Metodología de laboratorio
2.1. Bioóptica
Según la clasificación de Jerlov todas las aguas de todos los mares y océanos de la
Tierra se pueden clasificar en dos tipos inicialmente, aguas costeras y aguas oceánicas,
donde el parámetro que las diferencia es el valor del coeficiente de atenuación vertical
de la luz (Kd). Así, las aguas costeras constituyen, a su vez, 9 tipos (costeras tipo 1 al 9)
y las aguas oceánicas cinco (I, IA, IB, II, III) siendo las aguas más transparentes las que
presentan valores más bajos y las más turbias los valores más altos. Para calcular el tipo
de agua se usan varias fórmulas atendiendo a la atenuación de la radiación a 400 nm.
El objetivo de este análisis es conocer qué capacidad de absorción de luz tiene una
muestra vegetal (fitoplancton o talo de macroalga) e investigar su aclimatación a
diferentes niveles de radiación. Además, el coeficiente de absorción específico de la
clorofila puede ser empleado para la estimación de la producción primaria por modelos
bio-ópticos. En el caso de muestras fitoplanctónicas se toman muestras de 1.5 L a
diferentes profundidades. Este agua se filtra por un equipo de filtración Millipore con
filtros Whatman GF/F de 0.22 m de tamaño de poro y de 25 mm de diámetro. El filtro
es entonces analizado con un espectrofotómetro determinando el espectro de absorción
in vivo del material particulado. Para esto, se pone el filtro en el camino del haz de luz y
se mide directamente junto con el blanco. El blanco se hace con un filtro impregnado en
agua de mar filtrada. Una vez medida cada muestra, se incuba cada filtro en 2.5 mL de
N, N dimetilformamida (DMF) en tubos de ensayo Pyrex en oscuridad y a 4 ºC durante
24 h. Una vez transcurrido este tiempo, se pasan de nuevo por el espectrofotómetro pero
usando, esta vez como blanco, un filtro impregnado en DMF. Con esto, se extraen todos
los pigmentos liposolubles con lo cual, en el filtro queda el detritus o toda aquella
porción del material particulado que no corresponde a pigmentos. La diferencia entre las
dos lecturas (in vivo (ODp( )) y el detritus (ODd( ))) será la densidad óptica de los
pigmentos fitoplanctónicos (ODph( )) recogidos en el filtro (Kishino et al., 1985):
donde X (en metros) es la relación entre el volumen del agua de mar filtrada y el área
filtrada sobre el filtro (volumen/área), 2.3 es un factor de conversión de logaritmo
decimal a logaritmo natural, y Cl a es la concentración de la clorofila a en unidades de
mg Cl a m-3.
Cl b = 20.70 * (A647 nm – A750 nm) - 4.62 * (A664.5nm – A750 nm) (unidades: mg L-1)
La instrumentación utilizada para medir la radiación tanto solar como artificial fue la
siguiente:
LI-1000
DataLogger
Sensor cuántico subacuático
Li 193 SB esférico
Li 192 Sensor
cuántico subacuático
Li 190 SA
Sensor cuántico
LI-COR
Radiómetro cuántico
Modelo LI-189
Fig. 2. Esquema del radiómetro LI-189 unido al sensor plano Li-190 SA.
Sensores Gröbel, radiómetros terrestres con sensores planos (2 ) que miden radiación
tanto en la banda del UVB (280-320 nm) como en la banda de la UVA (320-400 nm).
La irradiancia se expresa en unidades energéticas (W m-2). Debido a que los sensores no
emplean la banda de UVA y UVB definida por el sistema internacional de medida (CIE)
los valores de irradiancia eran corregidos con algoritmos obtenidos a partir de la
intercalibración con el radiómetro ELDONET (radiómetro descrito más adelante).
Sus unidades de medida son W m-2. Está conectado a un ordenador que registra todas
las medidas realizadas cada minuto y los datos se envían directamente al servidor
central de la Red Europea de medida de radiación de UV ELDONET en la que está
integrado (pagina Web: www.ib.pi.cnr.it/eldonet/).
Nuestro grupo de trabajo forma parte de la red europea de medida de radiación UV y
PAR, ELDONET, dentro de un proyecto financiado por la Unión Europea (CT96 UE
ENV4 0191). Además, estos instrumentos se están instalando en diversos puntos de
Andalucía constituyendo la red de medida de radiación solar UV y fotoprotección en
Andalucía (UVIFAN, financiado por los fondos FEDER (1FD 97-0824).
Igualmente, nuestro grupo de trabajo realiza aproximadamente cada mes
intercomparaciones de estos equipos, con lo que se dispone de factores de corrección
entre cada uno de ellos. Así, cualquier medida con uno de estos equipos puede ser
transformada a valores calculados con otro equipo.
