BAB I

PENDAHULUAN
I.1. Latar belakang
Mikroba standard biasa digunakan untuk sebagai kontrol positif pada pengujian
batas cemaran mikroba pada suatu sediaan obat, makanan dan minuman. Verfikasi ini berupa
pemastiaan bahwa mikroba yang diuji benar benar atau tidak dan sesuai atau tidak
identitasnya dengan yang sudah tertera di spesifikasinya.
Verifikasi ini dapat dilakuka dengan beberapa metode yang dapat dikombinasi
seperti, teknik pewarnaan Gram (bentuk morfologi, rangkaian dan klasifikasi). Dari gramnya
dapat diketahui pertumbuhan spesifikpada media selektif serta uji biokimia.
Perlu digunakan beberapa jenis uji biokimia untuk memastikan identitas dari
mikroorganisme yang akan dibandingkan dengan mikroba standard. Pada saat ini telah
banyak kit uji biokimia yang mempermudah untuk menganalisis karakter suatu mikroba dan
memperoleh identitas dari mikroba tersebut. Prinsip pengujiannya adalah menginokulasikan
mikroba uji ke sejumlah sumur-sumur yang mengandung pereaksi biokimia, menginkubasi
kit tersebut pada suhu tertentu mengandung pereaksi biokimia, menginkubasi kit tersebut
pada suhu tertentu selama waktu yang ditetapkan, menambahkan pereaksi-pereaksi tertentu
sesuai yang ditetapkan untuk beberapa jenis reaksi yang digunakan, membaca hasil reaksi
(biasanya disediakan tabel warna reaksi positif dan negatif untuk setiap sumuran), kemudian
menginput data yang diperoleh ke dalam software yang telah tersedia. Dari hasil ini
diperoleh persentase similaritas/kemiripan anatara mikroba yang akan kita uji dengan
mikroba yan terdaftar di database.
Maka Pada praktikum ini, akan digunakan kit uji mikroba dari Microgen untuk
bakteri gram negatif basil (E.coli)

I.2. Rumusanmasalah
1. Menganalisaapakah makanan dan minuman yang beredar di masyarakat telah
memenuhi syarat uji batas mikroba
2. Menarikkesimpulanapakahmakanan dan minuman yang beredar di masyarakat telah
sesuai dengan syarat batas mikroba yang ada

I.3. Tujuanpraktikum
1. Melakukan verfikasi mikroba standard dengan pewarnaan gram,
2. Melakukan verifikasi mikroba standard dengan mengamati pertumbuhan koloni
spesifik pada beberapa media selektif,
3. Melakukan verifikasi mikroba standard dengan uji-uji biokimia yang terdapat pada kit
Microgen, hingga memperoleh persen similiritasnya terhadap mikroba yang terdaftar di
database software Microgen,
4. Mengkompilasi hasil verifikasi dengan ketiga metode tersebut, kemudian membuat
analisis dan kesimpulan dari hasil verifikasi yang dilakukan.
I.4. Manfaatpraktikum
Manfaatdarimelakukan praktikum ini mahasiswa dapat memahami dan mampu
melakukan ujiverifikasi mikroba standard dengan sampel bakteri E.coli
 BAB II
TINJAUAN PUSTAKA

