatal jika tertelan atau
memasuki saluran pernapasan.
Sangat beracun bagi mahluk dalam air dengan dampak
jangka panjang.
Dapat menyebabkan rasa mengantuk dan pusing.
Mudah terbakar.
4 Xylena Dapat menyebabkan gangguan pada kulit jika terpapar.
Dapat menyebabkan akibat yang fatal jika tertelan atau
memasuki saluran pernapasan.
Sangat beracun bagi mahluk dalam air dengan dampak
jangka panjang.
Dapat menyebabkan rasa mengantuk dan pusing.
Mudah terbakar.
5 1-butanol Dapat menyebabkan gangguan pada kulit jika terpapar.
Dapat menyebabkan akibat yang fatal jika tertelan atau
memasuki saluran pernapasan.
Sangat beracun bagi mahluk dalam air dengan dampak
jangka panjang.
Dapat menyebabkan rasa mengantuk dan pusing.
Mudah terbakar.
6 Karbon Tetraklorida Iritasi bila terkena mata dan kulit
Bahaya bila tertelan dan terhirup
7 Bromin Oksidator yang kuat.
Mudah terbakar.
Korosif.
Dapat menyebabkan iritasi pada mata dan kulit.
Dapat menyebabkan iritasi sistem pencernaan bila
tertelan.
Dapat menyebabkan iritasi sistem pernapasan bila
terhirup.
Dapat menyebabkan gangguan saraf, jantung, hati, dan
ginjal.
8 Paku payung Tertusuk.
9 Potasium permanganat Oksidator yang kuat.
Mudah terbakar.
Korosif.
Dapat menyebabkan iritasi pada mata dan kulit.
Dapat menyebabkan iritasi sistem pencernaan bila
tertelan.
Dapat menyebabkan iritasi sistem pernapasan bila
terhirup.
11 Kalsium Karbida Dapat menyebabkan gangguan pada kulit jika terpapar.
Dapat menyebabkan akibat yang fatal jika tertelan atau
memasuki saluran pernapasan.
Dapat menyebabkan kebakaran jika terpapar oksigen
atau panas.

V. Pertanyaan
Berikan produk hasil dari reaksi berikut ini :
heat
a. CH3CH2CH3 + O2

b.
CH3

heat
KMnO4
CH3

c.
CH2CH3

heat
KMnO4

d.
H3C CH3
Br2
C C
CCl4
H3C CH3

e.
Br2
CH3C CCH2CH3
CCl4

f.
KMnO4
CH3CH2CH2CH=CH2
g.
CH3

Br2
Fe

CH3

h.
CaC2 + H2O

VI. Format Laporan dan Pengumpulan


A. Kelarutan Hidrokarbon
No. Data yang diambil Hasil Pengamatan
1 0,5 ml heptana + 5 ml air
2 0,5 ml 1-oktana + 5 ml air
3 0,5 ml toluena + 5 ml air
4 0,5 ml heptana + 5 ml ligroin
5 0,5 ml 1-oktana + 5 ml ligroin
6 0,5 ml toluena + 5 ml ligroin
7 0,5 ml heptana + 5 ml 1-butanol
8 0,5 ml 1-oktana + 5 ml 1-butanol
9 0,5 ml toluena + 5 ml 1-butanol

B. Flammability Hidrokarbon
No. Data yang diambil Hasil Pengamatan
1 3 tetes heptana + api
2 3 tetes 1-oktana + api
3 3 tetes toluena + api

C. Perilaku Bromin dalam Karbon Tetraklorida


No. Data yang diambil Hasil
Pengamatan
1 1 ml 1% bromin dalam karbon tetraklorida + 10-
20 tetes heptana
2 1 ml 1% bromin dalam karbon tetraklorida + 10-
20 tetes 1-oktana
3 1 ml 1% bromin dalam karbon tetraklorida + 10-
20 tetes toluena

D. Reaksi dengan Potassium Permanganat

Hasil
No. Data yang diambil Waktu
Pengamatan
Reaksi
1 ml heptana + 3 tetes larutan 1% potassium
1
permanganat
1 ml 1-oktana+ 3 tetes larutan 1% potassium
2
permanganat
1 ml toluena + 3 tetes larutan 1% potassium
3
permanganat

E. Pengelompokkan Zat

Hasil
No. Data yang diambil Waktu
Pengamatan
Reaksi
1 3 tetes hidrokarbon + api -
2 0,5 ml hidrokarbon + 5 ml 1-butanol -
1 ml 1% bromin dalam karbon tetraklorida
3 -
+ 10-20 tetes hidrokarbon
1 ml hidrokarbon + 3 tetes larutan 1%
4
potassium permanganat

F. Preparasi dan Sifat-sifat Kimia dari Acetylene.


Hasil
No. Data yang diambil
Pengamatan
(10 tetes larutan 1% bromin dalam tetraklorida + 3
1
ml karbon tetraklorida) + gas acetylene
(3 tetes larutan 1% potassium permanganat + 3 ml
2
air) + gas acetylene

VII. Daftar Pustaka


Tim Penyusun, 2006. Buku Panduan Praktikum Kimia Organik. Departemen Teknik Gas dan
Petrokimia Universitas Indonesia. Depok.
Fessenden, Ralph J., and Fassenden, Joans S., 1982, Organic Chemistry, 2nd ed., Williard
Grant Press/PWS Publisher, Masachusetts, USA.
MODUL 2
ANALISIS POLISAKARIDA ALAMI

I. Tujuan Percobaan
- Mengkarakterisasi gula: monosakarida dan polisakarida
- Menganalisis polisakarida alami

II. Teori
Monosakarida
Secara umum, ciri-ciri dari monosakarida adalah sebagai berikut:
- Sebuah molekul yang terdiri dari C, H, dan O dengan rasio 1:2:1 [CH2O)n].
- Sebagian besar monosakarida pada protoplasma adalah berupa 3-karbon gula
(triosa), 5-karbon gula (pentosa), atau 6-karbon gula (heksosa)
- Gula yang merupakan monosakarida juga dikarakterisasi oleh apapun yang
mengandung aldehid (aldosa) atau grup keton (ketosa)
Sebagian besar monosakarida dikenal sebagai heksosa, karena terdiri atas 6-rantai atau
cincin karbon. Atom-atom hidrogen dan oksigen terikat pada rantai atau cincin ini secara
terpisah atau sebagai gugus hidroksil (OH). Ada tiga jenis heksosa yang penting dalam ilmu
gizi, yaitu glukosid, fruktosa, dan galaktosa. Ketiga macam monosakarida ini mengandung
jenis dan jumlah atom yang sama, yaitu 6 atom karbon, 12 atom hidrogen, dan 6 atom
oksigen. Perbedaannya hanya terletak pada cara penyusunan atom-atom hidrogen dan oksigen
di sekitar atom-atom karbon. Perbedaan dalam susunan atom inilah yang menyebabkan
perbedaan dalam tingkat kemanisan, daya larut, dan sifat lain ketiga monosakarida tersebut.
Monosakarida yang terdapat di alam pada umumnya terdapat dalam bentuk isomer dekstro
(D). Struktur kimianya dapat berupa struktur terbuka atau struktur cincin. Jenis heksosa lain
yang kurang penting dalam ilmu gizi adalah manosa. Monosakarida yang mempunyai lima
atom karbon disebut pentosa, seperti ribosa dan arabinosa.

Polisakarida
Secara umum, ciri-ciri dari polisakarida adalah sebagai berikut:
- Banyak jenis berbeda dari polisakarida yang diketahui. Dan pati, glikogen, serta
selulosa adalah jenis polisakarida yang penting dalam sistem kehidupan.
- Ketiga jenis polisakarida tersebut terbuat dari subunit glukosa yang tergabung akibat
adanya perpindahan air (kondensasi) untuk membentuk ikatan glikosida.
- Ketiga jenis polisakarida tersebut berbeda dalam hal struktur dan juga sifat-sifat
kimianya.
Adapun sifat-sifat dari ketiga jenis polisakarida yang penting dalam sistem kehidupan
tersebut, dilampirkan pada Tabel 2.1, sebagai berikut:

Tabel 2.1 Perbedaan jenis polisakarida


Jenis Glikogen Pati Selulosa
Dihasilkan oleh Sel hewan Sel tumbuhan Sel tumbuhan
Fungsi Polisakarida penyimpan yang mungkin Polisakarida
terdeposit pada granula yang cukup struktural yang
besar di dalam sel. meliputi sel
dinding tumbuhan
Jenis ikatan Ikatan alpha-glikosida (glikogen lebih Ikatan beta-
glikosida bercabang dibandingkan dengan pati) glikosida (tidak
mudah terpecah di
alam, selulosa
bersifat sangat
kuat dan
merupakan zat
yang tahan lama.

Polisakarida merupakan polimer molekul-molekul monosakarida yang berupa rantai


lurus dan bercabang. Polisakarida dapat dihidrolisis oleh enzim-enzim tertentu dan
diantaranya dihasilkan oligosakarida. Pada bahan makanan ada dua macam polisakarida yaitu
polisakarida yang berfungsi sebagai penguat tekstur (struktural) seperti selulosa,
hemiselulosa, pektin dan lignin atau yang disebut serat, dan polisakarida sumber energi
seperti pati, dekstrin, glikogen dan fruktan (Winarno, 1997).

Hidrolisis
Pemecahan ikatan glikosida melibatkan penambahan air dinamakan proses hidrolisis.
Peristiwa ini dapat dilakukan dengan memanaskan polisakarida dalam air dan/atau asam kuat.
Enzim mengkatalisis reaksi hidrolitik yang sama dalam larutan normal tanpa kondisi ekstrim.

Kontrol dalam Percobaan


Sebuah kontrol positif atau negatif dalam prosedur percobaan dibuat dalam rangka
untuk memastikan bahwa hasil percobaan diperoleh bukan karena:
- Kesalahan sistematik
- Kesalahan eksperimental
Dalam kontrol positif, sebuah efektor positif meliputi variasi uji, termasuk di dalamnya.
Sedangkan pada kontrol negatif, variasi uji tidak termasuk didalamnya dan diharapkan hasil
bersifat negatif.

III. Prosedur
III.1 Alat
 Tabung reaksi
 Rak Tabung Reaksi
 Tusukan gigi (1 pack)
 Pipet pasteur
 Boiling water bath

III.2 Bahan
 Saliva
 1M glukosa
 0,5% pati
 Larutan Benedict
 6M HCl
 5M NaOH
 Na2CO3

III.3 Prosedur Percobaan


Bagian I
1. Ambil saliva pada beaker yang telah disediakan.
2. Tandai 4 (empat) tabung reaksi, dengan label A, B, C, dan D,
3. Isi keempat tabung reaksi tersebut dengan komposisi masing-masing tabung adalah
sebagai berikut:
- Tabung A: 15 ml H2O + 30 tetes saliva
- Tabung B: 30 tetes saliva + 15 ml pati
- Tabung C: 15 ml H2O + 30 tetes pati
- Tabung D: 15 ml pati + amilase
4. Inkubasi keempat tabung tersebut pada suhu 37oC dalam jangka waktu 1 jam.
5. Tambahkan 20 tetes larutan Benedict (setelah 1 jam).
6. Panaskan selama 5 menit pada boiling water bath.
7. Observasi dan catat perubahan warna yang terjadi.
Bagian II
1. Tandai 4(empat) tabung reaksi, dengan label E, F, G, dan H.
2. Isi keempat tabung dengan komposisi masing-masing tabung adalah sebagai berikut:
- Tabung E: 15 ml H2O
- Tabung F: 15 ml larutan pati
- Tabung G: 1 tusukan gigi yang telah dipecah menjadi bagian-bagian yang cukup
kecil + 15 ml H2O
- Tabung H: 15 ml larutan glukosa
3. Panaskan keempat tabung tersebut dalam boiling water bath selama 15 menit dan
kemudian biarkan dingin
4. Tambahkan 20 tetes larutan Benedict pada semua tabung
5. Catat warnanya
6. Panaskan dalam boiling water bath selama 5 menit
7. Catat warnanya

Bagian III
1. Tandai 4 (empat) tabung reaksi, dengan label I, J, K, dan L.
2. Isi keempat tabung reaksi dengan komposisi sebagai berikut:
- Tabung I: 15 ml H2O + 10 ml 5N HCl
- Tabung J: 15 ml larutan pati + 10 ml 5N HCl(*)
- Tabung K: 1 tusukan gigi yang telah dipecah menjadi bagian-bagian kecil + 10
ml 5N HCl
- Tabung L: 15 ml larutan glukosa + 10 ml 5N HCl
3. Panaskan dalam boiling water bath selama 15 menit dan kemudian dinginkan
4. Tambahkan Na2CO3 secara bertahap, sampai pembentukan gelembung berhenti
5. Tambahkan 20 tetes larutan Benedict
6. Panaskan dalam boiling water bath selama 5 menit
7. Catat warnanya

(* ) PERHATIAN! Praktikan seharusnya selalu menambahkan asam ke dalam air,


bukan air ke dalam asam.
(**) PERHATIAN! Letakkan mulut tabung cukup jauh dari praktikan
(***) PERHATIAN! Jangan tambahkan NaOH terlalu banyak, karena reaksi terjadi
sangat cepat.
IV. Potensi Bahaya
No. Alat Potensi Bahaya
1 Tabung Reaksi Pecah/meledak
2 Rak Tabung Reaksi Patah
3 Tusukan Gigi Tertusuk
4 Pipet Pasteur Pecah
5 Boiling Water Bath Meledak/Terpapar tubuh

No. Bahan Potensi Bahaya


1 Saliva Dapat menularkan penyakit.
2 Larutan benedict Dapat menyebabkan gangguan pada kulit jika terpapar.
Dapat menyebabkan akibat yang fatal jika tertelan atau
memasuki saluran pernapasan.
3 Asam Klorida (HCl) Sangat korosif dan toksik.
Dapat menyebabkan iritasi bila terkontak dengan mata
atau terhirup.
4 Natrium Hidroksida Dapat menyebabkan gangguan pada kulit jika terpapar.
(NaOH) Dapat menyebabkan akibat yang fatal jika tertelan atau
memasuki saluran pernapasan.
Sangat beracun bagi mahluk dalam air dengan dampak
jangka panjang.
Dapat menyebabkan rasa mengantuk dan pusing.
Mudah terbakar.
5 Natrium Karbonat Dapat menyebabkan gangguan pada kulit jika terpapar.
(Na2CO3) Dapat menyebabkan akibat yang fatal jika tertelan atau
memasuki saluran pernapasan.
Sangat beracun bagi mahluk dalam air dengan dampak
jangka panjang.
Dapat menyebabkan rasa mengantuk dan pusing.

