Células humanas viejas rejuvenecidas en un

descubrimiento revolucionario sobre el

envejecimiento
Investigadores de las Universidades de Exeter y Brighton descubrieron una nueva forma de
rejuvenecer las células viejas en el laboratorio, haciendo que no solo se vean más jóvenes, sino
que empiecen a comportarse más como células jóvenes.
Un equipo dirigido por la profesora Lorna Harries, profesora de Genética Molecular en la Universidad de
Exeter, ha descubierto una nueva forma de rejuvenecer las células senescentes inactivas. A las pocas
horas de tratamiento, las células más viejas empezaron a dividirse y tenían telómeros más largos, los
"límites" de los cromosomas que se acortan a medida que envejecemos.
Este descubrimiento, financiado por Dunhill Medical Trust, se basa en hallazgos anteriores del grupo
Exeter que mostraron que una clase de genes llamados factores de empalme se desactivan
progresivamente a medida que envejecemos. El equipo de investigación de la Universidad de Exeter, en
colaboración con el profesor Richard Faragher y la Dra. Elizabeth Ostler de la Universidad de Brighton,
descubrió que los factores de empalme pueden volver a activarse con productos químicos, lo que hace
que las células senescentes no solo parezcan físicamente más jóvenes, sino que comiencen a
comportarse más como jóvenes Células y empieza a dividir.
Los investigadores aplicaron compuestos llamados análogos de reversatrol, químicos basados en una
sustancia que se encuentra naturalmente en el vino tinto, el chocolate negro, las uvas rojas y los
arándanos, a las células en cultivo. Los productos químicos causaron factores de empalme, que se
apagan progresivamente a medida que envejecemos para volver a encenderlos. En cuestión de horas, las
células parecían más jóvenes y comenzaron a rejuvenecerse, comportándose como células jóvenes y
dividiéndose.
La investigación La modulación de moléculas pequeñas de la expresión del factor de empalme se asocia
con el rescate de la senescencia celular , se publica en la revista BMC Cell
Biology , https://bmccellbiol.biomedcentral.com/articles/10.1186/s12860-017-0147-7 .
El descubrimiento tiene el potencial de conducir a terapias que podrían ayudar a las personas a envejecer
mejor, sin experimentar algunos de los efectos degenerativos de envejecer. La mayoría de las personas a
la edad de 85 años han experimentado algún tipo de enfermedad crónica y, a medida que las personas
envejecen, son más propensas a sufrir derrames cerebrales, enfermedades cardíacas y cáncer.
El profesor Harries dijo: “Este es un primer paso para tratar de hacer que las personas vivan vidas
normales, pero con salud para toda la vida. Nuestros datos sugieren que el uso de productos químicos
para volver a activar la clase principal de genes que están desactivados a medida que envejecemos
podría proporcionar un medio para restaurar la función de las células viejas ".
La Dra. Eva Latorre, investigadora asociada de la Universidad de Exeter, quien llevó a cabo los
experimentos, se sorprendió por el alcance y la rapidez de los cambios en las células.
“Cuando vi que algunas de las células del plato de cultivo se rejuvenecían, no lo podía creer. Estas células
viejas parecían células jóvenes. Era como la magia ", dijo ella. “Repetí los experimentos varias veces y en
cada caso las células se rejuvenecieron. Estoy muy emocionado por las implicaciones y el potencial de
esta investigación ".
A medida que envejecemos, nuestros tejidos acumulan células senescentes que están vivas pero no
crecen ni funcionan como deberían. Estas células viejas pierden la capacidad de regular correctamente la
salida de sus genes. Esta es una de las razones por las cuales los tejidos y órganos se vuelven
susceptibles a las enfermedades a medida que envejecemos. Cuando se activan, los genes emiten un
mensaje que da las instrucciones para que la célula se comporte de cierta manera. La mayoría de los
genes pueden hacer más de un mensaje, lo que determina cómo actúa la célula.
Los factores de empalme son cruciales para garantizar que los genes puedan realizar su gama completa
de funciones. Un gen puede enviar varios mensajes al cuerpo para realizar una función, como la decisión
de crecer o no nuevos vasos sanguíneos, y los factores de empalme toman la decisión sobre qué mensaje
enviar. A medida que las personas envejecen, los factores de empalme tienden a funcionar de manera
menos eficiente o en absoluto, restringiendo la capacidad de las células para responder a los desafíos de
su entorno. Las células senescentes, que se pueden encontrar en la mayoría de los órganos de las
personas mayores, también tienen menos factores de empalme.
El profesor Harries agregó: “Esto demuestra que cuando se tratan células viejas con moléculas que
restauran los niveles de los factores de empalme, las células recuperan algunas características de la
juventud. Son capaces de crecer, y sus telómeros, las tapas en los extremos de los cromosomas que se
acortan a medida que envejecemos, ahora son más largos, ya que están en las células jóvenes. Se
necesita mucha más investigación ahora para establecer el verdadero potencial de este tipo de enfoques
para abordar los efectos degenerativos del envejecimiento. ”
El profesor Richard Faragher, de la Universidad de Brighton, abogará hoy por una mayor investigación
sobre los efectos degenerativos del envejecimiento en un debate sobre si la ciencia debería usarse para
prolongar la vida útil de las personas.
“En un momento en el que nuestra capacidad para traducir los nuevos conocimientos sobre los
mecanismos del envejecimiento en medicamentos y consejos sobre el estilo de vida solo está limitada por
una escasez crónica de fondos, las personas mayores no son atendidas por la auto-indulgente ciencia
ficción. Necesitan acciones prácticas para restablecer su salud y la necesitan ayer ”, dijo.
El profesor Faragher agregó: "Nuestro descubrimiento del rejuvenecimiento celular utilizando estos
compuestos simples muestra el enorme potencial de la investigación sobre el envejecimiento para mejorar
la vida de las personas mayores"
Fecha: 7 de noviembre de 2017.
 La modulación de moléculas pequeñas de la
expresión del factor de empalme se asocia
con el rescate de la senescencia celular
 Eva Latorre ,
 Vishal C. Birar ,
 Angela N. Sheerin ,
 J. Charles C. Jeynes ,
 Amy Hooper ,
 Helen R. Dawe ,
 David Melzer ,
 Lynne S. Cox ,
 Richard G. A. Faragher ,
 Elizabeth L. OstlerCorreo electrónico autor y
 Lorna W. HarriesAutor de correo electrónico

Serie BMC debiología celular deBMC - abierta, inclusiva y confiable201718 : 31

https://doi.org/10.1186/s12860-017-0147-7
© El autor (es). 2017

 Recibido el 10 de julio de 2017.

 Aceptado: 9 de octubre de 2017
 Publicado el 17 de octubre de 2017
Resumen
Fondo
La expresión alterada de los factores de empalme del ARNm se produce con el
envejecimiento in vivo y se cree que es un mecanismo de envejecimiento. La acumulación de
células senescentes también ocurre in vivo con el avance de la edad y causa mucha patología
degenerativa relacionada con la edad. Sin embargo, la relación entre estos dos procesos es
opaca. En consecuencia, desarrollamos un nuevo panel de moléculas pequeñas basadas en el
resveratrol, previamente sugerido para alterar el empalme del ARNm, para determinar si la
expresión del factor de empalme alterado tenía potencial para influir en las características de
la senescencia replicativa.

Resultados
El tratamiento con resveralogos se asoció con la expresión del factor de empalme alterado y
el rescate de múltiples características de la senescencia. Este rescate fue independiente del
ciclo del ciclo celular y también independiente de SIRT1, modulación SASP o senolisis. En
condiciones de crecimiento permisivo, las células que demostraron la expresión restaurada
del factor de empalme también demostraron una mayor longitud de los telómeros, reiniciaron
el ciclo celular y reanudaron la proliferación. Estos fenómenos también fueron influenciados
por antagonistas y agonistas de ERK.
 Conclusiones
Esta es la primera demostración de que la moderación de los niveles de factor de empalme se
asocia con la reversión de la senescencia celular en los fibroblastos primarios humanos. Por
lo tanto, los moduladores de moléculas pequeñas de tales objetivos pueden representar
prometedoras terapias no degenerativas.

Palabras clave

 Splicing alternativo
 Envejecimiento
 Resveratrol
 Senectud
 Fibroblastos

Fondo
El procesamiento del ARN mensajero (ARNm) se ha implicado como un determinante clave
de la vida útil. La expresión del factor de empalme está desregulada en la sangre periférica de
los humanos que envejecen, donde son la principal clase de ontología de genes funcionales
cuyos patrones de transcripción se alteran con el avance de la edad [ 1 ] y en células humanas
primarias senescentes de múltiples linajes [ 2 ]. La expresión del factor de empalme también
es un determinante temprano de la longevidad en el ratón y el hombre [ 3 ], y en ambas
especies es probable que estos cambios sean funcionales, ya que están asociados con
alteraciones en el uso del sitio de empalme para muchos genes [ 1 3 ]. Los datos recientes
sugieren que la modificación de los niveles de SFA-1, un componente central del
spliceosome, influye en la vida útil en, 2 ,C. elegans a través de la interacción con la
maquinaria TORC1 [ 4 ]. Las enfermedades para las que la edad es un factor de riesgo
significativo, como la enfermedad de Alzheimer [ 5 ], la enfermedad de Parkinson [ 6 ] y el
cáncer [ 7 ] también están marcadas por cambios importantes en los repertorios de isoformas,
destacando la importancia de un correcto empalme para la salud a lo largo del ciclo de
vida. Por lo tanto, la pérdida del ajuste fino de la expresión génica en los tejidos envejecidos
y la falla resultante para responder adecuadamente a los estresores celulares intrínsecos y
extrínsecos tiene el potencial de contribuir de manera importante al aumento de la fragilidad
fisiológica observada en los organismos envejecidos [ 8 ].