La nomenclatura utilizada para las medidas de radiación es la que aparece publicada en
el libro " Underwater light and algal photobiology" (Björn et al. 1996). La radiación
fotosintéticamente activa es expresada en el sistema fotónico, es decir, en unidades
cuánticas (µmol fotones m-2 s-1) y la radiación ultravioleta en el sistema de energía, por
tanto, en unidades no cuánticas (W m-2). La dosis es expresada o bien en mol m-2 o bien
en kJ m-2.
E = hc / (1)
Para la radiación PAR el factor usado es 1 µmol fotones m-2 s-1 = 0.217 W m-2 o lo que
es lo mismo 1 W m-2 = 4.60 µmol fotones m-2 s-1. La longitud de onda usada es 550 nm
que es el valor medio de la banda de PAR.
- Daño de la radiación en el material genético (ADN), sobre todo en la banda del UVB.
Este espectro de acción se realizó sobre ADN de Escherichia coli (Setlow, 1974) (Fig.
6).
- Daño generalizado en plantas (sobre crecimiento y fotosíntesis) (Caldwell, 1971) (Fig.
6).
Fig. 6. Espectro de acción de daño en ADN (Setlow, 1974) y daño generalizado en
plantas (Caldwell, 1971).
80
60
40
20 295
320
395
0
300 400 500 600 700 800
Fig. . Porcentaje de transmisión de los filtros. El filtro 295 corta la radiación por encima
de 295 nm, dejando pasar una mínima parte de UVB, toda la UVA y toda la PAR
(tratamientos PAB), el filtro 320, corta por encima de 320 nm dejando pasar toda la
UVA y toda la PAR (tratamientos PA) y el filtro 395 deja pasar sólo aquella radiación
por encima de 395 nm, es decir, solamente radiación PAR (tratamientos P).
Además, en todos los experimentos donde se usaron lámparas con emisión en UVC
(Philips TL-12) se emplearon filtros 295 para cortar la radiación por debajo de esta
longitud de onda.
Los filtros se sumergen en el agua para evitar que gotas de agua puedan producir un
“efecto lupa” alterando de esta forma la homogeneidad del campo lumínico.
Superficie del agua
45 cm
Barras de acero
inoxidable
Fig. . Ilustración esquemática que muestra la disposición de los filtros utilizados para
los experimentos de campo (Tomada de Gómez et al., 1998)
a
b
Fig. . Espectro de emisión de las lámparas QP-340 (a) y QP-351 (b) usadas en los
experimentos bajo radiación artificial UV comparadas con el espectro solar.
b
1.2
Philips TL12
1
Unidades relativas
0.8
0.6
0.4
0.2 a
0
300 400 500 600 700 800
Fig. Espectro de emisión de las lámparas PhilipsTL12 (a) y Optimarc (b) utilizadas en
experimentos bajo radiación artificial comparadas con el espectro solar. Estas lámparas
se usan para conseguir altos valores de radiación UVB y PAR. respectivamente.
Los dosímetros estiman la dosis mínima eritemática (DME) provocada por la radiación
solar o cualquier otra fuente de luz. El eritema es una lesión leve en la piel
(enrojecimiento) que aparece tras una prolongada exposición solar. Los dosímetros
consisten en una película biológica que contiene esporas de una cepa silvestre y una
cepa mutante de la bacteria Bacillus subtilis inmovilizadas en láminas transparentes de
poliéster. Los mutantes son incapaces de reparar el daño en el material genético debido
a la radiación UV. Su análisis da idea de la DME (Fig. ). El espectro de acción utilizado
en los dosímetros viene representado en la figura. Es interesante para determinar el daño
potencial de la radiación incidente y capacidad de fotoprotección frente a la radiación
UV de diversas sustancias naturales que absorben UV
Después de la irradiación se envían a la empresa Biosense (Alemania) que realiza el
ensayo biológico. Las esporas son incubadas en un medio de cultivo, las proteínas
sintetizadas después de varias divisiones celulares son teñidas y determinadas por
fotometría dando una medida de actividad biológica. La dosis efectiva biológica se
calcula a partir de una curva de calibración. La respuesta es independiente de la
temperatura en el rango de –20 ºC a 70 ºC, se pueden conservar alrededor de un año a
humedad relativa < 70% sin influencia en la viabilidad de las esporas.
La curva de sensibilidad de la película de esporas presenta una alta similitud con el
espectro de acción de eritema inducido por UV en piel de humanos (Quintern et
al.,1992).