V. Pertanyaan
1. Untuk masing-masing bagian dalam percobaan, tentukan dan terangkan, manakah
yang merupakan tabung kontrol negatif, tabung kontrol positif, dan tabung uji!
2. Apakah kandungan dari larutan Benedict? Reaksi apakah yang terjadi di dalamnya?
3. Mengapa tabung reaksi perlu untuk dipanaskan setelah penambahan larutan
Benedict? Jelaskan!
4. Mengapa glukosa disebut juga reducing sugar/ gula pengurang?
5. Untuk bagian I, apa yang dapat anda simpulkan terkait saliva? Apa yang anda
harapkan untuk menjadi hasil, jika anda menggunakan tusukan gigi dan juga larutan
pati dalam percobaan?
6. Tuliskan reaksi yang merupakan hasil dari pembentukan gelembung ketika Na2CO3
ditambahkan dalam percobaan. Mengapa reaksi ini dibutuhkan? Jelaskan!
7. Gambarkan struktur dari:
a. Glukosa
b. Ikatan glikosida pada pati dan Selulosa
c. Reaksi hidrolisis

VI. Format Laporan dan Pengumpulan


Bagian I

Hasil
No. Data yang diambil Perubahan
Pengamatan
Warna
1 Tabung A: 15 ml H2O + 30 tetes saliva
2 Tabung B: 30 tetes saliva + 15 ml pati
3 Tabung C: 15 ml H2O + 30 tetes pati
4 Tabung D: 15 ml pati + amilase

Bagian II
Perubahan
warna
Perubahan
setelah
No. Data yang diambil warna
ditambahkan
setelah
larutan
dipanaskan
benedict
1 Tabung E: 15 ml H2O
2 Tabung F: 15 ml larutan pati
Tabung G: 1 tusukan gigi yang telah
3 dipecah menjadi bagian-bagian yang
cukup kecil + 15 ml H2O
4 Tabung H: 15 ml larutan glukosa

Bagian III
No. Data yang diambil Perubahan
Warna
1 Tabung I: 15 ml H2O + 10 ml 5N HCl
2 Tabung J: 15 ml larutan pati + 10 ml 5N HCl
Tabung K: 1 tusukan gigi yang telah dipecah menjadi
3
bagian-bagian kecil + 10 ml 5N HCl
4 Tabung L: 15 ml larutan glukosa + 10 ml 5N HCl

VII. Daftar Pustaka


Ozoren, Nesrin. Ugur, Sibel. Aslan, Tolga. Seker, Tungcay. Atay, Cigdem.,2008.Cell Biology
Lab Manual. Departement of Molecular Biology and Genetics: Bogazici University,
Istanbul.
Winarno, F.G., 1997. Kimia Pangan dan Gizi. Cet. ke-8. P. T. Gramedia Pustaka
Utama, Jakarta.
MODUL 3
IDENTIFIKASI SIFAT FISIKA DAN KIMIA MINYAK

I. Tujuan Percobaan
- Melakukan analisa kelarutan dan kejenuhan lemak
- Menentukan jumlah asam lemak bebas yang terkandung dalam minyak goreng

II. Pendahuluan
Lemak dan minyak merupakan senyawaan trigliserida atau triasgliserol, yang berarti
“triester dari gliserol”. Jadi lemak dan minyak juga merupakan senyawaan ester. Hasil
hidrolisis lemak dan minyak adalah asam karboksilat dan gliserol. Asam karboksilat ini juga
disebut asam lemak yang mempunyai rantai hidrokarbon yang panjang dan tidak bercabang
(Miswar, 2001).

H2C O C R

HC O C R'
O

H2C O C R''

Minyak merupakan campuran dari ester asam lemak dengan gliserol. Proses
pembentukannya adalah sebagai beriku :

Trigliserida mengandung asam dengan 8 sampai 12 karbon atom dan terdiri dari
campuran beberapa jenis asam yang berbeda. Jika sebagian besar asam tersebut tidak jenuh,
maka gliserida tersebut berupa cairan dan diklasifikasikan sebagai minyak. Gliserida yang
mengandung asam jenuh yang lebih banyak memiliki titik leleh yang lebih tinggi dan
diklasifikasikan sebagai lemak.
Komposisi asam lemak dalam trigliserida terdiri atas asam lemak jenuh dan asam
lemak tidak jenuh. Asam lemak jenuh adalah asam lemak yang tidak mempunyai ikatan
rangkap, sedangkan asam lemak tidak jenuh adalah asam lemak yang mempunyai satu atau
lebih ikatan rangkap. Sumber asam lemak jenuh banyak terdapat dalam hewan (lemak
hewani) seperti asam palmitat dan asam stearat. Sedangkan, asam lemak tidak jenuh
kebanyakan berasal dari tanaman (lemak nabati) dan beberapa diantaranya merupakan asam
lemak esensial seperti asam oleat, asam linoleat dan asam linolenat. Asam lemak tidak jenuh
dapat menghilangkan air brom karena adisi brom pada ikatan rangkap.

-C=C- + Br2 –> -C-C-

Hidrolisis lemak atau minyak dengan basa untuk menghasilkan gliserol dan garam dari
asamnya dikenal sebagai proses saponifikasi. Sabun adalah garam-garam dari asam
karboksilat berantai panjang. Garam sodium dan potasium larut dalam air, sedangkan garam
dari magnesium, kalsium, dan besi tidak terlarut dalam air.
O

H2C O C R
CH2OH RCO2Na
O

HC O C R' + 3 NaOH CHOH + R'CO2Na


O R''CO2Na
CH2OH

H2C O C R''

Minyak adalah salah satu kelompok yang termasuk pada golongan lipid yaitu senyawa
organik yang terdapat di alam serta tidak larut dalam air, tetapi larut dalam pelarut organik
non-polar, misalnya dietil eter (C2H5OC2H5), Kloroform (CHCl3), benzena dan hidrokarbon
lainnya. Lemak dan minyak dapat larut dalam pelarut yang disebutkan di atas karena lemak
dan minyak mempunyai polaritas yang sama dengan pelarut tersebut. Bahan-bahan dan
senyawa kimia akan mudah larut dalam pelarut yang sama polaritasnya dengan zat terlarut.
Tetapi polaritas bahan dapat berubah karena adanya proses kimiawi. Misalnya asam lemak
dalam larutan KOH berada dalam keadaan terionisasi dan menjadi lebih polar dari aslinya
sehingga mudah larut serta dapat diekstraksi dengan air. Ekstraksi asam lemak yang
terionisasi ini dapat dinetralkan kembali dengan menambahkan asam sulfat encer (10 N)
sehingga kembali menjadi tidak terionisasi dan kembali mudah diekstraksi dengan pelarut
non-polar.

Minyak murni umumnya bersifat netral, sedangkan minyak yang sudah tengik bersifat
asam. Hal ini disebabkan minyak mengalami hidrolisis dan oksidasi menghasilkan aldehida,
keton, dan asam-asam lemak bebas. Proses ketengikan pada lemak atau minyak dipercepat
oleh adanya cahaya, kelembaban, pemanasan, aksi mikroba, dan katalis logam tertentu seperti
fe, Ni atau Mn. Sebaliknya zat-zat yang dapat menghambat terjadinya proses ketengikan
disebut antioksidan. Misalnya tokoferol (vitamin E), asam askorbat (vitamin C), polifenol,
hidroquinon, dan flavonoid

III. Prosedur
III.1 Alat
 Tabung reaksi 16x150 mm
 Tabung reaksi 10x75 mm
 Peraltan refluks
 Pipet tetes
 Glass stirring rod
 Gelas Beaker

III.2 Bahan
 Minyak biji kapas
 Heksana
 Karbon tetraklorida
 Larutan 5% bromin dalam karbon tetraklorida
 etanol 95%
 Larutan NaOH
 Larutan HCl konsentrasi tinggi
 Kalsium klorida 0.1M
 Magnesium klorida 0.1M
 Besi (III) klorida 0.1M
 Larutan ammonium molybdate 0.2 M
 Asam nitrat 6M
 Kertas lakmus atau kertas penguji pH
 Minyak mineral.

III.3 Prosedur Percobaan


A. Menentukan Kelarutan Minyak
1. Masukkan masing-masing 0.5ml (sekitar 10 tetes) minyak biji kapas ke empat buah
tabung reaksi 16x150 mm.
2. Tambahkan 1ml air ke tabung pertama, 1ml etanol ke tabung kedua, 1ml heksana ke
tabung ketiga dan 1ml karbon tetraklorida ke tabung keempat.
3. Kocoklah tabung-tabung reaksi tersebut, catatlah kelarutan dari masing-masing
larutan dalam tabung reaksi.
4. Tambahkan maing-masing 5 ml pelarut tambahan
5. Kocoklah dengan kencang masing-masing tabung, amatilah apakah minyaknya
terlarut sekarang.
6. Catatlah hasil pengamatan Anda.

B. Menentukan Ketakjenuhan Trigliserida


1. Gunakanlah 2ml dari larutan antara karbon tetraklorida dan minyak biji kapas yang
dipraktekkan dalam percobaan A untuk percobaan ini.
2. Tambahkan tetes demi tetes larutan bromin 5% dalam karbon tetraklorida.
3. Hitunglah jumlah tetesan yang diperlukan untuk menghasilkan efek warna bromin
terhadap larutan tersebut.
4. Larutkan 0.1 g crisco ke dalam 1ml karbon tetraklorida.
5. Ulangi langkah 2 dan 3.
6. Catatlah hasil pengamatan Anda.

C. Menentukan Jumlah Asam Lemak


1. Buat larutan KOH dalam etanol 0.1 N dalam labu 100 mL. Titrasi dengan larutan
HCl 0,1 N.
2. Buat campuran benzena dan etanol dengan perbandingan 1:1 dalam erlenmeyer,
kemudian masukan erlenmeyer ini ke dalam air panas sambil digoyang-goyang,
sampai campuran menjadi homogen.
3. Titrasi larutan (benzena + etanol) dengan KOH 0,1 N hingga larutan berubah warna
dari bening jadi ungu.
4. Sementara itu, timbanglah 1 g minyak goreng dalam erlenmeyer.
5. Campurkan larutan hasil titrasi dengan minyak goreng, kemudian teruskan titrasi
sampai terbentuk warna merah.
6. Catat volume titran yang ditambahkan.

Maka dapat dihitung nilai asam (acid value) dari minyak goreng dengan:

BM KOH (56.11) * T * N
NILAI ASAM  (3.2)
W
dengan:
 T = volume titran KOH yang ditambahkan pada titrasi CPO
 N = normalitas KOH
 W = berat sampel CPO yang dititrasi

D. Sabun
Perhatian : Sodium hidroksida adalah senyawa kaustik, jangan menyentuh senyawa ini.
Bilaslah tangan Anda segera bila terasa bersabun. Sodium hidroksida akan menyebabkan
iritasi mata dan kebutaan. Bersihkan segera peralatan yang terkontaminasi.

D.1. Persiapan
1. Larutkan 5g sodium hidroksida dalam 10ml air distilasi dan dalam 25ml etanol dalam
labu erlenmeyer 125ml, masukan trigliserida sebanyak 5 gr kedalam labu refluk.
2. Tambahkan beberapa boiling chip dalam labu tersebut.
3. Siapkan alat refluks seperti yang ditunjukkan gambar 14. Mintalah asisten Anda untuk
mengecek peralatan Anda.
4. Reflukkan isi dalam labu selama sekitar 30 menit atau hingga larutannya menjadi
jernih dan homogen.
5. Pindahkan larutan yang bersabun tersebut dari panas, dinginkan labunya dan
tambahkan sekitar 80ml larutan sodium klorida berkonsentrasi tinggi.
6. Aduk larutan tersebut secara menyeluruh dan kumpulkan sabun yang terpresipitasi
dengan filtrasi hisap.

D.2. Perlengkapan
1. Siapkan larutan 1g sabun (dari hasil refluks sebelumnya) dalam 50ml air distilasi
mendidih.
2. Siapkan larutan yang sama dengan sabun komersil dan deterjen.

D.3. Sifat Alkalinitas


1. Uji pH dari tiap larutan dengan kertas lakmus .
2. Catatlah hasil pengamatan Anda.

D.4. Sifat Emulsi


1. Tempatkan masing-masing 3 tetes minyak mineral dalam 4 tabung reaksi.
2. Masukkan 5 ml air distilasi dalam tabung pertama, 5ml larutan sabun (hasil ujicoba)
dalam tabung kedua, 5ml larutan sabun komersil dalam tabung ketiga dan 5ml larutan
deterjen dalam tabung keempat.
3. Kocoklah masing-masing tabung selama semenit
4. Catatlah hasil pengamatan Anda.

D.5. Pengaruh dari Garam Logam


1. Masukkan masing-masing 5ml dari larutan sabun ujicoba anda dalam 3 buah tabung
reaksi.
2. Tambahkan 2ml larutan kalsium klorida 0.1M dalam tabung pertama, larutan
magnesium klorida 0.1M dalam tabung kedua dan larutan besi(III) klorida 0.1M
dalam tabung ketiga.
3. Catatlah hasil percobaan Anda
4. Ulangi percobaan ini dengan larutan sabun komersil dan larutan deterjen.

E. Tes Kualitatif Phosphate dalam Deterjen


1. Percobaan uji fosfat sangat sensitif. Oleh karena itu, bilaslah tabung reaksi Anda
sampai benar-benar bersih, atau sebaiknya gunakanlah tabung reaksi baru lainnya.
2. Tambahkan sekitar 60mg fosfat (sebanyak sekitar satu butir beras) dalam tabung
reaksi
3. Tambahkan 8 tetes HNO3 6M. Deterjen yang mengandung karbonat akan
menyebabkan terjadinya buih ketika HNO3 ditambahkan. Bila hal ini terjadi,
tambahkan terus tetes demi tetes HNO3 hingga buih tidak terbentuk lagi. Setelah itu,
tambahkan lagi 8 tetes HNO3.
4. Bila deterjennya dalam wujud cair maka gunakanlah sekitar 15-20 tetes dalam
percobaan ini.
5. Dengan magnet pengaduk, campurlah larutan tersebut dengan merata.
6. Pindahkan sekitar 5-6 tetes larutan tersebut ke dalam tabung reaksi lain.
7. Tambahkan 2 tetes larutan ammonium molybdate 0.2M, dan hangatkan tabung dalam
air panas selam sekitar 5 menit.
8. Bila terdapat kandungan fosfat maka akan timbul presipitan kuning.