Dasar molekuler kehidupan dipelajari dalam bidang ilmu biokimia. Di seluruh dunia
biokimia dianggap sangat menggairahkan kerena berbagai alasan; pertama, mekanisme kimia
banyak sentral pada kehidupan kini mulai dipahami. Kedua, pola dan prinsif-prnsip molekular
yang umum mendasri penampilan. Ketiga, biokimia sangat mendasari ilmu kedokteran. Keempat,
perkembangan yang cepat (Stryer, 1995).
Aktivitas biokimia dapat diamati dari bagaimana kemampuan mikroorganisme untuk
menggunakan dan menguraikan suatu molekul kompleks seperti karbohidrat, lemak, protein, dan
asam nukleat.
Ciri biokimia merupakan kriteria yang amat penting di dalam identifikasi spesimen bakteri
yang tak dikenal karena secara morfologis biakan ataupun sel bakteri yang berbeda dapat tampak
serupa, tanpa hasil pengamatan fisiologis yang memadai mengenai organik yang diperiksa maka
penentuan spesiesnya tidak mungkin dilakukan. Karakteristik dan klasifikasi sebagai mikroba
seperti bakteri berdasarkan pada reaksi enzimatik ataupun biokimia. Mikroba dapat tumbuh pada
beberapa tipe media memproduksi metabolit tentunya yang dideteksi dengan interaksi mikroba
dengan reagen test yang mana menghasilkan perubahan warna reagen (Murray, 2005).
Sistem Microgen GN-ID bekerja menggunakan 12 (GN A) atau 24 (GN A + B) standar
substrat biokimia berupa microwell untuk mengidentifikasi famili Enterobacteriaceae dan basil
gram negatif non-rewel lainnya. (Oksidase negatif dan positif). Kit ini dimaksudkan penggunaan
laboratorium saja.
E. coli merupakan bakteri gram negatif yang berbentuk basil, ada yang individu (monobasil),
saling berpasangan (diplobasil) atau berkoloni membentuk rantai pendek (streptobasil), tidak
membentuk spora maupun kapsula, berdiameter ± 1,1 – 1,5 x 2,0 – 6,0 µm, dapat bertahan hidup
di medium sederhana dan memfermentasi laktosa menghasilkan asam dan gas, kandungan G+C
DNA ialah 50 ‒ 51 mol %. Pergerakan bakteri ini motil, tidak motil, dan peritrikus. Ada yang
bersifat aerobik dan anaerobik fakultatif. E. coli merupakan penghuni normal usus, dan seringkali
menyebabkan infeksi.
Kecepatan berkembang biak bakteri ini berada pada interval 20 menit jika faktor media,
derajat keasaman, dan suhu sesuai. Selain tersebar di banyak tempat dan kondisi, bakteri ini tahan
terhadap suhu, bahkan pada suhu ekstrim sekalipun. Suhu yang baik untuk pertumbuhan bakteri
ini adalah antara 8 OC – 46 OC, tetapi suhu optimalnya adalah 37 OC. Oleh karena itu, bakteri
tersebut dapat hidup dalam tubuh manusia dan vertebrata lainnya.
E. coli merupakan bagian dari mikrobiota normal saluran pencernaan. E. coli dapat
berpindah karena adanya kegiatan seperti dari tangan ke mulut atau dengan pemindahan pasif
lewat minuman. E. coli dalam usus besar bersifat patogen jika melebihi jumlah normalnya. Strain
tertentu dapat menyebabkan peradangan selaput perut dan usus (gastroenteritis). Bakteri ini
menjadi patogen berbahaya apabila hidup di luar usus seperti pada saluran kemih, yang dapat
mengakibatkan peradangan selaput lendir (sistitis).
E. Coli juga merupakan organisme penghuni utama di usus besar, hidupnya komensalisme
dalam kolon manusia dan diduga berperan dalam pembentukan vitamin K yang berperan penting
untuk pembekuan darah. Dari berbagai penelitian, menunjukkan bahwa beberapa strain E. coli
juga dapat menyebabkan wabah diare atau muntaber, terutama pada anak-anak.
 BAB III
METODOLOGI PENELITIAN
I. ALAT DAN BAHAN
Alat:
1. Tabungreaksi 6. KacaOjek
2. Mikropipet 7.Pipet Tetes
3. Kit Microgen 8. Mikroskop
4. Cawan petri 9. Komputer
5. JarumOse