El proceso de empalme está regulado en dos niveles. En primer lugar, el empalme

constitutivo es llevado a cabo por el spliceosome central, que reconoce los sitios de donante y
aceptor de empalme que definen intrones y exones. Sin embargo, el control preciso del uso
del sitio de empalme está orquestado por una interacción compleja entre las proteínas
reguladoras de empalme, tales como la clase de arginina (SR) de serina de los activadores de
empalme y la clase de represores de empalme ribonucleoproteína heterogénea (hnRNP). Los
activadores de empalme se unen a los mejoradores de empalme de intrones y exones (ESE,
ISE), y los inhibidores de empalme a los silenciadores de empalme de intrones y exones
(ESS, ISS). El uso del sitio de empalme se basa en el equilibrio entre estos factores y se
produce de una manera dependiente de la concentración [ 9 11, 10 , , 14 ,]. Otros aspectos de
la transferencia de información del ADN a la proteína, como la exportación de ARN y la
estabilidad del ARNm también están influenciados por factores de empalme [ 12 ]. De
manera intrigante, además de sus funciones de empalme, muchos factores de empalme tienen
funciones adicionales no canónicas que regulan los procesos relevantes para el
envejecimiento. Por ejemplo, se ha demostrado que hnRNPK, hnRNPD y hnRNPA1 tienen
roles en el mantenimiento de los telómeros [ 1315 ], hnRNPA1 regula la estabilidad de los
transcritos de ARNm de SIRT1 [ 16] y hnRNPA2 / B1 participa en el mantenimiento de las
poblaciones de células madre [ 17 ]. Se sabe que la expresión del factor de empalme está
desregulada en células senescentes de múltiples linajes [ 2]] y ahora está bien establecido que
la acumulación de células senescentes es una causa directa de múltiples aspectos tanto del
envejecimiento como de la enfermedad relacionada con la edad en los mamíferos [ 18 ].

Las células senescentes se acumulan progresivamente a lo largo de la vida en una variedad de

especies de mamíferos [ 15 ], y la senescencia prematura es un sello distintivo de muchos
síndromes de progeroides humanos. A la inversa, la restricción dietética, que aumenta la
longevidad, retrasa la acumulación de células senescentes. Lo más convincente es que la
eliminación de células senescentes en ratones transgénicos mejora múltiples aspectos de la
vida posterior y prolonga la vida útil [ 19 ]. Los mecanismos por los cuales las células
senescentes median estos efectos perjudiciales son complejos, pero incluyen factores como la
calcificación ectópica en el caso de las células musculares lisas vasculares [ 20 ] y la
secreción de citoquinas proinflamatorias, el conocido Fenotipo secretor asociado a la
senescencia (SASP) [ 21]. Estas observaciones sugieren que puede existir una interrelación
entre los mecanismos de envejecimiento bien caracterizados, como la senescencia celular, y
la maquinaria de empalme de ARN donde la relación mecánica con el envejecimiento sigue
siendo en gran medida correlacional.

En contraste con la situación de las proteínas spliceosomal del núcleo como SFA-1, la
perturbación de un solo regulador de empalme mediante técnicas moleculares estándar como
la eliminación o la sobreexpresión es poco probable que sea informativa para evaluar los
efectos sobre el envejecimiento y la senescencia celular, ya que el envejecimiento se
caracteriza por Coordinación de la desregulación de grandes módulos de factores de empalme
[ 1 , 2 ]. La elección del sitio de empalme también depende del equilibrio entre más de cien
activadores de empalme y proteínas reguladoras del inhibidor de empalme, que difieren entre
el sitio de empalme y el sitio de empalme y de tejido a tejido [ 9 , 10]. Por lo tanto, se
requieren herramientas experimentales capaces de modular de manera coordinada la
expresión de múltiples componentes simultáneamente para abordar los efectos potenciales de
la desregulación de un gran número de factores de empalme que notamos durante el proceso
de envejecimiento. Se ha informado que las moléculas pequeñas, como el resveratrol,
influyen en la expresión del factor regulador del empalme en líneas celulares transformadas
como HEK293 y HeLa [ 22 ], aunque todavía no se sabe si esto es un efecto directo o
indirecto. Desafortunadamente, el resveratrol tiene múltiples efectos biológicos, incluida una
reducción de la expresión de citoquinas proinflamatorias [ 23 ], así como su actividad
canónica contra SIRT1 [ 24]] por lo tanto, no se puede lograr una evaluación 'limpia' de los
efectos de la moderación de los niveles de factor de empalme en la fisiología celular
utilizando este compuesto solo.

Hemos superado esta limitación mediante el desarrollo de una nueva biblioteca de

compuestos relacionados con el resveratrol (resveralogues) que son capaces de influir directa
o indirectamente en la expresión de múltiples factores de empalme
de SRSF y HNRNP.subtipos, mientras que exhibe actividad diferencial contra SIRT1 y
 SASP. El tratamiento de los fibroblastos humanos senescentes de diferentes linajes de
desarrollo con cualquiera de estas nuevas moléculas cambia los patrones de expresión de
múltiples factores de empalme a aquellos característicos de las células de pasaje mucho más
tempranas. Este cambio se produce independientemente del ciclo del ciclo celular y se asocia
con una disminución marcada en los biomarcadores bioquímicos y moleculares clave de la
senescencia sin ninguna alteración significativa en los niveles de apoptosis. La expresión
elevada del factor de empalme también está asociada con el alargamiento de los telómeros, y
en condiciones de crecimiento permisivo, estas poblaciones previamente senescentes
muestran aumentos significativos en la fracción de crecimiento (medida por la tinción con
Ki67) y en el número de células absolutas, lo que indica el reingreso del ciclo celular. Los
mecanismos por los cuales se produce el "rejuvenecimiento" son independientes tanto de la
activación de SIRT1, como de los efectos en el SASP. Por lo tanto, las moléculas que
modulan los patrones de empalme del ARN, ya sea directa o indirectamente, pueden tener el
potencial de retrasar o revertir la senescencia celular con el consiguiente impacto positivo en
la salud humana.

Resultados
Síntesis de nuevos resveralogos.
Se ha informado que el resveratrol (RSV) prolonga la vida útil en varios organismos
modelo a través de la activación de la proteína desacetilasa dependiente de NAD,
SIRT1 [ 24 ], mientras que la reposición de NAD +mejora la vida útil y la esperanza de
vida en ATM - gusanos y ratones [ 25 ]. Por lo tanto, nos propusimos diseñar
racionalmente un panel de nuevos compuestos similares al resveratrol (Fig. 1a ) con
el objetivo de identificar compuestos que podrían restaurar la expresión del factor de
empalme a niveles comparables con los observados en células jóvenes, pero con
diferentes efectos en la activación de SIRT1 y el fenotipo secretor asociado a la
senescencia (SASP) para permitir la evaluación del mecanismo molecular. La síntesis
de la columna vertebral se logró como se informó anteriormente [ 26].], con
funcionalidad y diversidad adicionales logradas a través de la interconversión de
grupos funcionales (Fig. 1b ). Los compuestos se eligieron para un análisis adicional
basado en (i) novedad estructural y baja citotoxicidad (ii) actividad de activación de
SIRT1 diferencial (iii) efectos diferenciales en la supresión de componentes de SASP
y (iv) aumentos observados previamente en la fracción positiva de Ki67 de cultivos de
MRC5 en 5 μM. También incluimos el compuesto principal (resveratrol) y un
metabolito principal (dihidrorosveratrol).
Figura 1
Síntesis y caracterización de nuevos resveralogos. a Estructuras de resveralogos 1–6. Los
compuestos son: 1 resveratrol, 2 metabolitos primarios de resveratrol,
dihidrorresveratrol, 3 ( E ) -N- (4- (3,5-dimetoxiestiril) fenil) metanosulfonamida, 4 ( E) -N-
(4- (3,5-dihidroxiestiril) ) fenil) acetamida, 5 ( e ) -5- (4- (3,5-dimetoxiestiril) fenil) -1 H -
tetrazol y 6 ( e ) -5- (2- (3,5-dimetoxiestiril) fenil) - 1 H –tetrazol. b Esquema de síntesis de
compuestos 3–6.(ver Métodos para más detalles). c Determinación de la fluorescencia de la
actividad de SIRT1 in vitro en presencia de 25 µM de cada compuesto, normalizado contra el
resveratrol (1) y el control de vehículo solo (0). Los datos se presentan como el cambio en el
pliegue (media ± SD) en la actividad normalizada a enzima solo (0) y resveratrol (1), de
modo que 0 representa sin activación, y 1.0 indica activación equivalente a la observada con
resveratrol 1. El experimento se realizó en 3 repeticiones. Los números en el eje X ( 1–6 ) se
refieren a la identidad de cada resveralogue como se indica arriba. La incertidumbre se
calculó sometiendo la desviación estándar del control, el resveratrol y los datos compuestos a
una combinación utilizando métodos estándar para la propagación de la incertidumbre [ 49 ]
La activación de SIRT1 se altera significativamente después de la modificación de la cadena
lateral del resveratrol
Dado que se ha sugerido que el RSV ejerce sus efectos pro-longevidad predominantemente a
través de la activación de SIRT1, primero probamos la capacidad de nuestros nuevos
compuestos para activar SIRT1 en un ensayo enzimático ex vivo (Fig. 1c ), con datos
normalizados contra la actividad detectada en el tratamiento con resveratrol
(RSV, 1 ). Mientras que el dihidroresveratrol (Fig. 1 a, 2 ) mostró una actividad de
activación de SIRT1 equivalente a la del resveratrol, los cuatro análogos nuevos ( 3-6 )
mostraron un rango de actividades desde cero (compuesto 3 ) hasta alrededor del 75% de los
niveles de control (compuesto 4 ) (Fig. 1c). Estas marcadas diferencias en la activación de
SIRT1 por los nuevos resveralogos (en comparación con RSV y DHRSV), por lo tanto, nos
permiten investigar la dependencia de SIRT1 de cualquier efecto biológico.