IV. Potensi Bahaya


No. Alat Potensi Bahaya
1 Tabung Reaksi Pecah/meledak
2 Peralatan refluks Pecah/meledak
3 Pipet Tetes Pecah
4 Glass stirring rod Pecah
5 Gelas Beaker Pecah
No. Bahan Potensi Bahaya
1 Minyak biji kapas Dapat tertelan.
2 Heksana Dapat menyebabkan gangguan pada kulit jika terpapar.
Dapat menyebabkan akibat yang fatal jika tertelan atau
memasuki saluran pernapasan.
Sangat beracun bagi mahluk dalam air dengan dampak
jangka panjang.
Dapat menyebabkan rasa mengantuk dan pusing.
Mudah terbakar.
3 Karbon tertraklorida Iritasi bila terkena mata dan kulit
Bahaya bila tertelan dan terhirup
4 NaOH Dapat menyebabkan gangguan pada kulit jika terpapar.
Dapat menyebabkan akibat yang fatal jika tertelan atau
memasuki saluran pernapasan.
Sangat beracun bagi mahluk dalam air dengan dampak
jangka panjang.
Dapat menyebabkan rasa mengantuk dan pusing.
Mudah terbakar.
5 HCl Sangat korosif dan toksik.
Dapat menyebabkan iritasi bila terkontak dengan mata
atau terhirup.
6 Kalsium klorida Dapat menyebabkan iritasi pada sistem pernapasan bila
terhirup.
Dapat menyebabkan iritasi pada sistem pencernaan
ringan bila tertelan.
Dapat menyebabkan iritasi kulit ringan.
Dapat menyebabkan abrasi mekanis atau luka bakar pada
mata dari panas iritasi hidrolisis dan klorida.
7 Magnesium klorida Dapat menyebabkan iritasi pada sistem pernapasan bila
terhirup.
Dapat menyebabkan iritasi pada sistem pencernaan
ringan bila tertelan.
Dapat menyebabkan iritasi kulit ringan.
Dapat menyebabkan iritasi pada mata.
8 Besi (III) klorida Dapat menimbulkan kebakaran jika terkena bahan-bahan
yang mudah terbakar.
Dapat mengakibatkan luka bakar.
Dapat menyebabkan efek merugikan jangka panjang
dalam lingkungan air.
Sangat beracun untuk organisme air.
9 Larutan amonium Oksidator kuat.
molybdate Dapat menyebabkan mata dan kulit terbakar.
Dapat menimbulkan kebakaran jika terkena bahan-bahan
yang mudah terbakar.
Dapat menyebabkan iritasi pada sistem pernapasan bila
terhirup.
Dapat menyebabkan iritasi pada sistem pencernaan
ringan bila tertelan.
10 Asam nitrat Bersifat korosif.
Dapat menyebabkan mata dan kulit terbakar.
Dapat menimbulkan kebakaran jika terkena bahan-bahan
yang mudah terbakar.
Dapat menyebabkan iritasi pada sistem pernapasan bila
terhirup.
Dapat menyebabkan iritasi pada sistem pencernaan
ringan bila tertelan.
11 Minyak mineral Dapat menyebabkan iritasi pada sistem pernapasan bila
terhirup.
Dapat menyebabkan iritasi pada sistem pencernaan
ringan bila tertelan.

V. Pertanyaan
1. Dari semua pelarut yang dicobakan, manakah pelarut paling bagus untuk
menghilangkan noda minyak atau lemak dari pakaian ?
2. Berapa gramkah bromin yang diperlukan untuk bereaksi secara sempurna dengan
1mol trigliserida yang mengandung hanya asam oleic?

VI. Format Laporan dan Pengumpulan


Menentukan Kelarutan Minyak
No. Data yang diambil Kelarutan
1 0,5 ml minyak biji kapas + air
2 0,5 ml minyak biji kapas + etanol
3 0,5 ml minyak biji kapas + heksana
4 0,5 ml minyak biji kapas + karbon tetraklorida

Menentukan Ketakjenuhan Trigliserida


Jumlah
Tetesan 5%
Hasil
No. Data yang diambil bromin dalam
Pengamatan
karbon
tetraklorida
2 ml larutan karbon tetraklorida +
karbon tetraklorida (hasil dari
1
percobaan A) + 5% bromin dalam
karbon tetraklorida
0,1 g crisco dalam 1 ml karbon
2 tetraklorida + 5% bromin dalam karbon
tetraklorida

Menentukan Jumlah Asam Lemak


Volume
No. Data yang diambil
titran
1 Larutan KOH dalam etanol 0,1 N
2 Campuran benzena dan etanol
3 Campuran larutan 1 dan 2 + 1 g minyak goreng

VII. Daftar Pustaka


Modul Praktikum Kimia Organik Departemen Gas dan Petrokimia Universitas Indonesia
2006.
Fessenden, Ralph J., and Fassenden, Joans S., 1982, Organic Chemistry, 2nd ed., Williard
Grant Press/PWS Publisher, Masachusetts, USA.

MODUL 4
EKSTRAKSI DNA DARI KACANG HIJAU

I. Tujuan Percobaan
- Mengisolasi DNA (Deoxyribo Nucleic Acid) dari kacang hijau (bovine spleen)

II. Teori
DNA (Deoxyribo Nuceic Acid)
DNA adalah akronim dari Deoxyribo Nucleic Acid yang bila diterjemahkan kedalam
bahasa Indonesia berarti Asam Deoksiribo Nukleat. DNA merupakan senyawa kimia yang
terdapat di dalam inti sel yang sangat berperan pada proses sintesis protein untuk
pembentukan enzim, dan protein lain.
Pada tahun 1953, Francis H.C Crick dan James D. Watson, berdasarkan analisis foto
difraksi sinar X, menggambarkan struktur DNA sebagai tangga tali terpilin dan disebut
“Double Helix” (heliks ganda). Ibu tangganya terdiri atas rentetan rantai gugus gula
deoksiribosa dan gugus fosfat, sedangkan anak tangganya terdiri atas basa nitrogen, yaitu
Purin terdiri atas Adenin(A) dan Guanin (G); serta Pirimidin terdiri atas Sitosin (S) dan
Timin (T).
Basa-basa nitrogen yang menyusun anak tangga tersebut dihubungkan oleh ikatan
hidrogen yang sifat ikatannya lemah. Setiap anak tangga terdiri atas pasangan basa nitrogen
yang khas, yaitu Adenin (A) dengan Timin (T), Sitosin (S) dengan Guanin (G). Atas
penemuan mereka mengenai struktur model DNA tersebut, pada 1962, Crick dan Watson
menerima hadiah Nobel. Crick dan Watson menyimpulkan bahwa tatanan nukleotida
merupakan perangkat kode instruksi pembangunan seluruh organisme.

Fungsi DNA
DNA berfungsi menyampaikan informasi genetika dari induk ke generasi berikutnya
dan mengatur perkembangan metabolisme tubuh. Dengan demikian, dapat dikatakan bahwa
DNA adalah gen itu sendiri. DNA dapat juga mengawasi aktivitas-aktivitas sel dengan
memerintahkan pembentukan semua macam protein (enzim) di dalam sel. DNA berada di
dalam inti sel dan pada umumnya pembentukan protein terjadi pada ribosom, yaitu pada
sitoplasma. Sehingga, informasi yang ada pada DNA harus diterjemahkan dahulu oleh suatu
senyawa tertentu dan dibawa oleh senyawa tersebut dariinti ke sitoplasma. DNA akan
membentuk senyawa lain dalam menyampaikan informasi genetik yang akan memerintahkan

38
sintesis protein. Senyawasenyawa yang dibentuk oleh DNA, yaitu RNA duta, RNA transfer,
dan RNA ribosom.

Ektraksi DNA
Ekstraksi DNA adalah sebuah prosedur rutin yang dilakukan untuk mendapatkan dan
mengumpulkan DNA untuk molekuler subsekuen atau analisis forensik.
DNA diekstraksi dari sel-sel yang ada pada manusia untuk berbagai alasan. Dengan
sampel murni berupa DNA, anda dapa menguji bayi yang baru lahir untuk penyakit genetik,
menganalisis pembuktian forensik, atau mempelajari gen yang terlibat dala kanker.Secara
garis besar, tahapan untuk ekstraksi DNA adalah sebagai berikut:
1. Buka sel dengan cara dipecah/ cacah untuk menampakkan DNA
2. Hilangkan lemak membran dengan penambahan deterjen
3. Presipitasi DNA dengan alkohol. Adapun jenis alkohol yang digunakan adalah etanol
atau isopropanol (70-95%). Karena DNA tidak terlarut pada alkohol jenis tersebut, DNA
akan teragregasi secara bersama-sama, denga pemberian pellet saat proses sentrifugasi.
Tahapan ini juga berguna untuk menghilangkan garam yang larut dalam alkohol (alcohol-
soluble salt).

III. Prosedur
III.1 Alat
 Blender
 Saringan
 Tabung reaksi
 Rak tabung reaksi
 Batang lidi/ kayu
 Gelas beaker
 Wadah
 UV Spektroskopi 
 Kuvet
 Spatula
 Kertas saring
 Pipet tetes
III.2 Bahan
 Kacang hijau

 Garam/ NaCl

 Air dingin
 Deterjen cair

 NaOH 0.1 M

 Aquadest

 Enzim (Dapat berupa pelunak daging (meat tenderizer), jus nanas, atau larutan
pembersih lensa kontak)

 Alkohol 70-95% (Etanol atau Isopropanol)

 DNA Standar

III.3 Prosedur Percobaan


Secara garis besar, tahapan untuk ekstraksi DNA adalah sebagai berikut:
1. Buka sel dengan cara dipecah/ cacah untuk menampakkan DNA
2. Hilangkan lemak membran dengan penambahan deterjen
3. Presipitasi DNA dengan alkohol. Adapun jenis alkohol yang digunakan adalah etanol
atau isopropanol (70-95%). Karena DNA tidak terlarut pada alkohol jenis tersebut, DNA
akan teragregasi secara bersama-sama, denga pemberian pellet saat proses sentrifugasi.
Tahapan ini juga berguna untuk menghilangkan garam yang larut dalam alkohol (alcohol-
soluble salt).

Adapun proses detail untuk percoban ini adalah sebagai berikut:


1. Siapkan alat dan bahan yang telah ditentukan sebelumnya
2. Masukkan ½ cup kacang hijau (100 ml) dalam blender
3. Masukkan sejumput garam (kurang dari 1/8 sendok teh, kurang dari 1 ml) dalam
blender
4. Masukkan air dingin sebanyak 2 (dua) kali lebih banyak dari jumlah kacang hijau
yang sebelumnya sudah dimasukkan dalam blender (kira-kira 1 cup, 200 ml)
5. Blender kesemuanya dengan kecepatan tinggi selama 15 detik

Gambar 4.1 Ilustrasi proses blending


(Sumber:http://learn.genetics.utah.edu, 2008)
6. Blender memisahkan sel dari kacang hijau dari beberapa komponen di dalamnya,
sehingga setelah selesai di-blender, praktikan akan mendapatkan sel kacang hijau dalam
bentuk menyerupai soup.
7. Tuangkan soup sel kacang hijau hasil blender tersebut melalui saringan ke dalam
wadah yang lain, seperti gambar berikut ini.

Gambar 4.2Ilustrasi proses penyaringan


(Sumber:http://learn.genetics.utah.edu, 2008)

8. Tambahkan sekitar 2 (dua) sendok makan deterjen cair (kira-kira) 30 ml ke dalam


soup sel kacang hijau hasil saringan.
9. Aduk sehingga membentuk sebuah campuran
10. Biarkan campuran tersebut selama 5-10 menit
11. Tuang campuran ke dalam tabung reaksi, masing-masing sekitar 1/3 volume
maksimal tabung reaksi
12. Tambahkan sedikit enzim (enzim yang digunakan dapat berasal dari pelunak daging
(meat tenderizer), jus nanas, atau larutan pembersih lensa kontak) pada masing-masing
tabung reaksi
13. Aduk perlahan (Hati-hati! Jika anda mengaduk terlalu kencang/ keras, secara otomatis
anda akan merusak DNA dalam campuran tersebut)
14. Miringkan tabung reaksi tersebut dan secara perlahan-lahan tuangkan alkohol ke
dalam tabung reaksi, seperti gambar berikut ini.
Gambar 4.3Ilustrasi proses penambahan alkohol
(Sumber:http://learn.genetics.utah.edu, 2008)

15. Tuangkan alkohol (70-95%) kesamping, sehingga membentuk lapisan di atas


campuran kacang hijau
16. Tuang hingga didapati jumlah lapisan alkohol yang sama dalam tabung dengan
campuran kacang hijau
17. Kemudian amati bahwa DNA akan naik ke lapisan alkohol dari lapisan campuran
kacang hijau
18. Gunakan lidi/ batang kayu tipis untuk mendapatkan DNA yang naik ke lapisan
alkohol, seperti gambar di bawah ini

Gambar 4.4 Ilustrasi proses pengambilan ekstrak DNA


(Sumber:http://learn.genetics.utah.edu, 2008)
19. Saring DNA yang didapat dengan menggunakan kertas saring sambil menuangkan
sedikit etanol pada kertas saring.
20. Campurkan DNA yang telah disaring dengan 5 mL NaOH pada tabung reaksi,
kemudian aduk perlahan dan encerkan larutan DNA.
21. Masukkan larutan DNA yang telah diencerkan ke dalam kuvet, lalu siapkan larutan
standar aquadest untuk kuvet yang lain.
22. Lakukan spektrofotometri pada panjang gelombang 260 nm dan 280 nm dengan
menyalakan pemancar UV dan catatlah absorbansi yang terbaca pada alat.

IV. Potensi Bahaya


No. Alat Potensi Bahaya
1 Blender Meledak/terbakar
2 Tabung reaksi Meledak/pecah
3 Rak tabung reaksi Patah
4 Batang lidi/kayu Tertusuk
5 Gelas Beaker Pecah
6 UV Spektroskopi Meledak/terbakar

No. Bahan Potensi Bahaya


1 Kacang hijau Dapat tertelan/tersedak.
2 Garam/NaCl Dapat menyebabkan iritasi pada sistem pernapasan bila terhirup.
Dapat menyebabkan iritasi pada sistem pencernaan ringan bila
tertelan.
Dapat menyebabkan iritasi kulit ringan.
Dapat menyebabkan iritasi bila terkena mata.
3 Deterjen cair Dapat menyebabkan gangguan pada kulit jika terpapar.
Dapat menyebabkan akibat yang fatal jika tertelan atau memasuki
saluran pernapasan.
Sangat beracun bagi mahluk dalam air dengan dampak jangka
panjang.
Dapat menyebabkan rasa mengantuk dan pusing.
4 Alkohol Dapat menyebabkan gangguan pada kulit jika terpapar.
Dapat menyebabkan akibat yang fatal jika tertelan atau memasuki
saluran pernapasan.
Sangat beracun bagi mahluk dalam air dengan dampak jangka
panjang.
Dapat menyebabkan rasa mengantuk dan pusing.
Mudah terbakar.