Bahan
1. Mikroba standard berupabakteri basil Gram negative (E. coli) berumur
maksima 24 jam , dalam media agar lempeng TSA atau NA
2. Kit Microgen GNA+GNB dan pereaksi-pereaksi nya
3. Pereaksi-pereaksi untuk pewarnaan Gram
4. Media-media selektif diferensial yang sesuai

II. CARA KERJA

i. Verifikasi Mikroba Standard dengan Pewarnaan Gram
1. Lakukan prosedur pewarnaan Gram terhadap mikroba standard yang akan
diverifikasi,
2. Amati dan laporkan morfologi sel, rangkaian, dan klasifikasi Gramnya.
ii. Verifikasi Mikroba dengan Mengamati PertumbuhanKoloni Spesifik
di Media Spesifik
1. Siapkan kultur bakteri dalam media Tryticase Soy Broth (TSB) berumur 24
jam,
2. Inokulasi sebanyak 1 ose bakteri ke media agar selektif yang sesuai, dengan
teknik gores kuadran (quadrantstreak method),
3. Inkubasi pada suhu 35-37oC selama 24-48 jam,
4. Amati warna koloni (warna koloni spesifik untuk setiap bakteri pada media
selektif dapat dilihat pada tabel 1)

Tabel 6.1. Ciri khas orfologi koloni beberapa bakteri pada media selektifnya

Bakteri Media Selektif Warna koloni

Escherichia Mac Conkey Merah bata dapat dikelilingi daerah
coli Agar (MCA) yang terdiri dari endapan empedu
Eosine Kilau logam yang khas di bawah
Methylene cahaya yang dipantulkan dan warna
Blue Agar biru hitam pada cahaya yang
(EMBA) diteruskan
iii. Verifikasi Mikroba dengan Kit Uji Biokimia
1. Buat kultur segar bakteri dengan menginokulasi 1 ose bakteri pada media agaar
(bisa media pokok atau media selektif) secara quadrant streak method agar
diperoleh koloni tunggal.
2. Inkubasi selama 24 jam pada suhu 35-37oC,
3. Sebagai uji pendahuluan, ambil koloni tunggal secukupnya, letakkan pada strip
uji oksidase untuk diuji aktivitas oksidasenya.
4. Jika uji oksiddasse menunjukkan hasil poaitif (strip uji oksidase yang kontak
dengan koloni berubah warna menjadi warna biru keunguan), maka bakteri
diuji dengan kit GN A+B. Jika diuji oksidase menunjukkan hasil negatif (strip
oksidase yang kontak dengan koloni tidak berubah wana), maka bakteri diuji
dengan kit GN A saja atau GN A+B
5. Ambil koloni tungga secara aseptik menggunakan jarum ose, suspensikan ke
daam 3-5 ml laurtan NaCl 0,9% steril, homogenkan dengan cara memilin-milin
tabung di antara dua telapak tangan.
6. Letakkan microwell GN A dan GN B pad tray nya. Buka plester secara aseptik
dan hati-hati (bagian yang boleh dipegang adalah bagian ujung plester yang
sudah disediakan)
7. Langkah uji selanjutny mengikuti Tabel 10.1. berikut ini
8. Catat hasil yang diperoleh pada GN-ID A+B Panel Report Form Catat Octal
Code yang diperoleh, masukkan octal code ke program/ software Microgen.
9. Identitas bakteri yang dikarakterisasikan adalah sesuai dengan isolat hasil
pembacaan software dengan % probabilitas tertinggi (data dibandingkan
terhadap database isolat Microgen)