Impacto de los resveralogos en el fenotipo secretor asociado a la senescencia

Luego nos propusimos determinar si el tratamiento con resveratrol o los nuevos
resveralogos tenían un impacto en el fenotipo secretor asociado a la senescencia
(SASP) en cultivos senescentes de fibroblastos humanos (NHDF). Los niveles de
múltiples citoquinas, incluidos los componentes clave de SASP (IL6, IL8, TNFα, IL2,
IL1β, IL-12p70, IL10, INFγ y GMCSF) se determinaron en NHDF senescente mediante
ELISA (Fig. 2 ). Aunque cada uno de los compuestos alteró los perfiles de citoquinas
en cierta medida (Fig. 2 , ver también Archivo adicional 1 : Tabla S1), no hubo un
patrón consistente con el cual esto ocurrió. Resveratrol 1fue el único compuesto para
reducir los niveles de múltiples citocinas, incluidos los mediadores clave de SASP IL-
6 e IL-8, así como IL2, TNFα e IFNγ, de acuerdo con informes anteriores [ 27 ]. Por el
contrario, el tratamiento con dihidroresveratrol (2) elevó significativamente los niveles
de IL-8 y varios otros mediadores inflamatorios, mientras que 3-6 tuvieron un impacto
variable en la expresión de las proteínas SASP analizadas. La única citoquina que
mostró una reducción constante en el nivel en respuesta a los 6 compuestos fue IL-
10 (Fig. 2 , archivo adicional 1 : Tabla S1).
Figura 2
Efectos diferenciales de los resveralogos sobre el fenotipo secretor asociado a la senescencia
(SASP). Los niveles de proteína de diversos factores proinflamatorios de SASP se
determinaron utilizando la plataforma ELISA de mesoescala en medio de cultivo de cultivos
senescentes de HNDF tratados con resveralogos de 5 µM 1-6. El mapa de calor indica
cambios en el pliegue. Con = control (solo vehículo). Verde indica regulación hacia arriba
mientras que rojo indica regulación hacia abajo. La escala de colores se refiere al cambio
porcentual en la expresión. Los experimentos se realizaron por duplicado un total de 10
veces.
La expresión del factor de empalme y los patrones de empalme de los genes asociados a la
senescencia se restauran en cultivos senescentes de fibroblastos después del tratamiento con
resveralogues
Para establecer si el RSV y los nuevos resveralogos podrían influir en los reguladores
de empalme, primero medimos la expresión del factor de empalme mediante qRT-
PCR en cultivos senescentes de fibroblastos humanos (NHDF) después de un
tratamiento de 24 h con 5 μM de compuestos 1–6 . De acuerdo con estudios previos
en células HEK293 [ 22 ], encontramos que el tratamiento con resveratrol ( 1 )
incrementó los niveles de activadores de empalme ( transcripciones SRSF ) e
inhibidores ( transcripciones HNRNP ) (Fig. 3a ). Es importante destacar que los
nuevos análogos de resveratrol también restauraron parcialmente los niveles de
transcripción del inhibidor y del activador de empalme (Fig. 3a , archivo adicional 2:
Tabla S2). El nivel de restauración de la expresión del regulador de empalme en las
células tratadas fue similar a los niveles informados previamente en los fibroblastos
de paso temprano [ 2 ]. Esta inversión de la disminución relacionada con la edad en
la expresión del factor de empalme estuvo presente para los compuestos sin actividad
de SIRT discernible (compuesto 3 ), así como para aquellos que elevaron los niveles
de IL6 e IL8 (compuestos 2 y 5 ), lo que indica que la acción de los factores de
empalme es Independiente de SIRT1 y el SASP.
Fig. 3
Los reguladores del factor de empalme están elevados después del tratamiento con análogos
de resveratrol. Cambios en los niveles de mRNA en células HNDF en respuesta al
tratamiento con 5 μM de resveratrol ( 1 ) o resveralogues 2-6determinados por PCR
cuantitativa de transcripción inversa. a Expresión de genes reguladores del factor de empalme
( b ) Transcripciones de isoformas específicas de genes asociados con senescencia y / o
respuestas de daño al ADN. Con = control (solo vehículo). Verde indica genes regulados por
incremento, rojo indica genes regulados por disminución. La escala de colores se refiere al
cambio en la expresión. Los datos se derivan de pruebas duplicadas de 3 réplicas biológicas
Luego preguntamos si esta restauración de un complemento "juvenil" de factores de empalme
es biológicamente relevante. Para hacer esto, examinamos los perfiles de empalme
alternativos de genes clave involucrados en la senescencia celular en cultivos senescentes de
NHDF tratados con cada uno de los compuestos (Fig. 3b ). En algunos casos, no fue posible
distinguir un efecto en el empalme de los efectos en la transcripción, ya que varias isoformas
se vieron afectadas con la misma direccionalidad. Por ejemplo,
ambas isoformas p14ARF y p16INK4A del gen CDKN2A , que aumenta con la senescencia
celular [ 28], fueron regulados a la baja en respuesta al tratamiento con la mayoría de los
resveralogues. Sin embargo, en otros casos, solo una isoforma fue afectada; la expresión de la
isoforma p21b pro-apoptótica, pero no la isoforma consenso p21a del gen CDKN1A se alteró,
lo que demuestra un efecto sobre el empalme. De manera similar, se observó una mayor
expresión de la isoforma CHK1S del gen CHK1 , que induce la mitosis [ 29 ], pero no
la isoforma de consenso CHK1 que no lo hace (archivo adicional 2 : Tabla S2). SIRT1La
expresión del ARNm se reguló al alza mediante el tratamiento con los nuevos resverálogos,
pero no con el propio RSV. Un importante regulador de la proliferación celular y el potencial
conductor de la senescencia es mTOR: la inhibición de mTORC1 por la rapamicina aumenta
la longevidad en modelos animales [ 30 ], mientras que la inhibición de mTORC puede
revertir múltiples fenotipos de senescencia celular [ 31 ]. Encontramos una expresión elevada
de las isoformas mTORα y β, que regulan el metabolismo celular y la proliferación celular
respectivamente [ 32 ], en el tratamiento con resveralogues 1–4 (Fig. 3b , archivo
adicional 2 : Tabla S2), aunque mTORβ se eliminó con la exposición De celdas a
resveralogues 5 y 6.. En general, los cambios en las isoformas expresadas alternativamente
después del tratamiento con resveralogía son consistentes con un cambio hacia un repertorio
más competente para la proliferación.