V. Pertanyaan
1. Mengapa kacang hijau digunakan dalam percobaan ini? Apakah kacang hijau
merupakan sumber DNA terbaik? Jelaskan alasan anda!
2. Apakah fungsi dan tujuan penambahan garam dan deterjen pada percobaan ini?
3. Mengapa air dingin lebih baik dibandingkan dengan air hangat dalam mengekstraksi
DNA? Jelaskan!
4. Bagaimanakah sel dinding dari sel tumbuhan dapat dicacah/ pecah?
5. Jenis enzim apakah yang ditemukan di dalam pelunak daging/ jus nanas/ larutan
pembersih lensa kontak?
6. Apakah yang dapat anda lakukan untuk meningkatkan hasil DNA dalam percobaan
ini?
7. Mengapa DNA menggumpal secara bersama-sama? Jelaskan!
8. Bagaimana anda dapat mengkonfirmasi bahwa gumpalan putih berserabut yang
menempel pada lidi/ batang kayu tersebut adalah DNA?
9. Apakah mungkin bahwa gumpalan putih berserabut tersebut adalah campuran DNA
dan RNA?
10. Berapa lama daya tahan DNA? Akankah kuantitas DNA menurun dan menghilang?
Jelaskan!
11. Dapatkah anda mengekstrak DNA manusia menggunakan prosedur percobaan ini?
12. Dapatkah anda menggunakan mikroskop untuk melihat DNA yang anda ekstrak
dalam percobaan ini?

VI. Format Laporan dan Pengumpulan


No. Data yang diambil Absorbansi

1
1 DNA Standar
2 DNA kacang hijau

VII. Daftar Pustaka


Genetic Science Learning Center Team, 2008. How to Extract DNA from Anything
Living
http://learn.genetics.utah.edu/content/labs/extraction/howto/DNA_Extraction.pdf).
Genetic Science Learning Center, Utah.
K. Murray, Robert, dkk. 2003. Biokimia Harper. Penerbit Buku Kedokteran EGC,
Jakarta.
Ozoren, Nesrin. Ugur, Sibel. Aslan, Tolga. Seker, Tungcay. Atay, Cigdem.,2008.Cell
Biology Lab Manual. Departement of Molecular Biology and Genetics: Bogazici
University, Istanbul.

2
MODUL 5
EKSTRAKSI DAN KUANTIFIKASI PROTEIN DARI SUMBER MAKANAN

I. Tujuan:
Menentukan konsentrasi protein dari suatu sample yang tidak diketahui

II. Teori
Protein adalah senyawa organik kompleks berbobot molekul tinggi yang merupakan
polimer dari monomer-monomer asam amino yang dihubungkan satu sama lain dengan
ikatan peptida. Molekul protein mengandung karbon, hidrogen, oksigen, nitrogen dan
kadang sulfur serta fosfor. Protein merupakan salah satu bio-makromolekul yang penting
perananya dalam makhluk hidup. Setiap sel dalam tubuh kita mengandung protein, termasuk
kulit, tulang, otot, kuku, rambut, air liur, darah, hormon, dan enzim. Fungsi dari protein itu
sendiri secara garis besar dapat dibagi ke dalam dua kelompok besar, yaitu sebagai bahan
struktural dan sebagai mesin yang bekerja pada tingkat molekular. Beberapa protein
struktural, fibrous protein, berfungsi sebagai pelindung, sebagai contoh a dan b-keratin yang
terdapat pada kulit, rambut, dan kuku. Sedangkan protein struktural lain ada juga yang
berfungsi sebagai perekat, seperti kolagen. Protein dapat memerankan fungsi sebagai bahan
struktural karena seperti halnya polimer lain, protein memiliki rantai yang panjang dan juga
dapat mengalami cross-linking dan lain-lain. Selain itu protein juga dapat berperan sebagai
biokatalis untuk reaksi-reaksi kimia dalam sistem makhluk hidup. Makromolekul ini
mengendalikan jalur dan waktu metabolisme yang kompleks untuk menjaga kelangsungan
hidup suatu organisma. Suatu sistem metabolisme akan terganggu apabila biokatalis yang
berperan di dalamnya mengalami kerusakan.

1. Tahap utama sintesis protein


Tahap 1 : Aktivasi asam amino
Tahap ini terjadi di sitosol, bukan pada ribosom. Masing- masing dari 20 asam amino
diikat secara kovalen dengan suatu RNA pemindah spesifik dengan memanfaatkan energi
ATP. Reaksi ini dikatalisis oleh enzim pengaktif yang memerlukan Mg2+ sebagai kofaktor
yang masing- masing spesifik bagi satu asam amino dan bagi tRNA-nya.

3
Tahap 2 : Inisiasi Rantai Polipeptida
RNA pembawa pesan yang membawa sandi bagi polipeptida yang akan dibentuk diikat
oleh subunit ribosom yang berukuran lebih kecil, diikuti oleh inisiasi asam amino yang diikat
oleh tRNA-nya membentuk suatu kompleks inisiasi. tRNA asam amino penginisiasi ini
berpasangan dengan triplet nukleutida spesfik atau kodon pada mRNA yang menyandi
permulaan rantai polipeptida. Dalam proses ini memerlukan guanosin trifosfat (GTP),
dilangsungkan oleh tiga protein sitosol spesifik yang dinamakan faktor inisiasi.

Tahap 3 : Pemanjangan
Rantai polipeptida diperpanjang oleh pengikatan kovalen unit asam amino berturut-
turut, masing-masing diangkut menuju ribosom dan diletakkan ke tempatnya secara benar
oleh tRNA masing-masing, yang berpasangan dengan kodonnya pada molekul RNA
pembawa pesan. Pemanjangan digiatkan oleh protein sitosol yang dinamakan faktor
pemanjangan. Energi yang diperlukan untuk mengikat setiap aminoasil t-RNA yang datang
dan untuk pergerakan ribosom disepanjang RNA pembawa pesan satu kodon diperoleh dari
hidrolisis dua molekul GTP bagi setiap residu yang ditambahkan ke polipeptida yang sedang
tumbuh. Terdapat 3 faktor penunjang yaitu Tu, Ts, dan G.

Tahap 4 : Terminasi dan pembebasan


Terminasi polipeptida didisyaratkan oleh satu diantara tiga triplet terminasi (UAA,
UAG, dan UGA) dimana triplet tersebut tidak menyandi asam amino manapun. Sekali
ribosom mencapai kodon terminasi, ada tiga faktor pengakhir (terminasi) atau faktor
pembebas, yaitu protein R1, R2, dan S, yang kemudian turut menyebabkan (1) penguraian
hidrolitik polipeptida dari ujung tRNA terakhir dan melepaskannya dalam bebtuk bebas, (2)
pelepasan tRNA terakhir yang sekarang kosong dari tempat P, dan (3) dissosiasi ribosom 70S
menjadi subunit 30S dan 50S nya siap untuk memulai rantai polipeptida yang baru.

Tahap 5 : pelipatan dan pengolahan


Untuk memperoleh bentuk aktifnya secara biologis, polipeptida harus mengalami
pelipatan menjadi konfirmasi tiga dimensi yang benar. Sebelum dan sesudah pelipatan,
polipeptida baru dapat mengalami pengolahan oleh kerja enzimatik untuk melepaskan asam
amino penginisiasi, dan mengikat gugus fosfat, metil, karboksil atau gugus lain pada residu
4
asam amino tertentu, atau untuk mengikat gugus oligosakarida atau gugus prostetik.
Perubahan yang terjadi tersebut dinamakan modifikasi pasca translasi, dimana pengolahannya
bergantung pada proteinnya.

2. Struktur protein
Suatu asam amino-α terdiri atas:
1. Atom C α. Disebut α karena bersebelahan dengan
gugus karboksil (asam).
2. Atom H yang terikat pada atom C α.
3. Gugus karboksil yang terikat pada atom C α.
4. Gugus amino yang terikat pada atom C α.
5. Gugus R yang juga terikat pada atom C α.

Ada 4 tingkat struktur protein yaitu struktur primer, struktur sekunder, struktur tersier
dan struktur kuartener.
a. Struktur primer
Struktur primer adalah urutan asam-asam amino yang
membentuk rantai polipeptida. Struktur primer protein bisa
ditentukan dengan beberapa metode: (1) hidrolisis protein
dengan asam kuat (misalnya, 6N HCl) dan kemudian
komposisi asam amino ditentukan dengan instrumen amino
acid analyzer, (2) analisis sekuens dari ujung-N dengan menggunakan degradasi Edman, (3)
kombinasi dari digesti dengan tripsin dan spektrometri massa, dan (4) penentuan massa
molekular dengan spektrometri massa.
b. Struktur sekunder
Struktur sekunder protein bersifat reguler, pola lipatan berulang dari rangka
protein. Pada struktur sekunder, protein sudah mengalami interaksi intermolekul,
melalui rantai samping asam amino. Analisa defraksi sinar-X merupakan cara yang baik
untuk mempelajari struktur sekunder protein serabut.

Kekuatan yang menstabilkan struktur protein

5
Beberapa interaksi nonkovalen yang secara individual lemah, namun secara numerik
cukup kuat menstabilkan konformasi protein. Kekuatan ini mencakup iktan hidrogen,
interaksi hidrofobik, interaksi elektrostatik dan kekuatan van der Walls.
1. Ikatan hidrogen
Residu dengan gugus polar R umumnya terdapat pada permukaan protein globuler,
dimana residu tersebut membentuk ikatan hidrogen terutama dengan molekul air. Di bagian
lain, residu aminoasil pada tulang punggung membentuk ikatan hidrogen antara satu dgn
yang lain.
2. Interaksi hidrofobik
Interaksi ini meliputi gugus nonpolar R pada residu aminoasil yang dalam protein
globular thipikal berada dalam bagian interior protein. Pembentukan interaksi ini digerakkan
secara entropis. Keseluruhan bentuk yang sferis kasar mengurangi daerah permukaan.
Konsentrasi residu nonpolar dalam bagian interor protein menirinkan jumlah residu
permukaan dan memaksimalkan peluang bagi lapisan tipis molekul air permukaaan untuk
membentuk ikatan hidrogen antara satu dengan yang lainnya yaitu suatu proses yang
berkaitan dengan peningkatan entropi. Berkebalikan, lingkungan nonpolar membran biologik
lebih memberikan peluang bagi residu permukaaan yang hidrofobik yang gugus nonpolar R
nya berpartisipasi dalam interaksi hidrofobik dengan rantai samping akil ester asil lemak pada
lapisan ganda membran.
3. Interaksi elektrostatik
Interaksi elektrostatik atau ikatan garam dibentuk antar gugus yang muatannya
berlawanan seperti gugus terminal amino dan karboksil pada peptida dan gugus R bermuatan
pada residu polar aminoasil. Gugus polar spesifik yang melakukan fungsi biologis yang
esensial dapat terletak dalam celah yang menembus bagian interior protein. Karena residu
polar dapat pula berpartisipasi dalam interaksi ionik, maka keberadaan garam seperti KCL
dapat menurunkan secara bermakna interaksi ionik antar residu permukaan.
4. Interaksi van der Walls
Kekuatan van der Wall bersifat sangat lemah serta bekerja hanya pada jarak yang amat
pendek mencakup komponen yang menarik dan yang menolak. Kekuatan yang menarik
(attractive force) meliputi interaksi antar sifat bipoler yang terbentuk oleh fluktuasi monomer
distribusi elektron pada atom didekatnya. Kekuatan yang menolak (repulsive pulse) turut
berperan ketika dua buah atom datang begitu dekat sehingga orbit elektronnya saling
6
tumpang tindih. Jarak dimana kekuatan yang menarik bekerja maksimal dan kekuatan yang
menolak minimal disebut jarak kontak van der Walls.
Ikatan yang membentuk struktur ini, didominasi oleh ikatan hidrogen antar rantai
samping yang membentuk pola tertentu bergantung pada orientasi ikatan hidrogennya. Dua
pola terbanyak adalah alpha helix dan beta sheet . b-sheet itu sendiri ada yang paralel dan
juga ada yang anti-paralel, bergantung pada orientasi kedua rantai polipeptida yang
membentuk struktur sekunder tersebut. Struktur sekunder bisa ditentukan dengan
menggunakan spektroskopi circular dichroism (CD) dan Fourier Transform Infra Red
(FTIR). Spektrum CD dari puntiran-alfa menunjukkan dua absorbans negatif pada 208 dan
220 nm dan lempeng-beta menunjukkan satu puncak negatif sekitar 210-216 nm. Estimasi
dari komposisi struktur sekunder dari protein bisa dikalkulasi dari spektrum CD. Pada
spektrum FTIR, pita amida-I dari puntiran-alfa berbeda dibandingkan dengan pita amida-I
dari lempeng-beta. Jadi, komposisi struktur sekunder dari protein juga bisa diestimasi dari
spektrum inframerah.

c. Struktur tersier
Struktur tersier terbentuk karena terjadinya perlipatan (folding) rantai α-helix,
konformasi β, maupun gulungan rambang suatu polipeptida, membentuk globular, yang
struktur tiga dimensiny lebih rumit daripada protein tersebut. Interaksi intra molekuler seperti
ikatan hidrogen, ikatan ion, van der Waals, hidropobik turut menentukan orientasi struktur 3
dimensi dari protein. Beberapa protein telah dapat ditentukan struktur tersiernya, misalnya
hemoglobin, mioglobin, lisozim, ribonulease dan kimo tripsinogen. Sebagai contoh, struktur
tersier enzim sering padat, berbentuk globuler.

7
Struktur tersier dari protein enzim triosa fosfat isomerase (TPI)

d. Struktur kuartener
Beberapa protein tersusun atas lebih dari satu rantai polipeptida. Struktur kuartener
menggambarkan subunit-subunit yang berbeda dipak bersama-sama membentuk struktur
protein. Beberapa molekul protein dapat berinteraksi secara fisik tanpa ikatan kovalen
membentuk oligomer yang stabil (misalnya dimer, trimer, atau kuartomer) dan membentuk
struktur kuartener. Kemantapan struktur kuartener suatu protein oligomer disebabkan oleh
interaksi dan ikatan non-kovalen yang lemah antara masing-masing sub bagiannya.
Kemampuan untuk berhimpun diri daripada beberapa sub bagian ini merupakan ciri struktur
kuartener suatu protein oligomer. Sebagian besar protein oligomer mengalami disidiasi pada
pH tinggi atau rendah, juga bila ditempatkan dalam larutan urea atau garam berkonsentrasi
tinggi. Dalam proses denaturasi ini, protein oligomer mengalami dua proses bertingkat, yaitu
:
1. Disosiasi rantai polipeptida yang satu dengan yang lainnya
2. Merenggangnya satuan rantai polipeptida

Struktur kuartener yang terkenal adalah enzim Rubisco dan insulin. Sebagai contoh
adalah molekul hemoglobin manusia yang tersusun atas 4 subunit, yang akan berdisosiasi
pada proses pengenceran. Masing-masing sub bagian terdiri atas dua rantai polipeptida, α dan
β.

