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NITRATO E NITRITO

REDUTASE DE PANTAS
INTRODUÇÃO

A maior parte da atmosfera terrestre é constituída por nitrogênio molecular (N2), sendo então
a fonte mais abundante deste elemento, no entanto, pouquíssimos organismos são capazes de
converte-lo em formas químicas úteis para os organismos vivos. Para que isso seja possível existem
mecanismos que conseguem reempregar o nitrogênio biologicamente disponível. Isso se dá pelo ciclo
do nitrogênio (Figura 1). Onde o primeiro passo do ciclo é a fixação do Nitrogênio atmosférico pelas
bactérias fixadoras de nitrogênio, que produzem amônia, que depois é oxidada a nitrito, e
posteriormente a nitratos por bactérias, processo conhecido como nitrificação.

Figura 1 – Ciclo do Nitrogênio.


Não só as bactérias, como também os vegetais conseguem reduzir a facilmente o nitrito a
amônia pela ação das enzimas nitrito e nitrato redutases. Assim, a amônia formada é empregada na
síntese de aminoácidos, onde essas plantas se tornam então fontes de aminoácidos para os animais
que se alimentam das mesmas. Após a morte a amônia retorna ao solo, devido a degradação
microbiológica que as proteínas sofrem, e a amônia passa a ser convertida em nitrito e nitrato
novamente. [1]

Em plantas superiores a assimilação de nitrogênio (N) é o segundo maior processo


metabólico, sendo superado apenas pela fixação fotossintética do CO2. As plantas absorvem o N do
solo principalmente nas formas de nitrato e amônio. O nitrato é a principal forma de nitrogênio
disponível para as plantas. Uma vez absorvido pela célula, o nitrato é reduzido a nitrito pela nitrato
redutase (RN) e, em seguida, a amônio, pela nitrito redutase (RNI) (figura 2). Esse amônio é
imediatamente assimilado por meio da ação conjunta das enzimas glutamina sintetase (GS) e
glutamato sintase (GOGAT). Os processos de redução e assimilação de nitrogênio podem ocorrer nas
folhas e/ou raízes, de maneira simultânea ou não entre esses órgãos, de acordo com a espécie e com
as condições ambientais [2]

Figura 2 – Conversão do nitrato a nitrito e do nitrito a amônio. Fonte: referência 3


O primeiro passo é catalisado pela enzima redutase do nitrato (RN), localizada no citoplasma,
enquanto a redutase do nitrito (RNi), localizada no cloroplasto (tecidos verdes) ou plastídeos (tecidos
não-verdes), catalisa o segundo. A eficiência do processo de assimilação do NO3– é maior na folha.
Na raiz ou em outros tecidos não-verdes, a redução do NO3– e assimilação de NH4+ dependem de
energia química do metabolismo de fotoassimilados fornecidos pelas folhas. Dessa forma consomem
energia fotoquímica utilizada na fixação do gás carbônico. Na folha a necessidade de gasto de energia
fotoquímica para a assimilação do nitrato é diferenciada em plantas tipo C3 e C4. No cloroplasto, isso
nem sempre acontece, pois, os seis elétrons utilizados na redução do nitrito podem ser fornecidos
diretamente pelas reações fotoquímicas, sem que haja competição com a fixação do gás carbônico.
[3]
OBJETIVOS

• Demonstrar a atividade das enzimas de assimilação do nitrato em plantas.


• Determinar as atividades do nitrato e nitrito redutases em folhas.

PROCEDIMENTO EXPERIMENTAL

Reagentes
 Solução de Nitrito de Potássio (KNO2) 100 µM:.
 Reagente de nitrito:
 Tampão: fosfato de potássio 0,2 M:
 Nitrato de potássio 100 mM
 Folhas de gramíneas recém-colhidas
1- Curva Padrão de Nitrito
Inicialmente, pegou-se 6 tubos de ensaios e estes foram enumerados de 1 a 6. Adicionou-se
H2O, nitrito de sódio 100 µM e reagente de nitrito conforme mostra a tabela 1.

Tubos Água KNO2 Reagente de


destilada Nitrito
1 1 0 4,0
2 0,9 0,1 4,0
3 0,8 0,2 4,0
4 0,7 0,3 4,0
5 0,6 0,4 4,0
6 0,5 0,5 4,0
Tabela 1- Curva padrão de nitrito

Após a adição dos reagentes, agitou-se os tubos e incubou-se por 15 minutos a 30 °C.
Determinou-se as absorbâncias usando fotocolorímetro equipado com filtro verde 54 (540 nm). Fez-
se o branco com o tubo 1 e determinou-se as absorbâncias dos outros tubos.

2- Determinação da atividade da NITRATO REDUTASE de folhas de grama


Em quatro tubos de ensaio, preparou-se as seguintes soluções (tabela 2)

Tubos Tampão Agua destilada KNO3 (mL) Folhas (g)


Fosfato (mL) (mL)
1 2,5 1,5 0 0
2 2,5 0 1,5 0
3 2,5 1,5 0 0,2
4 2,5 0 1,5 0,2
Tabela 2- Quantidade de reagentes para experimento 2.

Após a adição dos reagentes, agitou-se os tubos e incubou por 30 minutos a 30 °C. Em
seguida, tomar 1 mL de solução de cada tubo e reagiu com 4 mL de reagente de nitrito, por 15 minutos
a 30 °C. Determinou-se as absorbâncias como na experiência anterior, usando o tubo 1 para zerar o
fotocolorímetro. Calcular a quantidade de nitrito formado por grama de folha usando o gráfico do 1°
experimento.