El tratamiento de las células senescentes con resveralogos está asociado con la reducción de
biomarcadores de senescencia
Para evaluar si la expresión restaurada del factor de empalme se asoció con el rescate
de la senescencia celular, se trataron cultivos senescentes de fibroblastos diploides
humanos normales de tres cepas de células genéticamente distintas (fibroblastos
dérmicos NHDF y HF043 y fibroblastos de pulmón MRC5) durante 24 h con
compuestos 3–6. en comparación con RSV (1) y DHRSV (2) y los niveles de
transcripción medidos de los biomarcadores de senescencia CD248 y CDKN2A (que
codifican p16 INK4 / 6 ) mediante PCR cuantitativa de transcripción inversa, normalizados
contra el IDH3B , GUSB y PPIALos genes de control endógeno, que hemos
encontrado estables en respuesta a la senescencia y al envejecimiento en nuestro
trabajo anterior [ 1 , 2 ]. La estabilidad de los genes de control para el tratamiento de
resveralogue se verificó empíricamente. Si bien observamos diferencias entre los
linajes celulares, hubo una disminución general significativa en los marcadores
moleculares de senescencia CDKN2A y CD248 en comparación con las poblaciones
de células de control de solo vehículo (Fig. 4a), que fue el más marcado para la línea
de fibroblastos de prepucio HF043. Para evaluar más a fondo la senescencia,
examinamos los niveles de β galactosidasa asociada a senescencia (SA β-Gal). El
porcentaje de células NHDF con tinción positiva para SA β-Gal disminuyó de ~ 75 a
~ 25%, en comparación con niveles mucho más bajos (~ 7%) en células más jóvenes
en PD25 (Fig. 4b ), y reducciones similares altamente significativas en SA β -Se
observó reactividad de gal en cultivos senescentes de fibroblastos MRC5 y HF043
(Fig. 4b ). Estas reducciones en los marcadores de senescencia aún eran evidentes
en las células NHDF 4 semanas después del tratamiento inicial y se produjeron
mayores reducciones después de los tratamientos repetidos a intervalos de 48 h
(archivo adicional 3: Figura S1). Concluimos, por lo tanto, que los marcadores de
senescencia disminuyen notablemente con el tratamiento con resveralogo. Dado que
el compuesto 3 (que no activa SIRT1) tiene efectos muy similares en estos
biomarcadores de senescencia en comparación con el resveratrol y otros
resveralogos con actividad de activación de SIRT variable ( 4, 5, 6 ), podemos concluir
que la disminución en la expresión del biomarcador de senescencia en El tratamiento
con resveralogo puede ocurrir independientemente de la activación de SIRT1.
Fig. 4
Biomarcadores de senescencia disminuida en el tratamiento con resveralogía ( a ) Los niveles
de transcritos asociados a la senescencia CDKN2A y CD248 se evaluaron en poblaciones
senescentes de fibroblastos NHDF, MRC5 y HF043 mediante PCR cuantitativa de
transcripción inversa. Los datos se expresan en relación con los genes de control endógeno
estable GUSB, IDH3B y PPIA, y se normalizan a los niveles de las transcripciones
individuales en los controles no tratados (c), 1–6 = resveralogues 1–6 . El cambio en el
doblez se calculó por triplicado para tres réplicas biológicas ( b ) β-galactosidasa asociada a
la senescencia después del tratamiento con resveralogues 1-6se determinó contando
manualmente el porcentaje de células positivas para SA-β gal (NHDF, MRC5 y HF043) en
cada población tratada o de control. n > 300 para cada muestra. La significación estadística
se indica mediante * = p <0.05, ** = p <0.005, *** = p <0.0005 (ANOVA de 2 vías)
El tratamiento de las células senescentes con resveralogos se asocia con el reingreso del ciclo
celular
Si bien las disminuciones en los biomarcadores de senescencia pueden ser
beneficiosas para aliviar algunos de los efectos perjudiciales de las células
senescentes, es la pérdida de la capacidad proliferativa de las poblaciones de células
senescentes la que puede conducir al agotamiento de las células madre y la pérdida
de la función / fragilidad de los tejidos con el aumento de la edad [ 33 ]. Por lo tanto,
también evaluamos la proliferación celular y la reentrada en el ciclo celular
proliferativo. Inicialmente, utilizando imágenes de células vivas de células NHDF
senescentes tratadas con resveratrol durante hasta 92 h, encontramos que algunas
células dentro de esta población mostraron evidencias claras de mitosis en tan solo
17.5 h después del tratamiento (archivo adicional 4: Figura S2). Por lo tanto,
evaluamos si las poblaciones senescentes de tres líneas de fibroblastos diferentes
(NHDF, MRC5 y HF043) podrían sufrir mitosis después del tratamiento con los nuevos
compuestos. Sorprendentemente, el tratamiento con dosis incluso muy bajas (5 µM)
de los resveralogues llevó a aumentos significativos (hasta 0,6 duplicaciones de la
población) en el número total de células durante solo 24 h de exposición al fármaco,
mientras que los controles solo en vehículos permanecieron detenidos por la
proliferación (Fig. 5a ). Los aumentos en el número de células sugieren fuertemente
que una proporción significativa de células en la población senescente no cíclica ha
sido inducida a volver a entrar en el ciclo celular mitótico.

Fig. 5
Aumento de la proliferación de poblaciones de células senescentes después del tratamiento
con resveralogue. a Números de células de las poblaciones de fibroblastos NHDF, MRC5 y
HF043 después del tratamiento con resveralogos 1–6 . Los experimentos se llevaron a cabo
por triplicado para tres réplicas biológicas y *** representa p <0,001 (ANOVA de 2
vías). b Se evaluó el índice de proliferación para el control y los NHDF tratados, así como las
células más jóvenes (PD25) según se evaluó mediante inmunofluorescencia Ki67 (> 400
núcleos contados por muestra, *** p <0,001 por ANOVA de 2 vías). c La longitud del
telómero se cuantificó mediante qPCR en relación con el 36B4control endógeno y
normalizado a la longitud de los telómeros en controles de solo vehículo, células de pasaje
más jóvenes (PD25) y en células tratadas con los compuestos 1-6 . Los experimentos se
llevaron a cabo por triplicado para tres réplicas biológicas. La significación estadística se
indica mediante * = p <0.05, ** = p <0.005, *** = p <0.0005 (ANOVA de 2 vías)
La cinética de proliferación celular se ve alterada en las células tratadas.
Para investigar más a fondo esta posible inducción de la proliferación, se determinaron las
cinéticas de proliferación de estos cultivos mediante la medición histoquímica e
inmunocitoquímica de los niveles del marcador de proliferación, Ki67, y el marcador de
senescencia, SA β-Gal, respectivamente. Los compuestos 1-6 indujeron un aumento
constante en la fracción de células positivas para Ki67 en cultivos senescentes de NHDF
desde aproximadamente el 20% de los núcleos hasta aproximadamente el 40%, mientras que
los niveles en células más jóvenes en PD25 fueron> 90% (Fig. 5b ), consistente con el
hallazgos de un aumento en el número de células y figuras mitóticas luego de la
administración del medicamento (Fig. 5a , archivo adicional 4: Figura S2 y datos no
mostrados). Dado que el aumento en el número de células que se tiñen para el marcador de
proliferación Ki67 se correlaciona inversamente con la disminución de los números que tiñen
para SA-β gal (ver Fig. 4b ), sugerimos que las células han salido de la senescencia para
ingresar al ciclo celular.

El tratamiento de las células senescentes con resveralogos se asocia con el alargamiento de los
telómeros
El acortamiento de los telómeros es quizás el desencadenante más conocido de la senescencia
celular. Se ha demostrado previamente que varios factores de empalme desenrollan los
telómeros y activan la telomerasa y, por lo tanto, podrían alargar los telómeros
[ 13 , 14 , 34 ]. Por lo tanto, medimos la longitud del telómero por qPCR en células NHDF
tratadas con resveratrol 5 μM o resveralogues durante 24 h, en relación con la longitud del
telómero en células no tratadas. Encontramos que las células tratadas con resveratrol o
cualquiera de los nuevos resverálogos tenían telómeros que eran 1.3–2.4 veces más largos
que los controles de solo vehículo, en comparación con las células más jóvenes en PD25, que
mostraban a los telómeros 2.6 veces más que las células senescentes no tratadas (Fig. 5c ) .