Radiación UV
Piel
Viospor ®
Sistema filtro
Capas más óptico
Membranas externas de la
Envoltura de
celulares piel
la espora
Proteínas Lípidos
Citosol Proteínas
ADN ADN
Respuesta
Eritema, ... Daño en ADN película
2.1.9.1. Introducción
c = a + b (m-1)
Estas propiedades inherentes son independientes del ángulo y pueden ser determinadas
a través de propiedades aparentes que sí son dependientes del ángulo de incidencia de
la luz. Una de estas propiedades aparentes de un medio acuoso es el coeficiente de
atenuación vertical (Kd) que viene definido por la expresión:
Kd = Ln Io - Ln Iz / z
Iz=Io e(-Kd*Z)
Kd = a + b / cos ,
siendo el llamado ángulo Zenith, estos es 90º-I (ángulo de la luz incidente respecto a
la una superficie normal).
La atenuación vertical (KT) total sería la suma de la atenuación vertical de la radiación
descendente (Kd) como se definió antes y de la atenuación vertical de la radiación
ascendente (Ku) es decir la luz que se refleja o dispersa hacia la superficie
KT = Kd + Ku
La radiación dominante es la descendente pero en ciertos tipos de aguas con una gran
concentración de partículas el componente ascendente adquiere una importancia
relativa mayor.
2.1.9.2.1. Fitoplancton
MÉTODOS:
Filtrar a través de un filtro GF/F (0.7 µm de tamaño de poro) una solución del alga
verde Dunaliella salina, tomar el filtro y colocarlo entre dos portaobjetos. A
continuación de coloca lo más cerca posible del detector de un espectrofotómetro
(Beckman DU-7) y se determina DO del filtro entre 400-750 nm (barrido espectral). Se
utiliza como blanco un filtro humedecido con el medio de cultivo sin algas.
2.1.9.2.2. Macroalgas
Se utilizará un alga roja Porphyra sp. (con Chl a y Biliproteínas) y un alga verde Ulva
rigida con Chl a y Chl b. Son algas planas, Porphyra presenta una sola capa de células
mientras Ulva tiene dos capas. Se seguirá el método descrito por Mercado et al. (1996).
MÉTODO
Colocar un trozo de talo de alga humedecida en agua de mar entre dos portaobjetos y
colocar un cristal de ópalo que actúa de placa difusora entre los portaobjetos y el
detector del espectrofotómetro con la parte blanca opaca en dirección al haz de luz del
aparato. Se realiza un barrido espectral entre 400-750 nm y se opera de la siguiente
manera,
- de Chl a
Achl a = 1 - 10-DOchla
siendo
DOchl a = DO680 - DO750
-de Chl b
Achl b = 1 - 10-DOchl b
siendo
DOchl b = DO647 - DO750
2.1.9.3.1.2. Porphyra
- Chl a:
Achl a = 1 - 10-DOchl a
siendo
DOchl a = DO680 - DO750
- Ficoeritrina (PE):
APE = 1 - 10-DOPE
siendo
DOPE = DO566 - DO750
- Ficocianina (PC)
APC = 1-10-DOPC
siendo
DOPC = DO624 - DO750
A=1-T-R
2.1.9.3.2.1. Reflectancia
R = I s - I d / Ir - I d
donde Is es la medida de la luz que sale de la esfera cuando se ilumina la muestra, Ir es
la medida cuando se ilumina el material de referencia (placa de Sulfato de bario) e Id es
la iluminación debida a la radiación de fondo (“extraviada o stray”). Se mide cuando se
ilumina el puerto donde se coloca la muestra pero sin ésta (la radiación externa a la
esfera que puede salirse a través del puerto no cubierto de la muestra). La mayor parte
de la radiación que procede del iluminador pasará a través del puerto de la muestra. La
única radiación que ilumina la pared será la “stray” o “extraviada”.
2.1.9.3.2.2. Transmitancia
It = Is / Ir
es 1 (100%).
MÉTODO
Se determinará la densidad óptica de la solución de algas a partir de la DOfiltro de
acuerdo a la ecuación de Mitchell (1990) indicada arriba. Se realiza la extracción de
pigmentos con DMF y se determina la DO de la solución (los valores máximos en el
espectro.
Un estimador de la eficiencia de absorción de luz y más fácil de determinar que por el
procedimiento de Kirk (1983) es el cociente entre la absortancia in vivo a la longitud de
onda máxima de absorción de un determinado pigmento y la concentración de ese
pigmento.
1. Chl a y Chl b
Las biliproteínas se extraen en tampón fosfato 0.1M pH 6.8 usando para la extracción
un mortero de extracción. El extracto se centrifuga a 10.000 g durante 20 min.
determinando la absorbancia en diversas longitudes de onda (abajo indicadas) y de
acuerdo a las siguientes expresiones (Beer & Eshel, 1985).
multiplicando por el volumen de extracción (mL) y dividiendo por el peso húmedo (g)
se expresarán la concentración de pigmentos en mg por peso de alga.
celulares
2.1.9.5.1. Fitoplancton
Rcultivo = Iu / Id
2.1.9.5.2. Macroalgas
BIBLIOGRAFÍA