“Año de la lucha contra la corrupción y la impunidad”

UNIVERSIDAD
NORBERT WIENER

BROMATOLOGIA

PREPARACIÓN DE INOCULUM Y CRECIMIENTO CELULAR

PRÁCTICA N° 4
Profesora:
 Mg. Erika Paola Espinoza Rado

Integrantes:
 Carreño Gómez Giovanna
 Domínguez Yucra Patricia
 Huatay Rojas Ingrid
 Millán Porta María
 Sulca Ccancce Vanessa
 Vargas Boza Aníbal

2019
 I. INTRODUCCIÓN

El punto de partida de cualquier fermentación es un recipiente limpio que ha sido

esterilizado y rellenado con el medio de cultivo estéril. Posteriormente, el
fermentador se inocula con el microorganismo adecuado. El tamaño del inóculo
generalmente es del orden del 1-10%del volumen total del medio. Si es inferior a
esta proporción puede existir un excesivamente prolongado período de latencia, lo
que prolongará el período de fermentación. La preservación de las cepas de
producción a lo largo de un período de tiempo largo es un requisito básico para una
fermentación práctica. Los microorganismos pueden ser mantenidos viables
fácilmente a través de un período de transferencia, pero lo que debe ser preservado
es su capacidad de formar el producto de interés. Las cepas super productoras
están frecuentemente dañadas en su metabolismo primario durante el proceso de
selección decepas y tales cepas frecuentemente degeneran durante las sucesivas
transferencias, probablemente como resultado de mutaciones espontáneas
(revertientes). (1)

Los microorganismos utilizados en procesos industriales se han obtenido

generalmente aislándolos del medio ambiente mediante diferentes técnicas. Para la
preparación del inoculum se hace a partir de células puras liofilizadas y
perfectamente selladas y este debe prepararse en dos o más etapas con el
propósito de aumentar la biomasa microbiana. La transferencia de frasco a frasco
debe ser realizada en condiciones totalmente asépticas con el fin de evitar su
contaminación. (2)
 II. Marco teórico
Las bacterias son los organismos más pequeños que tienen la maquinaria requerida
para el crecimiento y la replicación. Están compuestas, como las células eucariotas,
por proteínas, polisacáridos, lípidos, ácidos nucleicos, entre otros. Estas
macromoléculas pueden formar parte de estructuras celulares más complejas,
como la pared celular y la membrana plasmática. El crecimiento bacteriano se define
como el aumento ordenado de todos los constituyentes químicos de la célula. Es un
proceso complejo que supone la replicación de todas las estructuras y componentes
celulares a partir de nutrientes exógenos. (3)

2.1 FACTORES QUE INTERVIENEN EN EL CRECIMIENTO MICROBIANO

Los microorganismos, al igual que el resto de los seres vivos, necesitan nutrientes
y otros factores específicos para cumplir con su ciclo de vida; cada organismo es
distinto, por lo que los elementos para su desarrollo también dependerán de esas
variables. Son de dos tipos: intrínsecos (las características fisicoquímicas de los
alimentos) y extrínsecos (las condiciones de almacenamiento, transporte y
manipulación). Un tercer factor corresponde a las características propias de los
microorganismos; sin embargo, todos estos elementos terminar por delimitar el
medio más favorable para el crecimiento de hongos, bacterias y la presencia de
virus. (4)

Tabla 1:
CLASIFICACIÓN DE LOS MEDIOS DE CULTIVO – SEGÚN SU ESTADO FISICO

MEDIOS LIQUIDOS MEDIOS SÓLIDOS MEDIOS SEMI SÓLIDOS

Utilizados para favorecer el Utilizados para obtener Utilizados para estudiar la
desarrollo bacteriano, no se bacterias aisladas por la motilidad de las bacterias,
puede sustituir por medios formación de colonias no se solidifican a la
sólidos, ejemplo agua sobre la superficie del temperatura ambiente
peptonada, medio de cultivo
Fuente: Elaboración propia
Tabla 2:
CRECIMIENTO DE LAS POBLACIONES BACTERIANAS

FASE FASE
FASE LAG FASE DE MUERTE
EXPONENCIAL ESTACIONARIA
Periodo de latencia Periodo de No se presentan Fase donde el
o adaptación, no crecimiento siendo cambios equilibrio
hay aumento de una manera significativos de la desaparece
significativo de la sincronizada y densidad celular con predominando
densidad celular llega a su máxima respecto al tiempo microorganismos
velocidad muertos
Fuente: Elaboración propia