Los cambios en la expresión del factor de empalme y los marcadores de senescencia no son
efectos de la proliferación celular
Para determinar si los cambios en la expresión del factor de empalme fueron una
causa o consecuencia de la proliferación celular renovada, medimos la expresión del
factor de empalme y seleccionamos marcadores de senescencia en condiciones
séricas bajas, lo que induciría a las células en proliferación a entrar en la
quiescencia. Como era de esperar, los cultivos carentes de suero no demostraron
ningún aumento en la proliferación celular en respuesta al tratamiento con
resveralogo, determinado por la falta de un aumento observable en el número de
células (Fig. 6a ) o el índice Ki67 (Fig. 6b ) en las células tratadas. Sin embargo, los
efectos sobre los marcadores de senescencia (Fig. 6c ) y la expresión del factor de
empalme (Fig. 6d) . ) todavía se observaron, lo que indica que los efectos sobre la
senescencia y la expresión del factor de empalme fueron independientes de la
proliferación. Desacoplar el rescate de la proliferación también nos permite cuantificar
con mayor precisión el porcentaje de células en las que la senescencia se ha revertido
a partir del efecto de dilución del aumento del número de células. El número de células
"revertidas" es de ~ 15%, que es similar a los niveles que predecimos según la cinética
de proliferación celular.
Fig. 6
Efectos del tratamiento con resveratrol en células cultivadas en condiciones de privación de
suero. a Números celulares de fibroblastos NHDF después del tratamiento con resveratrol 5
μM durante 24 h en condiciones de inanición sérica. Los experimentos se llevaron a cabo por
triplicado para tres réplicas biológicas. (2 vías ANOVA). b Se evaluó el índice de
proliferación para fibroblastos de NHDF después del tratamiento con resveratrol 5 μM
durante 24 h en condiciones de inanición sérica según lo evaluado por inmunofluorescencia
Ki67 (> 400 núcleos contados por muestra). doLa senescencia asociada a β-galactosidasa
después de fibroblastos NHDF después del tratamiento con resveratrol 5 mM durante 24 h en
condiciones de inanición sérica se determinó contando manualmente el porcentaje de células
positivas para SA-β gal en cada población tratada o de control. n > 300 para cada
muestra. La significación estadística se indica mediante *** = p <0,0005 (ANOVA de 2
vías). d Cambios en los niveles de ARNm del factor de empalme en fibroblastos de NHDF
después del tratamiento con 5 μM de resveratrol durante 24 h en condiciones de inanición
sérica determinadas por qRTPCR. Control = solo vehículo. Verde indica genes regulados por
incremento, rojo indica genes regulados por disminución. La escala de colores se refiere al
cambio en la expresión. Los datos se derivan de pruebas duplicadas de 3 réplicas biológicas
 La disminución de la fracción de células senescentes no se debe a la muerte selectiva de las
células senescentes
Para excluir la posibilidad de que la disminución en el porcentaje de células senescentes
después del tratamiento resultara de la muerte celular selectiva de células no proliferativas, se
evaluó la citotoxicidad utilizando un ensayo para la lactato deshidrogenasa extracelular
(LDH); esta enzima intracelular solo se libera en el medio de cultivo después de la muerte
celular. En todos los casos, las células tratadas con los nuevos compuestos liberaron niveles
más bajos de LDH que las tratadas con RSV (en dosis de hasta 100 μM) en comparación con
los controles de solo vehículo (archivo adicional 5 : Figura S3); el compuesto 6 en particular
mostró niveles muy bajos de liberación de LDH. Estos resultados demuestran una baja
citotoxicidad del dihidrorosveratrol y los cuatro nuevos resverálogos.

Si bien no se detectó la muerte celular necrótica, fue importante descartar la pérdida selectiva
de células senescentes por apoptosis. Los niveles de apoptosis en cultivos senescentes de
NHDF tratados con resveralogues 1–6se determinaron mediante los ensayos TUNEL y
Caspase 3 y 7 (archivo adicional 5 : Figura S3B y C). No se observaron aumentos en los
niveles de apoptosis en los cultivos tratados con resveralogue en comparación con los
tratamientos de control de solo vehículo, lo que sugiere que el aumento de la proliferación en
el tratamiento con resveralogue no fue una consecuencia de la muerte selectiva de células no
proliferativas dentro de la población.

Los agonistas y antagonistas de ERK influyen en la senescencia celular y en la expresión del

factor de empalme
Se ha informado previamente que la señalización ERK está influenciada por el resveratrol
[ 35 , 36 ]. ETS-1, un factor de transcripción posterior a la activación de ERK, también se ha
informado que regula la expresión de TRA2B , un importante regulador de empalme
[ 37]. Para investigar la posible interacción entre el resveratrol y la señalización ERK en la
expresión del factor de empalme y los fenotipos de senescencia celular, tratamos células
NHDF senescentes con dosis bajas (1 μM o 10 μM) de trametinib, un inhibidor de
señalización bien caracterizado que inhibe la vía de señalización ERK. El tratamiento de las
células senescentes con trametinib produjo una disminución robusta en la proporción de
células senescentes en el cultivo, que fue evidente a 1 μM y 10 μM, pero no a 20 μM. Tales
efectos de dosis no son infrecuentes en las vías de señalización debido a la interconectividad
con otras vías de señalización y la autorregulación (Archivo adicional 6: Figura S4A). A la
inversa, el tratamiento con el agonista ERK ceramida dio lugar a un aumento comparable en
la fracción de células senescentes después de 24 h. Cabe destacar que el efecto de la ceramida
se negó con la adición de 5 µM de cualquiera de los nuevos resveralogos (archivo
adicional 6 : Figura S4B). Trametinib también restauró la expresión del factor de empalme
en perfiles consistentes con pasajes anteriores de una manera similar a la observada con los
resveralogos (archivo adicional 7 : Figura S5).

Discusión
Hemos generado un panel de nuevas moléculas basadas en la pequeña molécula de
resveratrol, para determinar si la alteración de los reguladores del procesamiento del ARNm
podría influir en los fenotipos de senescencia celular en fibroblastos humanos de diferentes
linajes. El tratamiento de cultivos senescentes de células de diferentes orígenes genéticos con
estas nuevas moléculas se asoció con un aumento en la expresión de múltiples factores de
empalme, a niveles consistentes con los observados en células de pasaje temprano [ 2]],
aunque en la actualidad no está claro si estos son efectos directos o indirectos. El tratamiento
con los 6 resverálogos también dio lugar a una disminución de la fracción de células
senescentes, junto con cambios en los patrones de empalme de los genes implicados en la
senescencia celular a un perfil indicativo de células mucho más jóvenes. Nuestra evidencia
sugiere que las células también han vuelto a ingresar al ciclo celular, según lo determinado
por un aumento en los marcadores de división celular con aumentos concurrentes en el
número de células. Finalmente, de acuerdo con la función informada de algunos factores de
empalme en la accesibilidad de los telómeros y la actividad de la telomerasa [ 13 15], 14 ,], la
longitud de los telómeros se alargó en las células tratadas, lo que concuerda con un "reinicio"
del reloj del telómero. La ausencia de cualquier elevación de muerte celular necrótica
(liberación de LDH) o apoptótica (TUNEL y caspasa), también excluye la posibilidad de que
la disminución dramática en la fracción senescente resulte de la destrucción selectiva de
células senescentes por resverálogos.

Se sabe que la interrupción de los niveles de expresión de la transcripción del factor de

empalme es una característica importante del envejecimiento en humanos [ 1 ] y también en
líneas celulares primarias humanas senescentes de múltiples linajes que han experimentado
"envejecimiento" mediante cultivo repetido in vitro [ 2 ]. La expresión del factor de empalme
también está asociada con la vida útil en humanos y también en ratones, donde su expresión
parece ser un factor determinante de la longevidad en la vida temprana [ 3 ]. Los datos
recientes agregan peso a esta hipótesis, ya que la supresión del factor de empalme central 1
(SFA-1) solo fue para reducir la vida útil en C.elegans mediante la interacción con la ruta
TORC1 [ 4 ]. También se sabe que los factores de empalme son conductores de la
proliferación celular [ 38 40]., 39 , , 14 ,], a través de los efectos tanto en los patrones de
empalme, como a través de sus funciones no canónicas en el mantenimiento de los telómeros
[ 13 15 , 17 , 34 ]. El mantenimiento de los telómeros es crítico para permitir la proliferación
celular; la restauración de hTERT permite la proliferación prematura de los fibroblastos del
síndrome de Werner humano para proliferar con la cinética de las células de tipo salvaje
[ 41 ]. Los factores de empalme hnRNPK y hnRNPD interactúan con el promotor hTERT,
mientras que la reducción de hnRNPD reduce notablemente la transcripción del gen de la
telomerasa [ 13 , 14 ]. Además, se requiere hnRNPA1 para el mantenimiento de los telómeros
en múltiples especies y se ha propuesto para facilitar el acceso de la telomerasa al telómero
[ 15].

La pregunta de si la senescencia impulsa los cambios de empalme, o si las alteraciones de

empalme son causantes de senescencia celular en diferentes especies, tejidos y puntos en el
curso de la vida es un desafío y multifacético. Los enfoques convencionales para responder a
esta pregunta son intratables en este sistema, ya que hay más de 100 factores de empalme
involucrados en la regulación del empalme, con el uso de exones determinado por el balance
de activadores e inhibidores en cada sitio de empalme individual [ 10]. El patrón y la dosis de
los factores de empalme involucrados también diferirán del sitio de empalme al sitio de
empalme y del tejido al tejido. También existe una redundancia entre los factores de
empalme, tanto en términos de regulación del empalme, como también en sus funciones no
canónicas: se sabe que al menos 6 hnRNPs y algunas proteínas SRSF tienen efectos sobre la
estructura de los telómeros o la actividad de la telomerasa. Sin embargo, en este estudio
inicial, el problema de la causalidad se puede diluir hasta determinar si los cambios en la
expresión del factor de empalme que observamos en el tratamiento con resveralistas
conducen al rescate de la senescencia o son una consecuencia de la reentrada en el ciclo
celular. La observación de que la alteración en la expresión del factor de empalme y la
disminución en el número de células senescentes se produce cuando se bloquea la
proliferación proporciona evidencia que sugiere que los efectos que observamos pueden estar
más arriba en la ruta causal (Fig. 5).