8
Struktur hemoglobin yang merupakan struktur kuartener protein

3. Percobaan berdasarkan reaksi warna:


a. Percobaan kadar-N
Kapur natron, yaitu campuran NaOH dan Ca(OH)2 dalam tabung reaksi dengan larutan
protein dipanaskan. Keluarlah Amoniak dan Amina.Lakmus merah yang dibasahi menjadi
biru.
b. Reaksi Xantoprotein
Larutan asam nitrat pekat ditambahkan dengan hati-hati ke dalam larutan protein.
Setelah dicampur terjadi pengendapan putih yang dapat berubah menjadikuning apabila
dipanaskan.. reaksi yang terjadi ialah nitrasi pada inti Benzen yang terdapata pada molekul
protein. Jadi, reaksi ini positif untuk protein, fenilalanin dan triptofan. Kulit kita bila kena
asam nitrat berwarna kuning, itu juga karena terjadi reaksi xantoprotein ini.
c. Reaksi Millon
Pereaksi Millon adalah larutan merkuro dan merkuri nitrat dalam asam nitrat, apabila
pereaksi ini ditambahkan pada larutan protein, akan menghasilkan endapan putih yang dapat
berubah menjadi merah oleh pemanasan. Pada dasarnya reaksi ini positif untuk fenol-fenol,
karena terbentuknya senyawa merkuri dengan gugus hidroksifenil yang berwarna. Protein
yang mengandung tirosin akan memberikan reaksi positif.
d. Reaksi Biuret
Beberapa reaksi uji terhadap protein, tes biuret merupakan salah satu cara untuk
mengidentifikasi adanya protein, dalam larutan basa biuret memberikan warna violet dengan

9
CuSO4 karena akan terbentuk kompleks Cu2+ dengan gugus CO dan gugus NH dari rantai
peptida dalam suasana basa. Pengendapan dengan logam diketahui bahwa protein
mempunyai daya untuk menawarkan racun. Salting out, apabila terdapat garam-garam
anorganik alam presentase tinggi dalam larutan protein, maka kelarutan protein akan
berkurang, sehingga mengakibatkan pengendapan. Pengendapan dengan alkohol,
penambahan pelarut organik seperti aseton atau alkohol akan menurunkan kelarutan protein
pada kedudukan dan distribusi dari gugus hidrofil polar dan hidrofob polar di dalam molekul
hingga menghasilkan protein yang dipol (Tim Dosen Kimia, 2011).
Pengembangan dari metode biuret adalah metode lowry. Metode lowry merupakan
teknik uji biokimia untuk mengetahui kadar total protein di dalam suatu larutan. Total
konsentrasi protein diperlihatkan melalui proporsi perubahan warna larutan sampel
dibandingkan dengan konsentrasi protein, yang dapat dihitung dengan menggunakan teknik
colorimetric. Nama Lowry sendiri diambil dari nama seorangbiochemist bernama Oliver H.
Lowry yang mengembangkan reagen pada tahun 1940.
Dalam metode ini terlibat 2 reaksi. Awalnya, kompleks Cu(II)-protein akan terbentuk
sebagaimana metode biuret, yang dalam suasana alkalis Cu(II) akan tereduksi menjadi Cu(I).
Ion Cu+ kemudian akan mereduksi reagen Folin-Ciocalteu, kompleks phosphomolibdat-
phosphotungstat (phosphomolybdotungstate), menghasilkan heteropolymolybdenum blue
akibat reaksi oksidasi gugus aromatik (rantai samping asam amino) terkatalis Cu, yang
memberikan warna biru intensif yang dapat dideteksi secara kolorimetri. Kekuatan warna
biru terutama bergantung pada kandungan residu tryptophan dan tyrosine-nya. Keuntungan
metode Lowry adalah lebih sensitif (100 kali) daripada metode Biuret sehingga memerlukan
sampel protein yang lebih sedikit. Batas deteksinya berkisar pada konsentrasi 0.01 mg/mL.
Namun metode Lowry lebih banyak interferensinya akibat kesensitifannya.
Beberapa zat yang bisa mengganggu penetapan kadar protein dengan metode Lowry
ini, diantaranya buffer, asam nuklet, gula atau karbohidrat, deterjen, gliserol, Tricine, EDTA,
Tris, senyawa-senyawa kalium, sulfhidril, disulfida, fenolat, asam urat, guanin, xanthine,
magnesium, dan kalsium. Interferensi agen-agen ini dapat diminimalkan dengan
menghilangkan interferens tersebut. Sangat dianjurkan untuk menggunakan blanko untuk
mengkoreksi absorbansi. Interferensi yang disebabkan oleh deterjen, sukrosa dan EDTA
dapat dieliminasi dengan penambahan SDS atau melakukan preparasi sampel dengan
pengendapan protein (Lowry et al., 1951).
10
Metode Lowry-Folin hanya dapat mengukur molekul peptida pendek dan tidak dapat
mengukur molekul peptida panjang (Alexander dan Griffiths, 1992). Prinsip kerja metode
Lowry adalah reduksi Cu2+ (reagen Lowry B) menjadi Cu+ oleh tirosin, triptofan, dan sistein
yang terdapat dalam protein. Ion Cu+ bersama dengan fosfotungstat dan fosfomolibdat
(reagen Lowry E) membentuk warna biru, sehingga dapat menyerap cahaya (Lowry et al.,
1951).

III. Prosedur
III.1 Alat
 Spektrofotometer
 Gelas beaker
 Tabung reaksi
 Pipet
 Mikropipet

III.2 Bahan
 Tahu
 Tempe
 Susu
 Na2CO3
 N NaOH
 NaK Tartrate
 H2O
 CuSO4.5 H2O
 Folin-Phenol 2 N

III.3 Prosedur Percobaan


1. Siapkan bahan-bahan berikut:
A. 2% Na2CO3 dalam 0.1 N NaOH
B. 1% NaK Tartrate dalam H2O
C. 0.5% CuSO4.5 H2O dalam H2O
11
D. 48 mL of A, 1 mL of B, 1 mL C
E. Phenol Reagent : 1 bagian Folin-Phenol [2 N] : 1 bagian air BSA Standard - 1
mg/ mL
2. Siapkan sampel (tempe, tahu, susu) dengan 4 konsentrasi berbeda
3. Tambahkan 2 mL larutan D pada setiap tabung
4. Inkubasikan selama 10 menit pada suhu ruang.
5. Tambahkan 0.2 mL larutan phenol reagent pada setiap tabung.
6. Vortex (melakukan pencampuran dengan bantuan vibrator) segera setiap tabung
tersebut dengan segera.
7. Inkubasikan selama 30 menit pada suhu ruang.
8. Tentukan absorbansi setiap sample menggunakan spektrofotometer pada panjang
gelombang 600 nm.
9. Plot absorbansi vs mg protein sampel untuk mendapatkan kurva kalibrasi standar.
10. Ambil sample dengan konsentrasi yang yang tidak diketahui dari asisten praktikum.
11. Ukur absorbansi sampel tersebut.
12. Tentukan konsentrasinya

IV. Potensi Bahaya


No. Alat Potensi Bahaya
1 Spektrofotometer Meledak/terbakar
2 Gelas Beaker Pecah
3 Tabung reaksi Meledak/pecah
4 Pipet dan mikropipet Meledak/pecah

No. Bahan Potensi Bahaya


1 Natrium karbonat Dapat menyebabkan gangguan pada kulit jika terpapar.
(Na2CO3) Dapat menyebabkan akibat yang fatal jika tertelan atau
memasuki saluran pernapasan.
Sangat beracun bagi mahluk dalam air dengan dampak
jangka panjang.

12
Dapat menyebabkan rasa mengantuk dan pusing.
2 Natrium Hidroksida Dapat menyebabkan gangguan pada kulit jika terpapar.
(NaOH) Dapat menyebabkan akibat yang fatal jika tertelan atau
memasuki saluran pernapasan.
Sangat beracun bagi mahluk dalam air dengan dampak
jangka panjang.
Dapat menyebabkan rasa mengantuk dan pusing.
Mudah terbakar.
3 NaK Tartrate Dapat menyebabkan gangguan pada kulit jika terpapar.
Dapat menyebabkan akibat yang fatal jika tertelan atau
memasuki saluran pernapasan.
Dapat menyebabkan iritasi pada mata dan kulit.
5 CuSO4.5 H2O Dapat menyebabkan gangguan pada kulit jika terpapar.
Dapat menyebabkan akibat yang fatal jika tertelan atau
memasuki saluran pernapasan.
Dapat menyebabkan iritasi pada mata dan kulit.
6 Folin-Phenol Dapat menyebabkan gangguan fatal pada kulit jika
terpapar.
Dapat menyebabkan akibat yang fatal jika tertelan atau
memasuki saluran pernapasan.
Dapat menyebabkan iritasi fatal pada mata dan kulit.

V. Pertanyaan
1. Jelaskan Prinsip kerja dari metode Lowry dalam menentukan konsentrasi protein
2. Jelaskan mengenai keketerbatasan metode Lowry ini

VI. Format Laporan dan Pengumpulan


No. Data yang diambil Absorbansi
1 Tempe
2 Tahu
3 Susu

13
Sampel dengan konsentrasi yang tidak
4
diketahui

VII. Daftar Pustaka


Modul Praktikum Kimia Organik Departemen Gas dan Petrokimia Universitas Indonesia
2006.
Budi, Setya. 2008. Struktur dan Fungsi Protein. Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan
Alam Universitas Sebelas Maret: Surakarta.

14
MODUL 6
PERHITUNGAN MIKROSKOPIS

I. Tujuan Percobaan
Untuk menghitung spesimen dengan menggunakan mikroskop

II. Teori

Bagian-bagian dari mikroskop cahaya

Tipe Mikroskop Cahaya


Mikroskop cahaya menggunakan cahaya tampak untuk melihat spesimen. Cahaya
tersebut akan melewati dua lensa yang akan memperbesar gambar . Sementara itu, lensa yang
ketiga berada ditempat untuk melakukan pengamatan yang dekat dengan mata pengamatan
untuk mendapatkan gambar sesungguhnya. Batas dari mikroskop ini berhubungan dengan
resolusi, iluminasi, dan keterangan. Resolusi dapat ditingkatkan menggunakan lensa imersi,
pencahayaan dan keterangan dapat ditingkatkan dengan memodifikasi area gelap, fase terang,
dan interferensi terang.
Hal-hal yang mempengaruhi kualitas mikroskop adalah sebagai berikut
 Perbesaran, derajat kebesaran dari gambar dibandingkan dengan ukuran aslinya.
Perbesaran dilakukan oleh dua lensa yaitu lensa okular (8 atau 10x) dan lensa objektif
(4, 10, 100x). Total dari perbesaran adalah hasil perkalian perbesaran kedua lensa.
 Resolusi, adalah perhitungan untuk kejelasan gambar
15
 Kemampuan untuk lihat mendetail, gambar yang diberikan dari mikroskop dapat
melihat objek secara detail.
 Keterangan, adalah kemampuan untuk melihat kedetailan dari spesimen terhadap latar
belakang.
Perbesaran maksimum didapatkan dari mikroskop cahaya adalah sebesar 400 kali.
Dengan kata lain, ukuran yang dapat dilihat minimal adalah sebesar 0,2 µm. Batas ini adalah
hasil dari difraksi oleh objek saat observasi yang disebabkan oleh interferensi cahaya oleh
gambar.

Perhitungan Mikroskopis
Ukuran linear dari spesimen yang diobservasi di mikroskop diekspresikan dalam µm
bukan dari total perbesaran. Ukuran aktual dari objek yang dilihat dibawah mikroskop dapat
di estimasi berdasarkan fakta bahwa penglihatan mikroskop dan kombinasi lensa memiliki
diameter konstan. Alat untuk pengukurannya disebut dengan hemocytometer seperti yang
terdapat pada gambar dibawah ini,

Hemocytometer dibawah mikroskop cahaya

Alat ini digunakan untuk menghitung jumlah spesimen (sel/bakteri). Metode ini banyak
digunakan dalam suatu riset. Aplikasi hemocytometer biasa ditemukan untuk menghitung
16
jumlah sel darah. Dalam percoban akan dilakukan untuk menghitung jumlah spesimen yang
digunakan.
Contoh perhitungan,
Diameter yang digunakan pada x10 lensa objektif = 2 mm
Diameter dari media yang digunakan, x40 lensa objektif = 2x10/40 mm = 0,5 mm

III. Prosedur
III.1 Alat
 Mikroskop cahaya
 Hemocytometer
 Slide mikroskop
 Coverslip
 Pipet

III.2 Bahan
 Rambut
 Dedaunan
 Safranin stain
 Methylene blue
 Etanol
 Isopropanol (to clean objective lenses)

III.3 Prosedur Percobaan


Perhitungan diameter rambut
1. Menghitung diamter media dengan hemocytometer. Gunakan lensa objektif
perbesaran 10x dan 40x. Gunakan hemocytometer berdiameter 0,05 mm. Bandingkan
nilai yang didapatkan keduanya. Apakah ada perbedaan?
2. Bersihkan slide gelas kaca mikroskop dengan etanol
3. Ambil sehelai rambut (potong kecil) dan diletakkan pada slide)
4. Berikan air sehingga menutupi rambut

17
5. Observasi sampel dengan menggunakan lensa objektif 40x. Untuk mengestimasi
ketebalan dari sampel, luruskan rambut yang menjadi spesimen. Hitung diameter dari
rambut.

Observasi sel daun


Daun muda digunakan untuk mempelajari struktur sel karena sel ini hanya teridir dari
beberapa layer.
1. Ambil sedikit bagian dari daun muda, teteskan air hingga menutupi spesimen
2. Lakukan pengamatan dengan perbesaran 40x
3. Tambahan tetesan dari safranin stain untuk membuat dinding sel lebih terlihat.
Tambahkan stain (1 tetes) untuk menutupi jaringan dari sampel yang tertutupi

Observasi sel epitel


1. Gesekan pipi dengan menggukanan tusuk gigi
2. Teteskan methylene blue pada slide hingga menutupi sel epitel
3. Lakukan pengamatan dengan perbesaran 40x
4. Gambarkan tipe sel yang didapatkan

IV. Potensi Bahaya


No. Alat Potensi Bahaya
1 Mikroskop cahaya Meledak/terbakar
2 Hemocytometer Pecah/patah
3 Slide mikroskop Meledak/terbakar
4 Pipet Meledak/pecah

No. Bahan Potensi Bahaya


1 Safranin stain Dapat menyebabkan gangguan pada kulit jika terpapar.
Dapat menyebabkan akibat yang fatal jika tertelan atau
memasuki saluran pernapasan.
Dapat menyebabkan iritasi pada mata, hati, dan ginjal.
Mudah terbakar dalam bentuk cair dan uap.