Tabel 6.2. Pengujian Biokimia Bakteri dengan Kit GN A dan GN B

Uraian GN A GN A+B GN A+B

Hasil uji oksidase Negatif Negatif Positif
Inokulum 1 koloni dalam 3 1 koloni dalam 1 koloni
ml larutan NaCl 5 ml larutan dalam 5 ml
0,9% steril NaCl 0,9% larutan NaCl
steril 0,9% steril
Inokulasi 3-4 tetes (100µL 3-4 tetes 3-4 tetes
per sumur) (100µL per (100µL per
sumur) sumur)
Dilapisi (overlay) dengan Sumur1-Lisin Sumur 1,2,3 Sumur 1,2,3
minyak mineral Sumur2-Omitin dan 9 dan 9
Sumur3-H2S Sumur20- Sumur24-
Sumur9-Urease Arabinosa Arginin
Sumur24-
Arginin
Waktu inkubasi 18-24 jam 18-24 jam 48 jam
Suhu 35-37oC 35-37oC 35-37oC
Pembacaan hasil awal (Lihat Sumur 8 – Seperti GN A Seperti pada
Tabel 2- Interpretasi hasil) Indol:Tambahkan GN A
 2 tetes pereaksi
Penambahan Pereaksi Kovac’s Baca
hasil setelah 60
detik.

Sumur 10 – VP: Gelatin: Baca Sumur 7 –

Tambahkan 1 hasil setelah 24 ONPG:
tetes pereaksi jam Tambahkan 1
VPI dan 1 tetes tetes Nitrat A
pereaksi VPII. + 1 tetes
Baca hasil Nitrat B.
setelah 15-30 Baca hasil
menit. setelah 60
detik.

Sumur 12: TDA Sumur 24: Gelatin: Baca

– Arginin hasil setelah
Tambahkan 1 - 48 jam.
tetes pereaksi Kuning =
TDA dan baca Negatif Sumur 24:
hasil setelah 60 Hijau/Biru = Arginin
detik Positif Kuning
=Negatif
Biru = Positif