En la actualidad, no es posible atribuir cambios de empalme específicos a alteraciones en los

niveles de factores de empalme específicos. La elección del sitio de empalme se rige por el
equilibrio de activadores e inhibidores en los sitios de empalme individuales, y los sitios de
unión son cortos y degenerados [ 10]]. De manera similar, en algunos casos, no es posible
determinar si los efectos en la expresión que observamos son transcripcionales o se deben a
empalmes sobre la base de que los cambios en la expresión de isoformas alternativas
comparten la direccionalidad. Sin embargo, para otros genes, el efecto se limita a isoformas
específicas, lo que indica claramente un efecto en la elección del sitio de empalme. Otra
advertencia a nuestro trabajo es que hemos evaluado los cambios de expresión solo a nivel de
ARNm. Esto se debe a la dificultad inherente en el cultivo de cantidades suficientes de
células senescentes para permitir el análisis de proteínas a gran escala.

En la actualidad, los mecanismos específicos por los cuales los resverálogos pueden influir en
la expresión del factor de empalme y los fenotipos de senescencia en nuestro trabajo no están
claros. Se ha demostrado previamente que el resveratrol tiene efectos beneficiosos sobre los
fenotipos de senescencia a través de otras vías como la actividad de SIRT1 [ 24 ] y también a
través de los efectos sobre el fenotipo secretor asociado a la senescencia (SASP)
[ 23 ]. Nuestros datos sugieren que los resveralogos pueden influir en la expresión del factor
de corte y división celular en cultivos senescentes independientemente de la actividad de
SIRT1, ya que un compuesto, la molécula 3 no tiene actividad de SIRT1 discernible (Fig. 1),
a pesar de una inducción de SIRT1a nivel de ARNm. La acción del resveratrol en SIRT1 está
en el nivel de activación de la enzima. En el caso del compuesto 3, aunque parece haber un
efecto sobre la transcripción, este compuesto no puede activar la proteína traducida. Nuestros
datos también son consistentes con estudios anteriores en células knockout de ARNip SIRT1
que demostraron que el efecto del resveratrol en la expresión del factor de empalme ocurre
independientemente de la actividad de SIRT1 [ 22]. De manera similar, aunque los
resveralogos 1 - 6 muestran efectos muy similares en la expresión del factor de empalme, la
capacidad de suprimir el SASP varía ampliamente (como se muestra en la Fig. 2 ). De hecho,
el tratamiento con compuesto 2Eleva significativamente los niveles de IL-8, una de las
citoquinas canónicas que causa la senescencia paracrina (junto con la IL-6). El único cambio
consistente en los niveles de citoquinas que detectamos es una reducción en la IL-10, que no
inhibe el crecimiento.

Se ha informado que el resveratrol modula la vía ERK [ 35 , 36 ]. La señalización ERK se ha

sugerido previamente como un regulador potencial de la expresión del factor de empalme
[ 37 ]. De hecho, ETS1, un objetivo descendente de la señalización ERK, ha sido reportado
previamente para regular la expresión de TRA2B [ 37 ]. También se ha demostrado que la
inhibición de ERK suprime la senescencia celular [ 42 ] e influye en la vida útil en modelos
animales [ 43].]. Nuestros datos son consistentes con estas observaciones, ya que las
alteraciones en la señalización de ERK con antagonistas de ERK también se asociaron con la
alteración de la expresión del factor de empalme y fenotipos de senescencia. Los agonistas de
ERK también pudieron mejorar los efectos del resveratrol en ambos fenotipos. En la
actualidad, sin embargo, no podemos afirmar definitivamente que este es el modo principal
de inducción de estos efectos, dado el contexto y la dependencia del tipo de célula de la
 señalización ERK, y la existencia de interferencia con otras vías. La interpretación de los
datos también se hace más complicada por la observación de que incluso una población de
células senescentes derivadas de un solo cultivo 'joven' es en realidad bastante heterogénea,
que consiste en células senescentes, senescentes y senescentes. Dentro de un cultivo de
células senescentes, También hay varias rutas por las cuales esas células pueden haberse
vuelto senescentes. Estos incluyen senescencia replicativa, senescencia mitocondrial,
senescencia inducida por oncogenes, senescencia paracrina y senescencia autocrina. En la
actualidad, no está claro si todas las subpoblaciones responden de manera equivalente al
tratamiento con resveros, o si las células que se han vuelto senescentes a través de diferentes
rutas responden de manera equivalente a los resverálogos.

Ya existe un interés considerable en el desarrollo de fármacos que pueden atenuar la

senescencia para el uso humano final. Se han logrado éxitos notables al superar la apoptosis
en la senescencia con los inhibidores de Bcl-2 [ 44 ], y al modificar la señalización de
mTORC con rapamicina y otros rapalogos o miméticos de ATP específicos para el sitio
activo de la quinasa mTOR [ 31]]. SIRT1 también es un objetivo actual para el diseño de
fármacos y para intervenciones nutracéuticas y se sabe que también se activa con
resveratrol. Sugerimos que centrarse solo en la actividad de SIRT1 puede ser engañoso y que
otras vías activadas por resveralogues pueden ser más importantes para aliviar la senescencia
y mejorar los resultados de salud en la vida posterior. La renovación de la proliferación que
observamos en el tratamiento de resveralogía obviamente plantea dudas sobre el riesgo
potencial de cáncer asociado a dicho tratamiento, en caso de que se emplee en un entorno
clínico. Proponemos que la renovada proliferación se debe a un aumento transitorio en la
actividad de la telomerasa provocada por la inducción de proteínas específicas del factor de
empalme, y que el crecimiento aún está regulado.45 , 46 ].

Conclusiones
Durante el proceso de envejecimiento, tanto las células senescentes como las no senescentes
pierden un grado de respuesta a los factores estresantes celulares. Las causas anteriores de
esto aún no están claras, pero pueden incluir cambios en los genes que controlan el empalme
alternativo; Un importante regulador de la expresión génica que asegura la plasticidad
genómica. Aquí, proporcionamos evidencia de que el tratamiento con análogos novedosos del
compuesto de estilbeno, el resveratrol, está asociado no solo con la restauración de la
expresión del factor de unión, sino también con la mejora de los fenotipos de senescencia
celular múltiple en fibroblastos primarios humanos senescentes. En la actualidad, los
mecanismos precisos detrás de estas observaciones no están claros, pero pueden implicar la
restauración de un patrón más "juvenil" de empalme alternativo, y también los efectos de
factores de empalme específicos en el mantenimiento de los telómeros. Proponemos por lo
tanto que los factores de empalme,

Los metodos
Síntesis de nuevos resveralogos.
El resveratrol (Sigma Aldrich, Reino Unido; 1 ) se utilizó para sintetizar el
dihidroresveratrol 2 como se informó anteriormente [ 47 ]. Se sintetizó ( E ) -N- (4- (3,5-
dimetoxiestiril) fenil) metanosulfonamida 3 a partir del análogo nitro-
sustituido 7 previamente informado mediante una reducción de Fe / NH 4 Cl para dar la
amina 8 [ 26 ], seguida de sulfonilación. con cloruro de metanosulfonilo (Fig. 1b ). La
correspondiente amida 9 también se preparó a partir de 8 , por acilación con cloruro de
acetilo. El producto 9 se sometió a desmetilación (BBr 3)., CH 2 Cl 2 ) para dar el compuesto
objetivo ( E ) -N- (4- (3,5-dihidroxiestiril) fenil) acetamida 4 . ( E ) -5- (4- (3,5-
dimetoxiestiril) fenil) -1 H -tetrazol 5 y el isomérica 2-1 H análogo tetrazol 6 se prepararon
directamente a través de cicloadición catalizada por ácido con ion azida de la 4- y 2-
cianostilbenes [ 26 ] ( 10 y 11 respectivamente). (Fig. 1b ) Los detalles de la síntesis,
purificación y caracterización de los resveralogues se encuentran en el archivo adicional 8 .

Determinación de la activación de la enzima SIRT1

La actividad de la enzima SIRT1 se midió utilizando el kit de descubrimiento de fármacos
fluorométricos SIRT1 (Cayman Chemicals, Michigan, EE. UU.) De acuerdo con las
instrucciones del fabricante. Este ensayo es un ensayo estándar de detección de fluorescencia
directa para SIRT1 ex-vivo y es esencialmente una variante del conocido sistema "fluor de
lys". Para la determinación de la capacidad relativa de cada resveralogue para activar la
enzima, se preincubaron 25 μM de solución de cada compuesto ( n = 3) con la enzima y los
cofactores antes de medir la actividad. La cuantificación se logró al medir la salida a λ ex =
360 nm y λ em = 460 nm. Cada placa incluía medidas de fondo y controles de enzimas
solamente. Los datos se presentan como el cambio en la cantidad (media ± SD) en la
actividad normalizada a enzima sola y resveratrol 1 , de modo que 0 representa sin
activación, y 1.0 indica activación equivalente a la observada con resveratrol 1 .

Determinación de la citotoxicidad de la biblioteca del resveralogo.