18
2 Methylene blue Dapat menyebabkan gangguan pada kulit dan mata jika
terpapar.
Dapat menyebabkan akibat yang fatal jika tertelan atau
memasuki saluran pernapasan.
Mudah terbakar.
3 Etanol Dapat menyebabkan gangguan pada kulit jika terpapar.
Dapat menyebabkan akibat yang fatal jika tertelan atau
memasuki saluran pernapasan.
Sangat beracun bagi mahluk dalam air dengan dampak jangka
panjang.
Dapat menyebabkan rasa mengantuk dan pusing.
Mudah terbakar.
5 Isopropanol Dapat menyebabkan gangguan pada kulit jika terpapar.
Dapat menyebabkan akibat yang fatal jika tertelan atau
memasuki saluran pernapasan.
Sangat beracun bagi mahluk dalam air dengan dampak jangka
panjang.
Dapat menyebabkan rasa mengantuk dan pusing.
Mudah terbakar.

V. Pertanyaan
1. Apa perbedaan dari mikroskop dengan area terang dan gelap? Apa tipe mikroskop
yang baik digunakan untuk melihat sampel?
2. Apa bagian sel yang dipengaruhi oleh safranin dan methylene blue?
3. Berapa diameter dari daun dan sel epitel?

VI. Format Laporan dan Pengumpulan


Perhitungan Diameter Rambut
No. Data yang diambil Diameter
1 Rambut pada perbesaran lensa objektif 10 x
2 Rambut pada perbesaran lensa objektif 40 x

19
Observasi Sel Daun
Gambar atau hasil pengamatan

Observasi Sel Epitel


Gambar sel epitel yang didapatkan

VII. Daftar Pustaka


Ozoren, Nesrin. Ugur, Sibel. Aslan, Tolga. Seker, Tungcay. Atay, Cigdem. Cell Biology Lab
Manual. 2008. Departement of Molecular Biology and Genetics: Bogazici University.

20
MODUL 7
KLOROFIL DAN KAROTENOID

I. Tujuan Percobaan
 Mengekstraksi klorofil dan karotenoid dari dedaunan
 Menentukan kandungan klorofil dan karotenoid

II. Teori
Sumber energi yang paling utama dari semua sumber kehidupan di alam ini adalah
matahari. Energi yang terdapat dalam sinar matahari yang memasuki biosfer dimanfaatkan
oleh sebuah proses yang dinamakan fotosintesis, yang biasanya terjadi pada tumbuh-
tumbuhan, alga, dan beberapa jenis bakteri. Fotosintesis dapat juga dikatakan sebagai proses
physico-chemical, dimana organisme yang melakukan fotosintesis menggunakan energi
cahaya untuk mensintesis senyawa-senyawa organik. Proses fotosintesis tergantung pada
sebuah set molekul protein kompleks yang berlokasi di dalam dan sekitar sebuah membran
yang sangat terorganisir. Melalui serangkaian reaksi transfer energi, mesin fotosintetik
tersebut mengubah energi cahaya menjadi sebuah bentuk stabil yang dapat bertahan selama
ratusan juta tahun.
Pada tumbuh-tumbuhan, alga, dan beberapa jenis bakteri, proses fotosintesis
menghasilkan suatu pelepasan oksigen molekular dan penghilangan karbon dioksida dari
atmosfer, yang akan digunakan untuk mensitesa karbohidrat (fotosintesis oksigenik).
Sedangkan ada beberapa jenis bakteri yang menggunakan energi cahaya untuk membuat
senyawa organik tetapi tidak menghasilkan oksigen (fotosintesis anoksigenik). Fotosintesis
menyediakan energi dan mengurangi karbondioksida yang diperlukan untuk kelangsungan
semua kehidupan di muka bumi ini, juga oksigen molekular yang sangat diperlukan untuk
kehidupan organisme yang mengkonsumsi oksigen, termasuk manusia. Juga bahan-bahan
bakar yang dibakar untuk menyediakan energi bagi aktivitas kehidupan manusia dihasilkan
oleh organisme-organisme fotosintetik pada zaman dahulu. Meskipun fotosintesis terjadi di
dalam sel atau organela yang sesungguhnya hanya berukuran beberapa mikron, tetapi proses
ini dapat berdampak pada lapisan atmosfer bumi dan iklim.

21
Pada tumbuhan-tumbuhan proses fotosintesis terjadi didalam kloroplast, dimana
organela-organela ditemukan di dalam sel. Kloroplast menyediakan energi dan karbon
tereduksi yang diperlukan untuk pertumbuhan tumbuhan dan perkembangannya, sementara
itu tumbuhan menyediakan CO2, air, nitrogen, senyawa organik, dan mineral-mineral yang
penting yang diperlukan kloroplast untuk biogenesis. Kebanyakan kloroplast berada dalam
sel daun yang spesial, dimana biasanya mengandung 50 atau lebih kloroplast tiap sel.
Fotosintesis digerakkan terutama oleh cahaya tampak (panjang gelombang dari 400
sampai 700 nm) yang terabsorb oleh molekul pigmen (terutama klorofil a dan b, dan
karotenoid).

Gambar 2.1 Struktur kimia Klorofil a

Struktur kimia dari molekul klorofil a dapat dilihat pada Gambar 4.1 Pada klorofil b,
CH3 pada cincin II digantikan oleh grup CHO. Tumbuhan akan kelihatan hijau dikarenakan
klorofil yang dimilikinya. Cahaya yang dikumpulkan oleh 200 – 300 molekul pigmen akan
yang diikat oleh protein kompleks berada di dalam membran fotosintetik.
Masing-masing klorofil ini memiliki kelebihan pada daya absorpsi terhadap panjang
gelombang tertentu seperti ditunjukkan pada Gambar 4.2.

22
Gambar 2.2. Daya absorpsi klorofil a dan b terhadap energi cahaya

Reaksi fotosintesis secara umum dibagi menjadi dua tahap, yaitu reaksi terang dan
reaksi gelap. Pada reaksi terang terjadi reaksi transfer elektron dan proton, sedangkan pada
reaksi gelap terjadi reaksi biosintesa karbohidrat dari CO2. Reaksi terang menghasilkan
sintesis ATP dan NADPH untuk membentuk senyawa organik pada reaksi gelap.
Pada reaksi terang molekul air (H2O) terurai menjadi molekul oksigen (O2) dan proton
(H ). Dalam reaksi tersebut dihasilkan energi dalam bentuk ATP dan NADP+. Kemudian, H+
+

yang dihasilkan dalam reaksi penguraian air tersebut ditangkap oleh NADP+ sehingga
terbentuk NADPH. Persamaan reaksinya adalah sebagai berikut:

(2.1)
12 H2O + ATP + 24 NADP+ 6 O2 + ATP + 24 NADPH

Reaksi terang tersebut terjadi di dalam grana. Sedangkan reaksi gelap yang
dikemukakan oleh Blackman terjadi pada stroma. Dalam reaksi gelap, ATP dan NADPH
yang terbentuk pada reaksi terang digunakan untuk pembentukan glukosa dari karbon
dioksida.
Persamaan reaksinya adalah sebagai berikut :

(2.2)
6 CO2 + 18ATP + 12NADPH  (CH2O)6 + 6 H2O

23
Jika kedua reaksi tersebut digabungkan, akan didapat persamaan reaksi umum
fotosintesis sebagai berikut :

(2.3)
6 CO2 + 12 H2O + energi cahaya C6H12O6 + 6 H2O + 6 O2

Jadi reaksi gelap hanya berlangsung jika tersedia energi kimia dan proton (H+) yang
dihasilkan oleh reaksi terang. Tanpa didahului reaksi terang, reaksi gelap tak akan
berlangsung.

III. Prosedur
III.1 Alat
 Sentrifuge
 Tabung sentrifuge
 Labu Erlenmeyer
 Vortexer
 Kuvet kaca
 Spektrofotometer
 Botol aquades
 Oven pengering

III.2 Bahan
 Daun-daunan dari tumbuhan hijau
 Aquades
 Larutan aseton 80%

III.3 Prosedur Percobaan


Persiapan Dedaunan
1. Ambil dedaunan dari pepohonan yang ada disekitar tempat tinggal Anda.
2. Keringkan dedaunan pada aliran udara panas 50oC (1-2 jam)
3. Tumbuk dengan mortar dedaunan kering tersebut hingga halus
4. Timbang berat sejumlah (sekitar 10 gram) bubuk dedaunan kering.

24
Pencucian Dedaunan
1. Larutkan dalam air suling secukupnya
2. Bagi sampel menjadi beberapa bagian sama rata untuk ditempatkan dalam tabung
sentrifuge.
3. Sentrifuge larutan tersebut dengan putaran 3300 g (6200 rpm) selama 10 menit
4. Pisahkan padatan bubuk dedaunan kering dari pelarutnya

Ekstraksi Dedaunan
1. Masukkan padatan bubuk dedaunan kering ke dalam tabung erlenmeyer lalu larutkan
dengan sejumlah volume larutan aseton 80% (rasio larutan aseton 80% dengan sampel
biasanya 1:1 atau 1:2)
2. Aduk secara merata dengan vorteks selama 30 detik (dilakukan tidak terus menerus,
tetapi setiap 5 detik)
3. Diamkan hingga 5 menit
4. Bagi sampel menjadi beberapa bagian sama rata untuk ditempatkan dalam tabung
sentrifuge.
5. Sentrifuge larutan yang terjadi (3300 g/10 menit)
6. Ambil supernatan dari hasil sentrifuge larutan di atas. Supernatan merupakan larutan
bagian atas di dalam tabung sentrifuge setelah sampel melalui proses sentrifuge.

Pengukuran Chlorophyl a
1. Masukkan kuvet kaca yang berisi sampel ke dalam spektrofotometer.
2. Masukkan juga kuvet kaca yang berisi larutan aseton 80% sebagai pembanding dalam
waktu yang hampir bersamaan dengan masuknya kuvet yang berisi sampel ke dalam
spektrofotometer.
3. Ukur absorbansi supernatan tersebut pada panjang gelombang 663 nm
4. Hitung konsentrasi chlorophyll a dalam supernatant dengan rumusan berikut:
CChl a = (A663nm) / 0.8204
(4.1)

5. Hitung jumlah khloropil a dalam padatan dengan rumusan berikut:


Chl a = CChl a x (Vaseton80%) (4.2)
25
6. Hitung kandungan chlorophyl a dalam deaunan kering dengan rumusan berikut:
Chl a content = Chl a / M bubuk dedaunan kering (4.3)

Pengukuran Carotenoid
1. Ukur absorbansi supernatan tersebut pada panjang gelombang 460 nm
2. Hitung konsentrasi Carotenoid dalam supernatant dengan rumusan berikut:
CCar = (A460nm) / 2.0
(4.4)

3. Hitung jumlah Carotenoid dalam padatan dengan rumusan berikut:


Car = CCar x (Vaseton80%) (4.5)

4. Hitung kandungan Carotenoid dalam deaunan kering dengan rumusan berikut:


Car Content = Car / M bubuk dedaunan kering
(4.6)
IV. Potensi Bahaya
No. Alat Potensi Bahaya
1 Sentrifuge Meledak/terbakar
2 Labu Erlenmeyer Pecah/patah
3 Vortexer Meledak/terbakar
4 Kuvet kaca Pecah
5 Spektrofotometer Meledak/terbakar
6 Oven pengering Meledak/terbakar

No. Bahan Potensi Bahaya


1 Aseton Dapat menyebabkan gangguan pada kulit jika terpapar.
Dapat menyebabkan akibat yang fatal jika tertelan atau
memasuki saluran pernapasan.
Dapat menyebabkan iritasi pada mata.
Dapat menyebabkan gangguan pada sistem saraf.
Sangat mudah terbakar dalam bentuk cair dan uap.

26
V. Pertanyaan
1. Pada panjang gelombang berapa klorofil diukur? Dimana letak klorofil di dalam sel?
2. Apakah kaitan antara klorofil a dengan proses fotosintesis?
3. Gambarkan struktur kimia dari klorofil b!
4. Apakah yang dimaksud dengan karotenoid? Apa fungsi  karoten dalam kaitannya
dengan kesehatan mata?

VI. Format Laporan dan Pengumpulan


No. Data yang diambil Absorbansi
1 Larutan aseton 80% (λ = 663 nm)
2 Supernatan daun (λ = 663 nm)
3 Supernatan daun (λ = 460 nm)

VII. Daftar Pustaka


Tim Penyusun, 2006. Buku Panduan Praktikum Kimia Organik. Departemen Teknik Gas dan
Petrokimia Universitas Indonesia. Depok.