3- Determinação da atividade da Nitrito Redutase de folhas de grama


4-
Em quatro tubos de ensaio, preparou-se as seguintes soluções (tabela 3)
Tubos Tampão Agua destilada KNO2 Folhas
fosfato
1 2,5 1,5 0,0 0
2 2,5 1,0 0,5 0
3 2,5 1,5 0,0 0,2
4 2,5 1,0 0,5 0,2
Tabela 3- determinação da atividade da Nitrito redutase

Imediatamente após a adição das folhas, agitou-se e incubou-se a 30°C, durante 30 minutos.
Após esse tempo, retirou 1 mL de amostra de cada tubo e dosou nitrito como descrito anteriormente.
Determinar o número de nanomoles de nitrito presente em cada tubo.

RESULTADOS E DISCUSSÃO

1. Curva de calibração para concetrção de nitrito (NO2-)


Para montagem da curva de calibração, preparou 6 amostras contendo uma solução de nitrito
em diferentes concentração tabela 04.
Tabela-04 : Leitura dos valores de absorbância em relação ao nitrito.
Tubos NO2-mol/ml Absorbância
1 0 0
2 0,1 0,099
3 0,2 0,157
4 0,3 0,259
5 0,4 0,333
6 0,5 0,463

Após aquecer em banho-maria por 15 minutos a 30°C, a presença de nitrito foi observada
pela coloração vermelho-purpura, em seguida, mediu a absorbância das soluções em 540 nm. Traçou-
se o gráfico (Absorbância) vs (concentração de nitrito) (figura x):
0,50

0,45
Equation y = a + b*x
Weight No Weighting
Residual Sum of 0,00132
Squares
Pearson's r 0,992
0,40 Adj. R-Square 0,97876
Value Standard Error
B Intercept -0,009 0,02203
B Slope 0,00904 6,64129E-4

0,35
absorbância

0,30

0,25

0,20

0,15

0,10

0,05
10 20 30 40 50
mg/ml

Figura 0X: Curva de calibração - concentração de nitrito.

A partir da curva de calibração, traçou-se o ajuste linear: onde e possível aplicada a Lei de
Beer, no qual a absorbância medida é proporcional à concentração da espécie analisada de acordo
com a equação.

2. Determinação da atividade da NITRATO REDUTASE de folhas de grama.

Tabela 05: Valores de absorbância obtidos da nitrato redutase.


Tubos Absorbância
1 0
2 0,001
3 0,110
4 0,126

A partir dos valores obtidos dispostos na tabela 05, podemos por meio dos valores obtidos
nos tubos tubo 2 que contem NO3- e teve como objetivo determinar o quanto de nitrito está
contaminando o nitrato; Tubo 3 contendo as folhas e servirá para analisar o quanto de nitrito será
obtido a partir do nitrato das folhas. Com isso, fazendo-se as somas das absorbâncias dos tubos 2 e 3,
e possível estabelecer quanto de nitrido foi obtido (0,111). No tubo 4 continha tanto o nitrato como
as folhas, este é o sistema completo é a nitrato redutase foliar catalisará a redução do nitrato a nitrito,
com isso e possível substituir o valor de absorbância da nitrato redutase e subtraímos pela somatória
do tubo 2 e 3

0,126 - 0,111 = 0,015

E colocamos na equação da reta para obter a concentração de nitrito:

0,015 = 0,00938 [NO2-] + 0,00223

[NO2-] = 1,36 mg/mL

3. Determinação da atividade da nitrito redutase de folhas de grama

Neste experimento determinamos a quantidade de nitrito que foi transformado em NH4+ por
ação da nitrito redutase foliar.
Tubos Absorbância
1 0
2 0,109
3 0,091
4 0,210

Assim como no experimento anterior, o tubo 2 continha a quantidade de nitrito presente no


início da reação, já no tubo 3 estavam as folhas e, dessa forma, foi possível identificar a quantidade
de nitrito tem nas mesmas continham. Com isso foi possível somar os dois e obter 0,200 de nitrito.
No tubo 4 que continha tanto as folha quanto o nitrito, e serviria para calcularmos a quantidade de
nitrito reduzido a amônia, e dessa forma executar os mesmo cálculos do experimento anterior.

0,210 - 0,181 = 0,010

Com a equação da reta podemos determinar a concentração de nitrito:


0,010 = 0,00938 [NO2-] + 0,00223

[NO2-] = 0,828 mg/mL

Conclusão

Por meio do experimento e técnicas de fácil aplicação foi possível fazer um estudo sobre a
atividade catalítica da nitiro e nitrato redutase em folhas de grama. Dessa forma, com a coleta e
tratamento dos dados foi quantificado a quantidade de nitrito e nitrato catalisado por ambas as
ensimas, 1,36 mg/mL para o experimento 2 e 0,828mg/ml para o experimento 3. Assim, foi possível
por meio de técnicas simples, fazer a análise e quantificação da atividade de ambas a enzimas.

Bibliografia
1 Lehninger, A. Lester. Fundamentos de Bioquímica. 4ª ed. São Paulo: Sarvier, 2006.

2https://www.feis.unesp.br/Home/Eventos/encivi/viencivi2012/sanches_redutase_nitrato_sering
ueira_37_final.pdf

3-http://www.ledson.ufla.br/assimilacao-e-transporte-de-nitrogenio-2/assimilacao/reducao-do-
nitrato/