Pembacaan Akhir Sesuai dengan hasil pembacaan software Microgen

 BAB IV

HASIL DAN PEMBAHASAN

A. Hasil
Hasil pembacaan software Microgen : Terlampir

b. Pembahasan

1. Andreas Yansen (2015210019)

Uji verifikasi dilakukan untuk memastikan mikroba yang diuji merupakan
mikroba yang dibandingkan apa bukan. Pada percobaan ini dilakukan uji verifikasi
mikroba dengan menggunakan alat KIT atau Microgen GN A+B ID system dengan
bakteri yang akan diverifikasi adalah bakteri Escherichia coli. Sebelum masuk ke uji
ini dilakukan uji biokimia pada bakteri uji dengan pereaksi warna untuk mengetahui
klasifikasi dan morfologi dari bakteri uji. Dimana diperoleh hasil abkteri merupakan
bakteri dengan bentuk basil dan berwarna merah yang menunjukkan bahwa bakteri
tergolong dalam bakteri gram negatif E.coli. Kemudian dilakukan uji dengan
menggunakan kit dimana dilakukan uji oksidasi terlebih dahulu untuk memastikan
gram bakteri. Pada percobaan ini pada KIT Microgen terdapat 12 lubang, dimana pada
lubang 1 menunjukkan hasil positif yang berarti terdapat lysine decarboxylase yang
dapat memproduksi amin kadaverin. Pada lubang ke2 menunjukkan hasil negatif yang
menunjukkan tidak memproduksi ornithin decarboxylase berarti tidak memproduksi
amin putrescine. Pada lubang ke 3 hasilnya negatif, sehingga tidak memproduksi H2S.
Pada lubang 4,5,6 meunjukkan hasil positif yang menunjukkan bakteri mampu
melakukan fermentasi terhadap karbohidrat menjadi asam. Pada lubang 7
menunjukkan hasil positif dimana ONPG dihidrolisis oleh ß galactosidase
 menghasilkan ortho-nitrophenol kuning. Pada lubang 8 menunjukkan hasil positif
setelah pemberian kovac dan menunjukkan bakteri memproduksi indole yang berasal
dari tryptofan. Pada lubang 9 menunjukkan hasil negatif yang berarti tidak
memproduksi urease. Pada lubang no 10 sebelum pengamatan ditambahkan 1 tetes VP
I dan VP II, setelah diamati hasilnya negatif tidak berwarna, yang artinya mikroba ini
tidak memproduksi acetoin dari glukosa. Pada lubang no 11 hasilnya adalah negatif
mengandung citrate yang ditandai, yang artinya mikroba ini tidak memanfaatkan
citrate (hanya sumber karbon) untuk meningkatkan pH dimana akan memberikan
perubahan warna. Pada lubang no 12 , pada pengujian TDA, ditambahkan 1 tetes
reagen TDA dan diamati setelah 60 detik dan hasilnya negatif yang ditandai dengan
warna kuning. Mikroba ini tidak memproduksi asam indolepiruvic dimana asam ini
diproduksi dari tryptophan oleh tryptofan deaminase .
Dari hasil percobaan ini menunjukkan hasil uji pada Gn A diperoleh kode 6760
dengan hasil verifikasi adalah Eschrichia coli dengan probability 97,11%.
2.Anggita Balqis F (2015210021)
Mikroba patogen adalah mikroba yang dapat menyebabkan penyakit dapat
ditemukan diberbagai tempat, tersebar luas di tanah, udara, tanaman, hewan dan
manusia. Mikroba tersebut dapat terbawa oleh pangan atau tangan dan peralatan masak
yang dapat mencemari pangan sehingga menyebabkan penyakit. Umumnya mikroba
patogen yang menyebabkan penyakit pada manusia adalah mikroba yang mempunyai
pertumbuhan optimal pada suhu 20-40 derajat celcius. Tujuan dari percobaan verifikasi
mikroba patogen adalah untuk mengetahui mengetahui spesifikasi dari mikroba patogen.
Pada praktikum kali ini menggunakan alat KIT atau Microgen TM GnA+B-ID System.
Dimana KIT terbagi menjadi 2 bagian yaitu Gen A dan Gen B, masing-masing gen mempunyai 12
lubang dengan fungsi yang berbeda-beda. Sebelum melakukan eifikasi mikroba patogen dengan
menggunakan KIT terlebih dahulu harus melakukan uji oksidase tujuan dari uji oksidase adalah
untuk menentukan mikroba tersebut termasuk ke dalam gram positif atau negatif.\ Setelah
diinkubasi kemudian diamati , pada sumur no 1 hasilnya positif mengandung lysine yang ditandai
dengan warna hijau. Yang menandakan mikroba tersebut memiliki lysine decarboxylase -
bromothymol biru berubah menjadi hijau / biru yang mengindikasikan adanya produksi amin
kadaverin.

Pada sumur no 2 hasilnya negatif ornithine yang ditandai dengan warna hijau/kuning. Yang
artinya mikroba tersebut tidak memiliki ornithine decarboxylase yang tidak dapat mengubah
bromothymol biru menjadi biru yang mengindikasikan mikroba tersebut tidak memproduksi amin
putrescine.

Pada sumur no 3 hasilnya negatif H2S dengan warna nya kuning , yang artinya mikroba ini
tidak memproduksi H2S yang mana artinya tiosulfat tidak mereduksi H2S sehingga tidak dapat
bereaksi dengan garam Fe memproduksi precipitate hitam.

Pada sumur no 4, 5 dan 6 hasilnya positif. Dimana mikroba ini mampu melakukan
fermentasi , Bromothymol biru mengubah biru menjadi kuning sebagai hasil dari produksi asam
dari fermentasi karbohidrat.

Pada sumur no 7 , pada pengujian ONPG didapatkan hasil positifkuning. Yang artinya
ONPG dihidrolisis oleh ß galactosidase menghasilkan ortho-nitrophenol kuning.

Pada sumur no 8 (Gn-A) ditambahkan 2 tetes pereaksi Kovac’s , lalu kemudian diamati
setelah 60 detik. Dari hasil pengamatan hasilnya positif indole.Yang artinya mikroba ini
memproduksi indole dimana Indole diproduksi dari tryptofan dan memberikan warna kompleks
pink/merah ketika ditambahkan dengan pereaksi Kovac’s.