2.2 CRECIMIENTO DE LAS POBLACIONES BACTERIANA

El paso esencial para iniciar el estudio de una cepa bacteriana es el cultivo. Este
paso es importante para proveer de una población de bacterias que puedan ser
analizadas mediante pruebas bioquímicas, serológicas, genéticas y de
susceptibilidad a los antibióticos. El cultivo es el proceso de propagación de los
microorganismos en el laboratorio, que se obtiene aportando las condiciones
ambientales adecuadas y los nutrientes necesarios para el crecimiento bacteriano.
Debemos recordar que algunas de las bacterias que causan infecciones en seres
humanos no son capaces de crecer en medios artificiales inertes. (5)
III. MATERIALES Y MÉTODOS
3.1 Materia prima

 Levadura (Saccharomyces
cerevisiae liofilizado)

3.2 Insumos y materiales

 Vaso de precipitados x 1 L.
 Vaso precipitado de 100 ml.
 Gradilla
 Erlenmeyer 50, 250 y 500ml
 Micropipetas 5ml con tips.
 Picetas
 Probetas de 50mL.
 Tubos de ensayo de 15 mL.
 Tubos falcón de 15 mL.
 Agua destilada
 Glucosa
 Extracto de levadura
 Peptona
 Hidróxido de sodio

3.3 Equipos e instrumentos

 Agitador magnético
 Balanza
 Centrífuga
 Refrigeradora
 Cocina eléctrica
 Espectrofotómetro
 IV. Procedimiento

PREPARACIÓN DEL INOCULUM Y CRECIMIENTO CELULAR

Verter en el matraz 1000ml de medio de cultivo, que

Pesar 10.15 gr. de levadura, adicionar 10ml de agua
l contiene nitrógeno y minerales agregar los magnetos.
destilada. Debe tener una temperatura de 125 °C

Tapar el matraz con el medio de cultivo parafilm y Se hará la toma de la muestra y se colocará en el
tomar la temperatura. agitador.

Se tomará la muestra a necesitar para obtener la Obtenemos la primera muestra cero = 0.097y
muestra 0.

Se hará un monitoreo de la muestra en los respectivos minutos.

 V. Resultados

Se observó en el monitoreo de lecturas del espectrofotómetro en el tiempo 0 min de 0.097 nm, a los 30 min de
0.110 nm, a los 120 min de 0.130 nm, y a los 180 min se observó 148 nm.

Para observar el incremento de la biomasa de la bacteria, se calcularon en base del tiempo con la lectura del
espectrofotómetro de la siguiente manera.

X= Y + 0.0373 X 10 X= Biomasa (g/L)

2.1404
Y= D.O

T min DO BIOMASA (G/l)

Resolviendo:
0 0.097 0.62
30 0.110 0.68
a) X= 0.097 + 0.0373 X 10
120 0.130 0.78
2.1404
180 0.148 0.86
en el espectro)
X=0.62 g/l

b) X= 0.110 + 0.0373 X 10
2.1404

X=0.68 g/l

c) X= 0.130 + 0.0373 X 10
2.1404

X=0.78g/l

d) X= 0.148 + 0.0373 X 10
2.1404

X=0.86 g/l

Tabla 3: Crecimiento de las bacterias

 Densidad BIOMASA
T min Óptima (G/l)
0 0.097 0.62
30 0.110 0.68
120 0.130 0.78
180 0.148 0.86
Fuente: Elaboración propia

Las bacterias tuvieron creciendo en medio acuoso, gracias al medio húmedo, su alimentación proteica (peptona
de carne) y glucosa como parte de energía. En el siguiente grafico se observa cómo se iban desarrollando cada
cierto tiempo, el tiempo 0 sucede que las bacterias se hallan en etapa de adaptación, posterior a ello la fase
exponencial (reproducción).

Gráfico 1: Crecimiento bacteriano en base del tiempo

Crecimiento bacteriano
1
0.9
0.8
0.7
crecimiento

0.6
0.5
0.4
0.3
0.2
0.1
0
0 50 100 150 200
tiempo

Fuente: Elaboración propia

Entonces podemos determinar que la levadura (bacteria), tubo reacción inicial con crecimiento bajo,
posteriormente al adaptarse estos se iban duplicando. Tenemos que mencionar que los resultados no son los
adecuados debido que la line a de crecimiento es muy lento. Lo que significa que pudo influenciar la temperatura,
cantidad de proteína.

VI. Discusión:
La muestra de levadura reposo y se hizo la lectura a diferentes tiempos en los cuales se esperaba su desarrollo
(crecimiento) por lo que era de importancia que las condiciones o factores internos y externos debían estar en
equilibrio para que ello sede y se pueda observar mediante la lectura espectrofotométricas. La implicancia de
obtener una curva de crecimiento celular radica en el cumplimiento de dichos factores, de los valores obtenidos
en la práctica se apreció que las lecturas era muy cercanas (0.097, 0.110, 0.130, 0.148) por lo que uno o varios
de los factores fallaron.