Se utilizó un ensayo de liberación de LDH comercial (kit de ensayo de citotoxicidad Pierce
LDH) para determinar la muerte celular. Brevemente, las células MRC5 (en la duplicación de
la población (PD) = 45) se sembraron en placas de 24 pocillos a 1,3 × 10 5 células / cm 2y se
dejó recuperar de la tripsinización durante 24 h, luego se expuso a cada uno de los
resveralogos (3 réplicas biológicas x 3 concentraciones; 10, 50 y 100 μM) durante otras 24
h. Luego se mezclaron 50 μl de medio de cada pocillo con un volumen igual de la mezcla de
reacción del ensayo LDH y se incubaron a temperatura ambiente en la oscuridad durante 30
min. Se añadieron 50 µl de solución de parada de ensayo LDH a cada pocillo y se midió la
absorbancia de la solución mediante espectrofotometría a 490 nm. Se incluyeron lisis
completa y solo vehículo con controles positivos y negativos. Los datos se presentan como
media (+/− desviación estándar)% del control total de lisis.

Cultivo de fibroblastos primarios humanos (NHDF, MRC-5 y HF043)

En este estudio se utilizaron cepas de células de fibroblastos de tres orígenes genéticos y dos
linajes: fibroblastos dérmicos humanos normales (NHDF; Heidelburg, Alemania),
fibroblastos fetales de pulmón fetales humanos (MRC-5; Instituto Coriell para la
Investigación Médica) y fibroblastos de prepucio neonatal (HF043 ; Dundee Cell Products,
Reino Unido). Las condiciones de cultivo estándar fueron una densidad de siembra de 6 ×
10 4células / cm 2 en medio (C-23020, Promocell, Heidelburg, Alemania) que contenía 1% de
penicilina y estreptomicina, y una mezcla de suplemento específica para fibroblastos que
consiste en suero de ternera fetal (3 % v/ v), factor de crecimiento de fibroblastos
recombinantes (1 ng / ml) e insulina humana recombinante (5 μg / ml) (Promocell,
Heidelburg, Alemania). Para los ensayos que requerían cultivos senescentes, se contaron las
células y se sembraron números iguales de células en cada pase hasta que el crecimiento del
cultivo se redujo a menos de 0.5 PD / semana como se describió previamente [ 2 ] (esto
ocurrió en PD = 64 (NHDF), 65 (MRC-5) y 64 (HF043). Los números de células viables se
determinaron en cada pase mediante tinción con azul de tripano. Para los cultivos cultivados
en condiciones de privación de suero, las células se mantuvieron en DMEM (Sigma Aldrich,
Dorset, Reino Unido) suplementado con 0,1%. de suero y 1% de penicilina y estreptomicina
en ausencia de un suplemento específico de fibroblastos, durante 24 h antes del tratamiento.

Cuantificación de la secreción de citoquinas clave.

Se sembraron células NHDF de un cultivo senescente a 6 x 10 4 células / cm 2en una placa de
6 pocillos en medio sin suero, y después de 10 días se trataron con 5 μM de cada uno
de 1 a 6 durante 24 h. Los sobrenadantes celulares se recogieron y almacenaron a -80 ° C. Se
determinaron los niveles de 9 citoquinas (GMCSF, IFNγ, IL1β, IL2, IL6, IL8, IL10, IL-
12p70 y TNFα) en sobrenadantes celulares de células de control tratadas y solo de vehículo
utilizando el inmunoensayo de ELISA multiplexado de MesoScale Discolex K15007B
(MSD, Rockville, USA) en 11 réplicas. Las proteínas se cuantificaron en relación con una
curva estándar utilizando un Sector Imager SI-6000 de acuerdo con las instrucciones del
fabricante. Los datos se presentan como media (+/− SEM).

Perfil de expresión de la expresión del factor de empalme en cultivos de células senescentes

Las células NHDF se sembraron a 6 x 10 4 células / cm 2 en placas de 6 pocillos, se dejaron
crecer durante 10 días y luego se trataron con 5 μM de cada compuesto durante 24 h en 3
repeticiones biológicas, con controles de solo vehículo (DMSO). El tratamiento agudo
de resveratrol 1 se realizó a una dosis inicial de 5 µM, seguido de un cultivo sin tratamiento
adicional durante 4 semanas. Para los regímenes de tratamiento crónico, se añadió resveratrol
(o vehículo DMSO) una vez cada 48 h durante 4 semanas. 20 transcripciones de factores de
empalme que se asociaron con la edad y la senescencia replicativa en nuestro trabajo anterior
[ 1 , 2] fueron seleccionados a priori para su evaluación aquí. (Los identificadores de ensayo
están disponibles a petición). El ARN se extrajo utilizando 1 ml de TRI reagent ® (Life
Technologies, Foster City, EE. UU.) De acuerdo con las instrucciones del fabricante. El ARN
total (100 ng) se transcribió de manera inversa en reacciones de 20 µl utilizando el kit
Superscript III VILO (Life Technologies, Foster City, EE. UU.). La expresión de la
transcripción se cuantificó por triplicado para cada réplica biológica utilizando la matriz de
baja densidad TaqMan (TLDA) en la plataforma ABI-Prism 7900HT. Las condiciones del
ciclo fueron 1 ciclo cada una de 50 ° C durante 2 min, 94.5 ° C durante 10 min y luego 40
ciclos de 97 ° C durante 30 sy 57.9 ° C durante 1 min. Las mezclas de reacción incluyeron 50
μl de TaqMan Fast Universal Mastermix para PCR (Life Technologies, Foster City, EE.
UU.), 30 μl de dH2O y 20 μl de plantilla de cDNA. Se dispensaron 100 µl de mezcla de
reacción en la cámara de la tarjeta TLDA y se centrifugaron dos veces durante 1 minuto a
1000 rpm para asegurar la distribución correcta de la solución en cada pocillo. La expresión
de la transcripción se evaluó mediante el enfoque Ct comparativo, en relación con
elLos genes de control endógeno IDH3B , GUSBy PPIA , seleccionados sobre la base de la
evidencia empírica de la estabilidad con la edad en nuestros primeros datos de microarrays
[ 1 ] y con senescencia celular en nuestro trabajo anterior [ 2 ]. La expresión de la
transcripción se expresó en relación con el nivel de expresión del factor de empalme en las
células de control tratadas con vehículo.
Evaluación de la expresión génica total y el empalme alternativo para genes relacionados con
la senescencia
Para evaluar la expresión de genes y el empalme, las células NHDF se sembraron a 6 ×
10 4 células / cm 2 en placas de 6 pocillos y después de 10 días se trataron con 5 μM de cada
compuesto durante 24 h en 3 repeticiones biológicas. Las transcripciones de destino
incluyeron los conocidos genes relacionados con la edad CDKN2A, CDKN1A, TP53, MTOR,
CHK1 y CHK2. Las sondas específicas de isoformas particulares o grupos de isoformas se
diseñaron para regiones únicas de las transcripciones en cuestión. Los ensayos se validaron
mediante análisis de curva estándar de 7 diluciones seriales 1: 2 de cDNA agrupado y se
mostraron robustos y sensibles con una eficiencia promedio de −3.4 y un promedio de r 2Para
reproducibilidad entre réplicas de 0.87. Las reacciones de PCR contenían 2,5 μl de TaqMan
Universal Mastermix (sin AMPerasa) (Applied Biosystems, Foster City, EE. UU.), 0,9 μM de
cada cebador, sonda de 0,25 μM y 0,5 μl de cDNA transcrito a la inversa como anteriormente
en un volumen total de 5 μl en una placa de 384 pocillos . Las condiciones de la PCR fueron
un solo ciclo de 95 ° C durante 10 minutos, seguidos de 40 ciclos de 95 ° C durante 15
segundos y 60 ° C durante 1 minuto. También medimos la expresión total del ATR,
ATM.RB1, SIRT1 y SIRT2 genes. Los detalles de la sonda y la imprimación están disponibles
a pedido. Cada réplica biológica se probó por triplicado. Se examinaron los cambios de
expresión totales y específicos de isoformas para determinar su significación estadística
mediante un análisis ANOVA de dos vías utilizando SPSS v.22 (IBM, EE. UU.).

Determinación histoquímica catalítica de la fracción positiva de SA β-gal

El marcador de senescencia SA β-Gal se analizó por triplicado utilizando un kit comercial
(Sigma Aldrich, Reino Unido); de acuerdo con las instrucciones del fabricante, con un
mínimo de 400 celdas evaluadas por réplica.

Medición qRTPCR de transcripciones de genes asociados a la senescencia

Los marcadores moleculares de senescencia ( niveles de transcripción
de CDKN2A y CD248 ) se midieron mediante qRTPCR en relación con los genes de control
endógeno GUSB y PPIA , en la plataforma ABI Prism 7900HT. Las condiciones de la PCR y
el análisis fueron como se describió anteriormente [ 2 ].