27
MODUL 8
TEKNIK ASEPTIK DAN PEMBUATAN BIAKAN MURNI

I. Tujuan
 Mempraktikkan teknik aseptik dan pembuatan biakan murni

II. Teori
Pemanfaatan mikroba dalam bioteknologi umumnya bergantung pada biakan murni
yang terdiri dari spesies tunggal, dan pemeliharaan kemurniannya. Sebagian besar aplikasi
bioteknologi modern melibatkan penggunaan biakan murni. Metoda yang paling praktis dan
bermanfaat untuk mendapatkan biakan murni adalah metoda “streak plate”, dimana campuran
biakan di sebar atau dioleskan pada permukaan medium sedemikan rupa sehingga sel-sel
tunggal menjadi terpisah satu sama lainnya. Masing-masing sel tunggal akan tumbuh menjadi
suatu koloni yang merupakan biakan murni, oleh karena sel-sel yang tumbuh dalam koloni
tersebut adalah keturunan dari sel tunggal.
Teknik aseptik diperlukan dalam bekerja dengan suatu biakan mikroba murni dan
untuk menjaga/memelihara kesterilan suatu media atau larutan. Dengan teknik aseptic, ahli-
ahli bioteknologi dapat mencegah kontaminasi biakan atau larutan oleh mikroba yang tidak
diinginkan. Banyak cawan petri dan plate kultur jaringan yang digunakan untuk menumbuh-
biakan mikroorganisme terbuat dari bahan yang telah disterilkan oleh produsennya, pengisian
peralatan-peralatan ini dengan media steril membutuhkan teknik aseptic. Teknik aseptic yang
benar juga melindungi peneliti di bidang bioteknologi dari kontaminasi biakan-biakan yang
berpotensi pathogen. Termasuk dalam teknik aseptic adalah menghindari kontak antara
biakan murni, media steril, dan permukaan steril peralatan bejana dengan mikroorganisme
kontaminan. Untuk mencapai tujuan ini :
1. Tempat kerja harus dibersihkan dengan larutan antiseptic untuk mengurangi jumlah
kontaminan potensial
2. Peralatan disterilkan sebagai contoh batang ose disterilkan melalui pemanasan dengan
pembakar Bunsen sebelum dan setelah transfer biakan
3. Pekerjaan dilakukan secara cepat dan efisien untuk mengurangi waktu kontak dimana
kontaminasi pada biakan atau pekerja laboratorium dapat terjadi

28
Langkah-langkah yang biasa dilakukan dalam transfer biakan dari satu bejana/tabung
ke bejana lain adalah sebagai berikut:
1. Menempelkan jarum ose ke api
2. Membuka dan menempelkan mulut tabung biakan ke api
3. Menggunakan jarum ose, sejumlah biakan diambil dan dipindahkan ke media segar
4. Menempelkan mulut tabung biakan kea pi dan tabung ditutup kembali
5. Menempelkan kembali jarum ose ke api
Teknik yang sama digunakan untuk inokulasi ke dalam cawan petri dan plate
mikroskop, kecuali bahwa tutup cawan dan plate tidak dibakar.
Pemahaman dan pengetahuan yang menyeluruh mengenai teknik aseptic dan prosedur
pemindahan biakan merupakan persyaratan awal untuk bekerja dengan kultur mikrobiologi.
Kita akan menghemat banyak waktu dan tenaga serta menghindari kesalahan hasil jika
aturan-aturan umum dicermati ketika bekerja dengan biakan.
1. Sterilkan selalu jarum inokulasi ose dengan pembakaran sebelum menggunakannya
dan memasukkannya ke bahan biakan.
2. Bekerja selalu dekat dengan api, bila perlu bibir tabung (bahan gelas) ditempelkan
pada api sebelum memasukkan jarum ose. Langkah ini akan merusakkan sel-sel
kontaminan yang mungkin tersimpan pada bibir tabung saat transfer biakan
sebelumnya atau oleh hal lain.
3. Menjaga semua bahan biakan agar tertutup dengan baik. Jangan meletakkan penutup
tabung atau cawan petri di atas meja, karena hal ini akan memungkinkan kontaminasi
pada biakan. Ketika mentransfer koloni dari cawan petri, gunakan tutup cawan
sebagai pelindung dengan sedikit mengangkatnya sehingga jarum ose dapat
dimasukkan, tetapi permukaan media masih terlindung dari kontaminan-kontaminan
yang mungkin jatuh ke atasnya.
4. Jangan membiarkan penutup tabung atau cawan petri menyentuh apapun kecuali
wadah biakannya masing-masing. Hal ini akan mencegah kontaminasi terhadap
penutup dan biakan.
5. Gunakan cara yang tepat pada saat membuka dan memasang penutup.

29
III. Prosedur
III.1 Alat
 Batang inokulasi (jarum ose)
 Cawan petri
 Tabung reaksi tertutup 18x150 mm
 Laminar flow
 Lampu spirtus
 Inkubator pengocok (shaker)
 Inkubator (oven) 37oC
 Rak tabung reaksi

III.2 Bahan
 2x5 mL media LB cair (Luria-Bertani: 10 g/L bacto-tryptone; 5 g/L yeast-extract; 10
g/L NaCl)
 5x10 mL LB-agar (tambahkan 15 g/L bacto-agar ke dalam LB cair)
 Sampel: 5 mL biakan murni E. Coli dalam LB cair
 Alkohol
 Kertas tissue

III.3 Prosedur Percobaan


Catatan Pemimpin Praktikum
Sehari sebelum percobaan, 5 mL LB cair diinokulasi dengan kultur E. Coli. Inkubasi
disertai pengocokan E. coli pada 37oC, 150 rpm.
Seluruh pekerjaan di bawah ini dilakukan di dalam kamar steril (laminar flow). Ingat!!
Bersihkan dan sterilkan ruang laminar sebelum dan setelah bekerja di dalamnya.

A. Transfer Biakan
Hari ke satu
1. Pegang batang inokulasi (ose) antara ibu jari dan jari telunjuk, tempelkan bagian
kawat ose pada api lampu spirtus, bakar seluruh kawat hingga merah dan berpijar.

30
Biarkan kawat dingin selama 5-10 detik sebelum diteruskan ke langkah berikutnya.
Jangan kibaskan ose di udara.
2. Gunakan tangan anda yang bebas, ambil tabung yang mengandung biakan E. coli dan
perlahan-lahan kocok biakan untuk meratakan biakan. Buka tutup tabung dan
tempatkan pada jari kelingking yang bebas dari tangan yang memegang jarum ose
steril, kemudian bibir tabung dibakar pada pembakar spirtus.
3. Pegang tabung biakan dengan posisi miring, masukan ose steril dan pindahkan sedikit
biakan dari tabung ke kawat ose. Usahakan jarum ose tidak menyentuh dinding
tabung atau sisi bibir tabung selama proses pemindahan.
4. Bakar bibir tabung, dan dengan hati-hati ditutup kembali. Kemudian kembalikan
tabung biakan E. coli ke rak tabung reaksi.
5. Ambil tabung reaksi baru yang mengandung 5 mL LB cair steril. Buka dan pindahkan
tutup tabung dengan cara yang sama seperti tahap sebelumya dan mulut tabung
dibakar.
6. Masukkan jarum ose yang menganduk inokulum hidup ke dalam tabung yang
mengandung LB cair steril dan goncangkan kawat ose sehingga mikroorganisme
berpindah ke dalam medium. Keluarkan jarum ose dari dalam tabung.
7. Selanjutnya mulut tabung dibakar, ditutup kembali, dan diletakkan pada rak tabung
reaksi.
8. Kawat ose dibakar kembali untuk disimpan.
9. Berikan label pada tabung baru yang telah diinokulasi, dan tempatkan pada inkubator
pengocok, pada 37oC dengan pengocokan 150 rpm selama 1 malam.

Hari ke dua
1. Setelah inkubasi satu malam, keluarkan tabung dari inkubator.
2. Amati tabung dan gambarkan kondisinya.

B. Streak Plate
Hari ke satu
1. Berikan label pada media LB dengan informasi nama, tanggal, nama media, dan nama
sumber biakan yang akan digunakan.
2. Gunakan LB di atas untuk:
31
a. Menumbuhkan biakan E. coli dengan kedua metoda streak (kuadran dan
kontinyu) masing-masing pada satu plate LB agar.
b. Satu dari masing-masing plate agar akan digunakan sebagai kontrol.
Berikan label pada masing-masing cawan petri.

Metode Quadrant Streak


a. Gambar kuadran pada bagian bawah luar cawan petri agar.
b. Bakar batang inokulasi (kawat ose) dan biarkan dingin sebelum bersentuhan
dengan biakan. Ose yang panas akan membunuh mikroorganisme dan
menghasilkan aerosol ketika bersentuhan dengan agar dingin. Ikuti prosedur
pada percobaan bagian A (Transfer Biakan, tahap 1 s/d 4) untuk memindahkan
biakan dari media cair ke kawat ose.
c. Ambil plate agar, dan angkat sedikit tutup cawannya. Biarkan kawat ose
menyentuh permukaan agar, kemudian kawat digeser perlahan (dioleskan)
diseluruh permukaan agar dalam satu kuadran melalui gerakan streaing continue
(tidak terputus). Hindari penusukan kawat ose kedalam agar. Gunakan pantulan
cahaya untuk melihat dimana anda melakukan streaking dan inokulasi pada
agar. Area ini akan terlihat sebagai goresan-goresan redup. Hal ini akan
membantu dalam menempatkan inokulasi lebih baik.
d. Bakar jarum ose kemudian biarkan dingin, dan lakukan streak silang dari area
sebelumnya (kuadran 1) ke kuadran kedua. Selalu sterilkan ose setelah inokulasi
setiap kuadran pada cawan, hal ini akan membuhun sel-sel yang menempel pada
jarum ose dan mencegah kontaminasi pada inokulasi berikutnya.
e. Ulangi prosedur yang sama untuk setiap kuadran berikutnya, hingga semua
quadrant pada cawan terinokulasi
f. Bakar jarum ose setelah selesai

Metode Streak Continue


a. Ambil sedikit biakan inokulum pada kawat ose dengan cara yang sama seperti
percobaan bagian A (Transfer Biakan, tahap 1-4).

32
b. Sebarkan (oleskan melalui gerakan tunggal yang kontinyu (tidak terputus), terus
menerus dan dengan arah bolak-balik diseluruh permukaan agar pada setengah
area cawan.
c. Tanpa pembakaran dan tanpa mengeluarkan kawat ose, putar cawan 90o dan
lanjutkan prosedur streaking dengan cara yang sama seperti di atas pada
setengah area cawan berikutnya.
3. Siapkan inokulasi kontrol(Metode quadran streak) dimana plate agar digores dengan
hanya menggunakan kawat ose steril tanpa biakan. Cawan ini akan menjadi indikator
yang baik untuk teknik aseptik, karena apapun seharusnya tidak tumbuh pada cawan
ini.
4. Balikkan cawan untuk menghindari kondensasi air dari kultur bakteri yang telah
disebarkan di permukaan agar, letakkan cawan pada inkubator 37 oC untuk diinkubasi
selama 24-28 jam.

Gambar quadrant streak dan continuous streak


Hari ke dua
1. Setelah inkubasi selama 24-28 jam, cawan dikeluarkan inkubator.
2. Amati cawan, amati dimana anda menemukan koloni yang terisolasi dengan baik
(koloni tunggal).

IV. Potensi Bahaya


No. Alat Potensi Bahaya
1 Batang inokulasi Tertusuk
2 Cawan petri Pecah/patah
3 Tabung reaksi Pecah/patah
4 Laminar flow Meledak/terbakar
5 Lampu spirtus Meledak/terbakar/tumpah
6 Inkubator pengocok Meledak/terbakar/konselet
7 Inkubator (oven) Meledak/terbakar/konselet
8 Rak tabung reaksi Patah

33
No. Bahan Potensi Bahaya
1 E. Coli Terpapar pada tubuh praktikan.
Kontaminasi laboratorium.
2 Alkohol Dapat menyebabkan gangguan pada kulit jika terpapar.
Dapat menyebabkan akibat yang fatal jika tertelan atau memasuki
saluran pernapasan.
Sangat beracun bagi mahluk dalam air dengan dampak jangka
panjang.
Dapat menyebabkan rasa mengantuk dan pusing.
Mudah terbakar.

V. Format Laporan dan Pengumpulan


Transfer Biakan
Buatlah gambaran kondisi tabung yang mengandung LB cair steril + inokulum hidup
E. colisetelah diimkubasi 1 malam.
Gambar quadrant streak dan continuous streak
 Buatlah gambaran kondisi cawanyang mengandung LB cair steril + inokulum hidup
E. coli setelah diimkubasi 1 malam untuk metode quadrant streak.
 Buatlah gambaran kondisi tabung yang mengandung LB cair steril + inokulum hidup
E. coli setelah diimkubasi 1 malam untuk metode continous streak.

VI. Daftar Pustaka


Azhar, M. 1996. Kloning dan Penentuan Urutan Nukleotida Mutan sal4-13, Saccharomces
cereviseae. Tesis Program Master. Jurusan Kimia. Program Pascasarjana Institut
Teknologi Bandung.

Becker, J.M., Caldwell, G.A., and Zachgo, E. A., 1996. Biotechnology: A Laboratory Course.
2nd ed.USA: Academic Press.

Sambrook, J., Fritsch, E. F., and Maniatis, T. 1989. Molecular Cloning. A Laboratory
Manual. 2nd edition. Vol. 1-3. USA : Cold Spring Harbor Laboratory.

34
35
MODUL 9
ESTIMASI PANJANG DAN KONSENTRASI DNA

I. Tujuan
 Mengetahui ukuran panjang DNA dari hasil elektroforesis gel
 Mengetahui cara estimasi konsentrasi DNA dengan elektroforesis gel

II. Teori
DNA
DNA atau deoxyribonucleic acid adalah suatu bagian dari makhluk hidup yang
membawa informasi kehidupan. DNA terdiri dari dua rantai polinukleotida yang panjang
yang berbentuk double helix. Masing-masing dari rantai DNA ini terdiri dari 4 tipe nukleotida
yang saling berinteraksi antara satu dengan yang lain yaitu Adenin (A), Timin (T), Guanin
(G), dan Sitosin (C). Adenin akan selalu berinteraksi dengan timin. Sementara guanin akan
berinteraksi dengan sitosin. Panjangnya DNA yang berbentuk double helix ini dapat diwakili
dari berapa banyak pasangan basanya atau biasa disebut base pair (bp). Satu pasangan basa
atau ditulis 1 bp berarti mewakili 1 pasang basa yang berinteraksi (adenin-timin atau guanin-
sitosin). Sementara apabila ada 100 bp berarti ada 100 interaksi pasangan basa. Jika ada 1000
bp atau bisa ditulis juga 1 kbp berarti DNA tersebut memiliki panjang sama dengan 1000
interaksi antara pasangan basanya.

Gambar 1. Dua rantai DNA yang saling berinteraksi dengan ikatan hydrogen dari basa
nukelotidanya (adenin dengan timin dan guanin dengan sitosin)
36
Sumber: (Alberts, et. al., 2014)

Sebagai pembawa informasi kehidupan, DNA akan di translasi menjadi protein yang
akan berfungsi untuk berbagai macam fungsi yang ada di makhluk hidup. Kesalahan
informasi DNA yang disebabkan oleh mutase baik secara delesi ataupun frameshift dapat
menyebabkan protein yang tertranslasi menjadi tidak normal. Hal ini akan berakibat kepada
metabolisme yang ada di makhluk hidup akan berjalan tidak normal. Menariknya, seberapa
panjangnya protein yang dihasilkan tergantung dari seberapa panjang DNA-nya.