La levadura necesita para su desarrollo necesita una fuente de energía para activarse, el tiempo para reaccionar,
el pH adecuado y oxigenación En la práctica se utilizó como medio el sulfato de amonio el cual mediante un
proceso de fermentación alcohólica en conjunto con el oxígeno del ambiente le permite a la levadura multiplicarse
y entrar a una fase de crecimiento exponencial. Si comparamos nuestro proceso con otro estudio realizado por
Rodríguez en donde se vio la viabilidad celular del crecimiento de la levadura que usó un medio de cultivo YPD
que es específico para el crecimiento de la levadura y tomo en consideración factores como la temperatura a
30ºC, un pH ligeramente ácido y un tiempo de 72 horas (6).

Son estos últimos factores los que varían con respecto a los que se realizó en la práctica. Primero; no hubo un
control del pH del medio, el medio de sulfato de amonio necesita de un determinado pH para no generar lecturas
erróneas en adelante además que el tiempo de reposo y los intervalos de tiempo para que se dé la reacción
fluctuó entre los 30’ a los 180’ (3 horas), si se compara con el estudio antes mencionado en donde se dio un
tiempo de 72 horas y se tomó en cuenta el pH del medio para que se de todo el proceso se asume que no se le
brindo las condiciones para que alcance su desarrollo.

Otro punto a tener en cuenta es la aireación de la levadura y su relación con la asimilación del nitrógeno presente
en el medio de cultivo por la levadura, la disponibilidad de oxígeno el cual afectara la formación de la biomasa de
penderá de la cantidad de nitrógeno asimilable. Este nitrógeno asimilable es clave para el desarrollo de la
levadura, Granés menciona en su estudio que el nitrógeno producirá una multiplicación celular eficaz durante las
primeras horas (crecimiento exponencial) y que luego de consumirlo entrara en una etapa de declive (7).

Un factor a tener en cuenta es el factor humano, al momento de realizar la medición el cargado de la muestra en
las cubetas del espectrofotómetro pudo no ser la cantidad adecuada o las cubetas no estaban en las condiciones
adecuadas por lo que siguiendo el fundamento de la espectrometría en donde la intensidad de luz absorbida
después de pasar la muestra determinara la concentración de mi muestra (levadura) no se podría realizar una
adecuada cuantificación del crecimiento de la levadura (8).

Por lo tanto el que se haya obtenido una línea de crecimiento horizontal y no una curva en donde se pueda
apreciar las etapas de desarrollo de la levadura es debido además del factor humano a los factores externos
como la temperatura de incubación, el tiempo, equipo; factores internos como el nitrógeno asimilable.

VII. Bibliografía
1. Mateos Pedro. Preparación y propagacion de inoculos.[internet].[citado 24 Abril 2019].Recuperado en:
https://www.researchgate.net/publication/261983355_PREPARACION_Y_PROPAGACION_DE_INOCUL
OS

2. Ajardo E. et al.Evaluación de melaza como sustrato para la producción de Saccharomyces C. Universidad

Javeriana Bogotá.2007

3. In Food Quality Education and Culture.Microorganismos y Alimentos. [internet]. 2017[Citado 24 Abril 2019].
Disponible en:http://www.epralima.com/infoodquality/materiais_espanhol/Manuais/3.Microorganismos
_y_alimentos.pdf

4. Brock, T. et al. Biología de los Microorganismos. Editorial Reverte, España;2009

5. Benintende, S.Microbiología Crecimiento Bacteria.[internet].2015[ (Citado 24 Abril 2019). Disponible en:

http://www.fca.uner.edu.ar/files/academica/deptos/catedras/microbiologia/unidad_3_crecimiento_bacteria
no

6. Rodríguez Besta C, Cjuno Huancab JA ,Ceroni Gallosoa M. Influencia de la concentración de se(IV) en la

viabilidad celular durante el crecimiento de la levadura Saccharomyces cerevisiae. Rev Soc Quim Perú
[Internet]. 2018 [citado 20 Abril 2019]; 84(2): 228-238. Disponible en:
http://www.scielo.org.pe/pdf/rsqp/v84n2/a07v84n2.pdf
7. Granés D, Médina E, Blateyron L, Roméro C, Bru E, Roux C et al. Alimentación nitrogenada de la levadura.
Revista internet de viticultura y Enologia [Internet]. 2008 [citado 20 Abril 2019]; 3(2): 1-7. Disponible en:
https://www.infowine.com/intranet/libretti/libretto5593-02-1.pdf

8. Instituto Catalán de la Salud. Técnico especialista en laboratorio de atención primaria. [Internet]. España:
MAD; 2008. [citado 20 Abril 2019]. Disponible en:
https://books.google.com.pe/books?id=TP1IHGQEecUC&pg=PA347&dq=espectrofot%C3%B3metro+fun
damento&hl=es-
419&sa=X&ved=0ahUKEwibwuv6sOrhAhUrq1kKHR3UAtgQ6AEIKDAA#v=onepage&q&f=false