Microscopía de captura de células vivas

Para la microscopía de captura en vivo, las células se sembraron a una densidad de 5 ×
10 4 células por placa de fondo de vidrio de 35 mm (World Precision Instruments, EE. UU.)
En 2 ml de medio. A continuación, se captación de imagen sobre una Leica Axiovert
microscopio invertido ambiental con cámara calentada (37 ° C) y CO 2 capacidades. Se tomó
una imagen cada 10 minutos en el transcurso de 92 h. Se utilizó un objetivo de 20 × con una
velocidad de obturación de 30 mS y una intensidad de luz del 10% de una fuente de luz
blanca de campo amplio para cada imagen, lo que proporciona un contraste óptimo y una
exposición a la luz mínima. Las imágenes fueron analizadas utilizando el software Leica LAS
X.
Determinación de la proliferación celular.
Los cultivos senescentes de cada cepa se sembraron a 6 x 10 4 células / cm 2en placas de 6
pocillos y se cultivaron durante 10 días y luego se trataron con 5 μM de cada compuesto
durante 24 h. Los recuentos de células en tres réplicas de cultivos tratados y solo de vehículo
se realizaron manualmente después de la tripsinización y la suspensión de células y se
presentan como media (+/− SEM).

Determinación inmunocitoquímica de la fracción positiva para Ki67.

El índice de proliferación se evaluó utilizando la tinción con Ki67 en células NHDF. Las
células se sembraron a 1 × 10 4Las células / cubreobjetos y después de 10 días se trataron con
5 µM de cada compuesto durante 24 h en 3 réplicas biológicas. Las células se fijaron durante
10 min con PFA al 4% y se permeabilizaron con Triton al 0.025% y suero al 10% en PBS
durante 1 h. Las células se incubaron luego con un anticuerpo monoclonal de conejo anti-
Ki67 (ab16667, Abcam, Reino Unido) a 1: 200 durante la noche a 4 ° C seguido de un anti-
conejo de cabra secundario conjugado con FITC (1: 400) durante 1 h, y los núcleos fueron
contratinizado con DAPI. Los cubreobjetos se montaron en portaobjetos en medio de montaje
de fluorescencia DAKO (S3023; Dako). El índice de proliferación se determinó contando el
porcentaje de células Ki67 positivas de al menos 400 núcleos de cada réplica biológica a 400
aumentos con un microscopio de fluorescencia Leica D4000.

Evaluación de la apoptosis mediante el ensayo TUNEL.

Los puntos de interrupción terminales del ADN in situ en el marcador de extremo 3 - hidroxi
(TUNEL) fueron para cuantificar los niveles de apoptosis en células NHDF. Las células se
sembraron a 1 x 10 4 células / cm 2 en placas de 6 pocillos y después de 10 días se trataron con
5 μM de cada compuesto durante 24 h en 3 réplicas biológicas. El ensayo TUNEL se realizó
con el kit de análisis de imágenes Alexa Fluor® 488 de Click-iT® TUNEL (Thermofisher,
Reino Unido) siguiendo las instrucciones del fabricante. También se realizaron controles
negativos y positivos (DNasa1). El índice apoptótico se determinó contando el porcentaje de
células positivas de al menos 400 núcleos de cada réplica biológica a 400 aumentos.

Evaluación de la apoptosis mediante la evaluación de la actividad de la caspasa 3 y 7

Las actividades de la caspasa 3 y 7 se evaluaron como medidas secundarias de apoptosis. Las
células se sembraron (1000 células por pocillo) en una placa de 96 pocillos de pared blanca y
luego se trataron con 5 µM de cada compuesto durante 24 h en 11 réplicas biológicas junto
con los controles de solo vehículo. Las actividades de la caspasa-3 y -7 en los sobrenadantes
se midieron luego mediante el ensayo Caspasa-Glo 3/7 (Promega, Madison, WI, EE. UU.)
Siguiendo las instrucciones del fabricante. La luminiscencia se midió utilizando un BMG
Pherastar FSX.

Moderación de la vía de señalización ERK con inhibidores y agonistas.

El papel de la señalización de ERK en la reversión de la senescencia se investigó utilizando
agonistas (ceramida) e inhibidores (trametinib) de la vía ERK. Las células de un cultivo
senescente se sembraron a 6 × 10 4 células / cm 2 en una placa de 6 pocillos en medio sin
suero, y después de 10 días se trataron con 1-20 μM del inhibidor de ERK trametinib
(laboratorios LC, Woburn, EE. UU. Para 24 h horas, o con el agonista de ERK N-acetil-D-
esfingosina (C2-ceramida; Sigma Aldrich, Reino Unido) a 20 μM durante 24 o 120 h. Para
 examinar el papel de la señalización de ERK en el rescate de senescencia inducido por
resveralogue, Las células HNDF se trataron con 20 µM de la C2-ceramida del agonista de
ERK como se mencionó anteriormente, pero con la adición de un resveralogo de 5 µM
durante 24 h.

Evaluación de la longitud del telómero en células tratadas con resveratrol

El ADN se extrajo de 2 × 10 5 células NHDF tratadas con un resverálogo de 5 µM durante 24
h, utilizando el Mini Kit de ADN Genómico PureLink® (Invitrogen ™ / Thermo Fisher, MA,
EE. UU.) De acuerdo con las instrucciones del fabricante. La calidad y la concentración del
ADN se verificaron mediante espectrofotometría Nanodrop (NanoDrop / Thermo Fisher,
MA, EE. UU.). La longitud relativa de los telómeros se evaluó mediante un protocolo de
qPCR modificado [ 48 ]. Las reacciones de PCR contenían 1 μl de EvaGreen (Solis Biodyne,
Tartu, Estonia), 2 μM de cada cebador y 25 ng de ADN en un volumen total de 5 μl en una
placa de 384 pocillos. Las condiciones de la PCR fueron un solo ciclo de 95 ° C durante 15
min seguido de 45 ciclos de 95 ° C durante 10 s, 60 ° C durante 30 sy 72 ° C durante 1
min. La longitud del telómero se calculó utilizando el enfoque Ct comparativo en relación
con el 36B4Gen de mantenimiento y normalizado a la cuantificación a partir de células no
tratadas. Se probaron tres réplicas biológicas y cada una se evaluó por triplicado.

análisis estadístico
A menos que se indique lo contrario, las diferencias entre los cultivos de control tratados y
solo en el vehículo se evaluaron para determinar su significación estadística mediante el
análisis ANOVA bidireccional utilizando SPSS v.22 (IBM, EE. UU.).

Notas
Eva Latorre y Vishal C. Birar son co-primeros autores.

Richard GA Faragher, Elizabeth L. Ostler y Lorna W. Harries son autores principales.

Abreviaturas
DHRSV:
Dihidroresveratrol

ESE:
Potenciador de empalme de exones
ESS:
Silenciador de empalme de exones
HF043:
Fibroblasto de prepucio neonatal
hnRNP
ribonucleoproteína heterogénea
ISE:
Intensificador de empalme Intron

ISS:
 Intron empalme silenciador
LDH:
Lactato deshidrogenasa

MRC5:
Pulmón fetal diploide humano
NHDF:
Fibroblasto dérmico humano normal

RSV:
Resveratrol
SA β-gal:
Β-galactosidasa asociada a la senescencia
SASP:
Senescencia asociada al fenotipo secretor.

SR:
Serina clase arginina
TLDA:
Matriz de baja densidad TaqMan
Declaraciones
Expresiones de gratitud
Los autores desean agradecer a Nicola Jeffery y Ben Lee por la asistencia técnica, ya
Luke Pilling por su ayuda en la preparación de los mapas de calor.

Fondos
Este trabajo fue apoyado por The Dunhill Medical Trust [número de concesión: R386
/ 1114] a Lorna Harries, una beca para Vishal Birar de la Universidad de Brighton y la
Fundación Glenn para la investigación médica Premios personales a Richard Faragher
y Lynne Cox. El trabajo en el laboratorio de Lynne Cox también está respaldado por
la subvención BBSRC [BB / M006727 / 1].
Disponibilidad de datos y materiales.
Todos los datos generados o analizados durante este estudio se incluyen en este
artículo publicado y sus archivos de información adicional.
Contribuciones de los autores
EL llevó a cabo la mayoría de los experimentos y revisó el manuscrito. VB llevó a
cabo la síntesis de los nuevos compuestos. Como contribuyó a la síntesis química de
los compuestos. JCCJ llevó a cabo los experimentos de microscopía de células
vivas. AH proporcionó ayuda técnica para los experimentos de inhibidores y agonistas
de ERK. HRD supervisó e interpretó los ensayos de apoptosis. DM revisó el
manuscrito. LSC suministró fibroblastos senescentes e interpretó los datos. RGAF
interpretó los datos, contribuyó a la dirección del proyecto y revisó el manuscrito; EO
manejó los aspectos químicos del estudio, interpretó los datos y revisó el
manuscrito. LWH gestionó los aspectos moleculares del estudio, interpretó los datos y
escribió el manuscrito. Todos los autores leyeron y aprobaron el manuscrito final.

Aprobación ética y consentimiento para participar.

No aplica.
Consentimiento para publicación
No aplica.
Conflicto de intereses
Los autores declaran que no tienen intereses en competencia.
Nota del editor
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mapas publicados y afiliaciones institucionales.
Acceso abiertoEste artículo se distribuye bajo los términos de la licencia
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