Konsentrasi DNA
Kuantifikasi jumlah DNA sangat penting dilakukan untuk mengetahui banyaknya
DNA yang didapatkan. Dengan pengukuran yang tepat, akan membantu untuk mengetahui
berapa banyaknya DNA yang perlu di tambahkan dalam proses insersi DNA yang diinginkan
ke suatu plasmid, estimasi ekspresi suatu gen, hingga mengestimasi seberapa banyak infeksi
bakteri atau virus yang ada dari seorang pasien.
Ada beberapa cara untuk melakukan kuantifikasi konsentrasi DNA diantaranya adalah
1. Pengukuran dengan spektrofotometri adalah pengukuran konsentrasi gen dengan
menggunakan spektrofotometer dengan panjang gelomban 260 nm. Dalam
pengukuran ini digunakan hokum Beer-Lambert yang menjadi dasar pengukuran
DNA. Dari hasil pengukuran bisa langsung didapatkan berapa banyak DNA yang
didapat hingga ukuran nano molar (nM).
Pengukuran dengan menggunakan fluorescent dye adalah pengukuran konsentrasi gen
dengan mengutilisasi pewarna yang dapat menempel pada DNA. Konsentrasi dapat diketahui
dari intensitas dye yang dihasilkan. Fluorescent dye yang biasa digunakan adalah ethidium
bromide yang dapat berinteraksi dengan DNA. Perhitungan konsentrasi didapatkan dengan
perbandingan intensifikasi sampel DNA dengan marker sebagai acuan.

III. Prosedur
III.1 Alat
 Microtube 1,5mL
 Inkubator, 37oC
37
 Gel electrophoresis chamber
 UV transilluminator
 Pipet (1000, 200, 20l)
 Microwave
 Labu erlenmeyer
 Cetakan agarose
 Vortex
 Microcentrifuge

III.2 Bahan
 Plasmid DNA (pCS2+ 100L, 1M/L)
 Agarose
 Ethidium bromide
 DNA marker /StyI
 6x dye
 Buffer enzim restriksi (Buffer H, Takara)
 Enzim restriksi (EcoRI)
 Air steril (DNAse free water
 Pipet tipis (1000, 200, 20l)
 Tris free base
 Disodium EDTA
 Glacial acetic acid
 Medical gloves

III.3 Prosedur Percobaan


A. Persiapan Sampel Plasmid
1. Gunakan medical gloves saat melakukan percobaan ini
2. Dalam microtube 1,5mL, campurkan reaction mixture sebagai berikut:
Dengan enzim retriksi
Bahan Volume (µL)

38
Buffer enzim retriksi 1
Enzim retriksi 0,2
Plasmid 1
Air steril 7,8
Total 10

Tanpa enzim retriksi


Bahan Volume (µL)
Buffer enzim retriksi 0
Enzim retriksi 0
Plasmid 1
Air steril 9
Total 10

3. Letakkan reaction mixture dalam inkubator 37oC selama 2 jam.

B. Pembuatan 1x buffer TAE


1. Buat 50x buffer TAE dengan campuran sebagai berikut:
Bahan Jumlah
Tris free base 242 g
Disodium EDTA 18,61 g
Glacial Acetic Acid 57.1 ml
Air steril Hingga 1 L
Total 1L
Urutan pencampuran:
Tambahkan Tris dan EDTA dan air hingga volume 700 ml. Aduk hingga larut.
Lanjutkan dengan penambahan acetic acid dan air hingga volume total menjadi 1 L.

2. Encerkan menjadi 1x buffer TAE sebanyak 1L. Simpan 50x buffer TAE sisa.

C. Pembuatan 0.8% gel agarose

39
1. Campurkan 100 mL 1x buffer TAE ke 0.8 g agarose.
2. Microwave selama 1 menit. Goyang-goyang botol/Erlenmeyer saat mencapai 30
detik. Lanjut kan microwave dan penggoyangan hingga agarose terlarutkan. (gunakan
sarung tangan tebal yang tahan panas saat langkah ini dan selanjutnya).
3. Siramkan botol dengan air dari keran secara perlahan sambil digoyangkan hingga
botol terasa hangat dan bisa dipegang oleh tangan. Tambahkan 6 µL ethidium
bromide. (hati-hati saat menggunakan ethidium bromide karena bersifat toksik dan
karsinogenik). Goyangkan botol hingga ethidium bromide tercampur dengan larutan
agarose.
4. Tuangkan larutan gel tersebut ke cetakan dan biarkan hingga mengeras.

D. Proses elektroforesis gel


1. Setelah agarose mengeras, letakkan agarose ke gel electrophoresis chamber dan
tuangkan 1x buffer TAE ke chamber hingga agarose terendam.
2. Ambil plasmid yang telah diinkubasi dan campurkan 6x Dye sebanyak 1 µL.
3. Transfer marker dan plasmid yang telah diinkubasi kedalam agarose dengan urutan
sebagai berikut,

4. Set voltase elektroforesis menjadi 100 Volt dan jalankan proses elektroforesis selama
30 menit
5. Bawa agarose ke UV transilluminator untuk diambil foto hasilnya.

IV. Potensi Bahaya


No Alat Potensi Bahaya
1 Gel electrophoresis Pecah/meledak
chamber
2 Inkubator Meledak
3 UV Transiluminator Mata terpapar sinar UV tanpa pengaman
4 Microwave Meledak

40
No Bahan Potensi Bahaya
1 Ethidium bromide Bersifat toksik dan karsinogenik.
Dapat menyebabkan iritasi pada kulit, inflamasi,
hingga kanker jika terpapar.

V. Pertanyaan
1. Mengapa enzim retriksi ditambahkan dalam percobaan ini?
2. Jelaskan pengaruh konsentrasi agarose terhadap proses elektroforesis gel?
3. Berapa panjang DNA yang didapatkan?
4. Jelaskan persamaa/perbedaan antara hasil elektroforesis antara plasmid yang
ditambahkan dengan enzim retriksi dengan yang tidak?
5. Berapa konsentrasi DNA yang didapatkan?

VI. Format Laporan


No Data yang diambil Ukuran DNA (bp)
1 Dengan enzim retriksi
2 Tanpa enzim retriksi

No Data yang diambil Konsentrasi (µM)


1 Dengan enzim retriksi
2 Tanpa enzim retriksi

VII. Daftar Pustaka


Alberts, B. (2004). Essential cell biology. New York, NY: Garland Science Pub.

Brown, T.A. (2010). Gene cloning and DNA analysis. 6th edition. Sussex: John Wiley & Sons
Ltd.

41
MODUL 10
POLYMERASE CHAIN REACTION (PCR)

I. Tujuan
 Melakukan reaksi PCR pada sampel DNA yang diuji
 Mengetahui pengaruh suhu annealing PCR terhadap konsentrasi DNA
 Mengetahui ukuran Panjang DNA dari hasil elektroforesis gel
 Mengetahui cara estimasi konsentrasi DNA dengan elektroforesis gel

II. Teori
PCR atau Polymerase Chain Reaction adalah metode untuk mendapatkan sekuens
DNA spesifik dalam jumlah yang besar. Sejak pertama kali ditemukan dan dikembangkan
oleh Kary Mullis pada tahun 1983, PCR menjadi salah satu metode penting dalam dunia
genetika. Metode ini telah meluaskan kegunaan dari analisis DNA dan menjadikan biologi
molekuler menemukan aplikasi baru seperti di bidang kesehatan, agrikultur, bioteknologi,
arkeologi, ekologi, dan forensik.
Berbeda dengan kloning gen yang dilakukan di dalam suatu organisme, PCR
dilakukan diluar makhluk hidup. Reaksi PCR dilakukan dalam tube reaksi yang
mencampurkan DNA dengan bahan reaksi lainnya seperti primer, DNA polymerase,
nukleotida, dan buffer pereaksi. Langkah dasar dari PCR terdiri dari 3 tahap yaitu tahap (1)
denaturasi (denaturation), (2) penempelan (annealing), dan (3) elongasi (elongation). Reaksi
akan berlanjut terus beberapa siklus hingga selesai.

Gambar 1. Tahapan reaksi PCR yang terdiri dari denaturasi, penempelan (annealing), dan
elongasi (elongation).
42
Sumber: (Albert, et.al., 2004)

Berdasarkan gambar 1, berikut adalah penjelasan singkat yang terjadi dari masing-
masing tahap,
1. Campuran reaksi akan dipanaskan hingga mencapai suhu 94oC. Pada suhu ini, ikatan
hydrogen akan lepas menyebabkan rantai DNA akan terpisah.
2. Campuran lalu didinginkan hingga mencapai suhu 50-60oC. Pada tahap ini, DNA
yang terpisah bisa bergabung kembali tetapi umumnya tidak terjadi. Pada tahap ini
oligonukleotida atau biasa disebut primer yang telah didesain secara spesifik untuk
menempel pada template DNA tersebut akan menempel ke posisi yang telah
ditentukan.
3. Saat suhu dinaikan menjadi 72-74oC, ini adalah suhu optimal dari DNA polymerase
untuk bekerja. DNA polymerase akan menempelkan satu persatu oligonukleotida
yang bebas di dalam larutan sehingga terbentuk rantai DNA yang baru. Hingga reaksi
tahap ini, dari denaturasi hingga elongasi dianggap 1 siklus.
4. Ketika tahap 3 selesai, temperature akan dinaikkan kembali menjadi 94oC atau ke
tahap denaturasi untuk dilanjutkan kembali siklus lainnya. Dalam reaksi PCR, siklus
reaksi dapat dilakukan dari 28-32 kali sehingga dapat menghasilkan jutaan molekul
DNA baru yang merupakan hasil perbanyakan DNA yang dipilih.

III. Prosedur
III.1 Alat
 PCR tube 0,2 mL
 Microtube 1,5 mL
 Mesin PCR
 Gel electrophoresis chamber
 UV transilluminator
 Pipette (1000 µl, 200 µl, 20 µl)
 Microwave
 Erlenmeyer
 Cetakan agarose

43
 Vortex
 Microcentrifuge

III.2 Bahan
 Template DNA
 10x Taq reaction buffer
 Taq DNA polymerase
 10 µM primer forward
 10 µM Primer reverse
 10 mM dNTPs
 Air steril (Nuclease free water)
 Agarose
 Ethidium bromide
 DNA marker λ/StyI
 6x Dye
 Pipette tips (1000 µl, 200 µl, 20 µl)
 Tris free base
 Disodium EDTA
 Glacial acetic acid
 Medical gloves

III.3 Prosedur Percobaan


A. Reaksi PCR
1. Gunakan medical gloves saat melakukan percobaan ini.
2. Siapkan 3 PCR tube 0.2 mL, masing-masing diisi dengan reaction mixture sebagai
berikut,
Bahan Volume (µL)
10x Taq reaction buffer 2
10 mM dNTPs 0,5

44
10 µM primer forward 1
10 µM Primer reverse 1
Template DNA variasi
Air steril Sesuaikan menuju total 20
Taq DNA polymerase 0,25
Total 20
Catatan:
- direkomendasikan untuk membuat reaction mixture untuk 3 sampel, lalu
dibagi ke masing-masing PCR tube
- Taq DNA polymerase ditambahkan paling akhir
3. Nyalakan mesin PCR dan set temperature reaksi sebagai berikut dengan
menggunakan temperature gradient.

94oC 1 menit
94oC 0,5 menit
50oC-70oC 0,5 menit 32x
72oC 1 menit
72oC 5 menit
o
4C ∞
4. Letakkan PCR tube di plate dengan suhu 50oC, 60oC, dan 70oC
5. Sementara menunggu, bisa dilakukan persiapan untuk membuat 1xTAE dan mencetak
agarose.

B. Pembuatan 1x buffer TAE


1. Buat 50x buffer TAE dengan campuran sebagai berikut,
Bahan Jumlah
Tris free base 242 g
Disodium EDTA 18,61 g
Glacial Acetic Acid 57.1 ml
Air steril Hingga 1 L
Total 1L

45
Urutan pencampuran: Tambahkan Tris dan EDTA dan air hingga volume 700 ml.
Aduk hingga larut. Lanjutkan dengan penambahan acetic acid dan air hingga
volume total menjadi 1 L.
2. Encerkan menjadi 1x buffer TAE sebanyak 1 L. Simpan 50x buffer TAE sisa.

C. Pembuatan 0,8% gel agarose


1. Campurkan 100 mL 1x buffer TAE ke 0.8 g agarose.
2. Microwave selama 1 menit. Goyang-goyang botol/Erlenmeyer saat mencapai 30
detik. Lanjut kan microwave dan penggoyangan hingga agarose terlarutkan. (gunakan
sarung tangan tebal yang tahan panas saat langkah ini dan selanjutnya).
3. Siramkan botol dengan air dari keran secara perlahan sambil digoyangkan hingga
botol terasa hangat dan bisa dipegang oleh tangan. Tambahkan 6 µL ethidium
bromide. (hati-hati saat menggunakan ethidium bromide karena bersifat toksik dan
karsinogenik). Goyangkan botol hingga ethidium bromide tercampur dengan larutan
agarose.
4. Tuangkan larutan gel tersebut ke cetakan dan biarkan hingga mengeras.

D. Proses elektroforesis gel


1. Setelah agarose mengeras, letakkan agarose ke gel electrophoresis chamber dan
tuangkan 1x buffer TAE ke chamber hingga agarose terendam.
2. Ambil hasil PCR yang telah diinkubasi dan campurkan 6x Dye sebanyak 1 µL.
3. Transfer marker dan plasmid yang telah diinkubasi kedalam agarose dengan urutan
sebagai berikut,

4. Set voltase elektroforesis menjadi 100 Volt dan jalankan proses elektroforesis selama
30 menit
5. Bawa agarose ke UV transilluminator untuk diambil foto hasilnya.

46
IV. Potensi Bahaya
No Alat Potensi Bahaya
1 Gel electrophoresis Pecah/meledak
chamber
2 Mesin PCR Meledak
3 UV Transiluminator Mata terpapar sinar UV tanpa pengaman
4 Microwave Meledak

No Bahan Potensi Bahaya


1 Ethidium bromide Bersifat toksik dan karsinogenik.
Dapat menyebabkan iritasi pada kulit, inflamasi,
hingga kanker jika terpapar.

V. Pertanyaan
1. Apa fungsi dari DNA polymerase? Apa yang terjadi jika DNA polymerase belum
dimasukan dalam reaksi PCR?
2. Apa pengaruh temperature annealing terhadap hasil PCR?
3. Apa pengaruh banyaknya siklus PCR terhadap hasil PCR?
4. Mengapa pada proses terakhir PCR harus berada di suhu 4oC?
5. Jelaskan persamaan/perbedaan antara hasil elektroforesis antara hasil PCR dengan
siklus yang berbeda-beda?

VI. Format Laporan


No Data yang diambil Ukuran DNA (bp)
o
1 50 C
2 60oC
3 70oC

No Data yang diambil Konsentrasi (µM)


1 50oC
2 60oC

47
3 70oC

VII. Daftar Pustaka


Alberts, B. (2004). Essential cell biology. New York, NY: Garland Science Pub.

Brown, T.A. (2010). Gene cloning and DNA analysis. 6th edition. Sussex: John Wiley & Sons
Ltd.

48