Pada sumur no 9 negatif mengandung urease. Yang artinya hasil hidrolisis urea dalam
formasi ammonia tidak meningkatkan pH yang mengubah phenol red dari kuning menjadi pink /
merah.

Pada sumur no 10 sebelum pengamatan ditambahkan 1 tetes VP I dan VP II dan dibaca

pada 15-30 menit , setelah diamati hasilnya negatif tidak berwarna . Yang artinya mikroba ini
tidak memproduksi acetoin dari glukosa yang terdeteksi dengan pembentukan kompleks merah /
pink setelah penambahan alpha naphthol dan keratin oleh KOH.

Pada sumur no 11 hasilnya adalah negatif mengandung citrate yang ditandai warna
kuning/hijau. Yang artinya mikroba ini tidak memanfaatkan citrate (hanya sumber karbon) untuk
meningkatkan pH dimana akan memberikan perubahan warna pada bromothymol biru dari hijau
menjadi biru,

Pada sumur no 12 , pada pengujian TDA, ditambahkan 1 tetes reagen TDA dan diamati
setelah 60 detik dan hasilnya negatif yang ditandai dengan warna kuning. Mikroba ini tidak
memproduksi asam indolepiruvic dimana asam ini diproduksi dari tryptophan oleh tryptofan
deaminase .

Berdasarkan uji pada Gn A diperoleh kode 6760 dengan hasil verifikasi adalah Eschrichia
coli dengan probability 97,11%,.
 BAB V

KESIMPULAN DAN SARAN

I. Kesimpulan

1.Andreas Yansen (2015210019)

1) Hasil pewarnaan Gram yaitu bakteri berbentuk basil dan warna merah, sehingga
dapat disimpulkan bakteri tersebut merupakan bakteri Gram negatif E. coli.
 2) Pada pemeriksaan GN A+B dengan octal code 47600162 menunjukkan hasil bahwa
bakteri tersebut benar adalah bakteri E. coli.
2. Anggita Balqis F (2015210021)
 Hasil pewarnaan Gram yaitu bakteri berbentuk basil dan warna merah, sehingga d
apat disimpulkan bakteri tersebut merupakan bakteri Gram negatif Eschrichia col
i.
 Pada pemeriksaan GN A+B dengan octal code 47600162 menunjukkan hasil bah
wa bakteri tersebut benar adalah bakteri Eschrichia coli.

II.Saran
1. Andreas Yansen (2015210019)
Sebaiknya dilakukan percobaan ini secara aseptik untuk mencegah adanya
kontaminan pada sampel yang dapat mempengaruhi hasil percobaan yang dilakukan.
2.Anggita Balqis F (2015210021)
Sebaiknya para praktikan sebelum melakukan sterilisasi harus melakukan berdasarkan
prosedur tehnik pengerjaan yakni pengerjaan atau prosedur kegiatan di laboratorium
mikrobiologi harus dikerjakan secara aseptic. Dengan tujuan untuk mencegah adanya
kontaminasi silang atau tercemarnya biakan murni dari mikroorganisme luar baik melalui
kontak langsung dengan permukaan atau tangan sekaligus melindungi diri dari infeksi
dan orangorang yang berada di dalam laboratorium.

BAB VI
 DAFTAR PUSTAKA

1. The United States Pharmacopeial Convention, 2009. The United States Pharmacopeia 32,
Board of Trustees.
2. Medicines Commission, 2005. British Pharmacopoeia IV, Council of Europe.
3. Radji, DR. Maksum, M.Biomed.Buku Ajar Mikrobiologi
(PanduanMahasiswaFarmasidanKedokteran).Jakarta:PenerbitBukuKedokteran EGC,2011.
4. Pratiwi, Sylvia T.Mikrobiologi Farmasi.Jakarta:Erlangga,2009.