Kegiatan ke 1

Sterilisasi Alat dan Bahan

A. Tujuan Kegiatan
Mahasiswa dapat mengetahui proses sterilisasi

B. Kajian Pustaka
Prinsip pembebasan (pengendalian) mikroorganisme, termasuk bakteri, dari
suatu bahan merupakan aspek penting dalam proses analisi bakteri di dalam
laboratoium. Prinsip pembebasan suatu bahan dari kontaminasi
mikroorganisme, merupakan hal yang sangan vital dalam analisis-analisis
bakteriologis. Hal ini dimaksudkan agar, dalam analisis bakteriologis
dilaboratorium, betul-betul dimulai dari keadaan alat dan bahan yang
digunakan terbebas dari kehidupan apapun. Hal ini dimaksudkan agar dalam
proses analisis bakteriologis di laboratorium, tidak di pengaruhi oleh berbagai
mikroorganisme yang tidak dikehendaki yang ada pada alat dan bahan yang
digunakan. Sehingga tidak mengacaukan proses dan hasil analisis
bakteriologis. Pembebasan suatu bahan, wadah, dari kehidupan nikroorganisme
apapun, akan menghasilkan suatu keadaan yang bebas dari kehidupan apa pun.
Keadaan suatu bahan atau wadah yang terbebas dari kehidupan apapun disebut
steril. Proses pembebasan suatu bahan atau wadah dari kehidupan apapun dapat
dilakukan dengan sterilisasi atau disinfeksi (Boleng, 2015: 65-66).
Sterilisasi adalah suatu proses yang digunakan untuk menghancurkan atau
mengurangi mikroorganisme yang dapat muncul pada atau dalam produk atau
kemasan. Sediaan steril memiliki beberapa sifat bentuk takaran yang unik,
seperti bebas dari mikroorganisme, pirogen dan bebas dari partikulat serta
memiliki standar yang sangat tinggi dalam hal kemurnian dan kualitas. Tujuan
utama pembuatan sediaan steril adalah mutlak tidak adanya kontaminasi
mikroba. Kontaminasi dapat berasal dari beberapa penyebab diantaranya
adalah sterilisasi media yang kurang sempurna, lingkungan kerja dan
 2

pelaksanaan cara kerja saat penanaman, eksplan, molekul-molekul atau benda-

benda asing berukuran kecil yang jatuh atau masuk ke dalam botol kultur
setelah penanaman dan ketika diletakkan di ruangan (Syah, 2016: 3).
Sterilisasi dalam mikrobiologi berarti membebaskan tiap benda atau
substansi dari semua kehidupan dalam bentuk apapun. Untuk tujuan
mikrobiologi dala usaha mendapatkan keadaan steril, mikroorganisme dapat
dimatikan setempat (in situ) oleh panas (kalor), gas-gas seperti formaldehide,
etilenoksida atau betapriolakton oleh bermacam-macam larutan kimia; oleh
sinar lembayung ultra atau sinarr gamma. Mikroorganisme juga dapat
disingkirkan secara mekanik oleh sentrifugasi kecepatan tinggi atau filtrasi
(Irianto, 2006: 75).
Menurut Boleng (2015: 67-71), cara-cara sterilisasi adalah sebagai berikut:
1. Sterilisasi secara fisik
Sterilisasi secara fisik, terdiri atas beberapa macam yaitu:
a. Sterilisasi yang menggunakan cahaya matahari
1) Sinar ultraviolet
2) Sterilisasi cara ini digunakan untuk sterilisassi air sungai , dalam
b. Sterilisasi dengan cara pengeringan
Pengeringan digunakan untuk membunuh kuman, terutama bentuk
vegetatifnya. Sterilisasi dengan cara pengeringan tidak efektif terhadap
spora kuman.
c. Sterilisasi dengan cara pemanasan
Beberapa faktor yang mempengaruhi proses sterilisasi pemanas
adalah:
1) Jenis pemanasan; pemanasan basa atau pemanasan kering
2) Suhu dan lama pemanasan
3) Angka (jumlah) sel mikroorganisme yang ada
4) Keberadaan spora didalam sel mikroorganisme
5) Jenis bahan yang mengandung mikroorganisme
1) Pemanasan kering
 3

Dasar-dasr proses membunuh kuman dengan pemanasan kering

adalah:
a) Denaturasi protein
b) Kerusakan akibat oksidasi
c) Efek toksis akibat kadar elektron
Ada beberapa macam pemanasan kering, yaitu:
a) Pemanasan langsung sampai merah, pemanasan ini digunakan
untuk sterilisasi pemanasan logam (contoh: pemanasan sengkelit).
Cara pemanasannya adalah menggunakan bahan yang akan
disterilkan tersebut diatas nyala api sampai bahan tersebut
bewarnah merah.
b) Melayangkan diatas nyala api, cara ini adalah dilayangkan bahan
yang akan disterilkan tersebut diatas nyala api, tanpa harus menjadi
merah sekali. Contohnya, sterilisasi pada mulut tabungan biakan,
perbenihan.
c) Pembakaran, cara ini merupakan cara terbaik untuk sterilisasi
secara cepat. Contohnya, membakar bangkai hewan, bahan-bahan
patologis
d) Sterilisasi dengan udara panas, sterilisasi ini dengan memerlukan
suhu 1600C, selama satu jam. Cara sterilisasi ini biasanya
digunakan untuk sterilisasi lempeng petri, dan tabung reaski.
2) Pemanasan basah, efeknya adalah denaturasi protein. Ada beberapa
Cara sterilisasi dengan pemanasan basah, yaitu:
a) Pemanasan dengan menggunakan suhu dibawah 1000C
Pemanasan dengan menggunakan suhu 630C selama 30 menit
(cara Holder). Pemanasan dengan suhu 720C selama 15-20 menit
(cara Flash). Sasaran utamanya adalah bakteri-bakteri
Mycobakterium, Salmonella, Brucella.
b) Pemanasan dengan menggunakan suhu 100°C
Pemanasan dengan uap air dengan tekanan. Proses pendidihan
tidak cukup untuk memperoleh keadaan steril, karena spora kuman
 4

masih hidup. Oleh karena itu, diperlukan alat sterilisasi dengan

tekanan yaitu otoklaf. Pada alat ini bahan-bahan yang akan
disterilkan dipanaskan sampai suhu 121°C selama 15-20 menit
pada tekanan uap 15 pound per inci (kira-kira 1,5 atmosfir).
Otoklaf dipergunakan untuk mensterilkan pembenihan. Bahan-
bahan dari karet pakaian, pembalut dan lain sebagiannya.

Gambar 1: Otoklaf
Sumber: Boleng (2015: 70)
d. Sterilisasi dengan cara penyaringan
Sterilisasi dengan cara ini berguna untuk larutan antibiotik, serum,
larutan karbohidrat, dan lain-lain. Cara ini juga berguna untuk
memisahkan kuman dari toksin dan dari fage. Sterilisasi cara ini
digunakan dalam meyaring kuman yang jumlahnya sedikit didalam suatu
cairan. Virus dan mikroplasma dapat lewat saringan kuman. Hal ini
merupakan kekurangan dari cara sterilisasi dengan penyaringan ini. Ada
beberapa jenis saringan kuman yaitu; filter dari gelas berlubang, filter
membran atau kolodion, tabung porselen (misalkan Berkefeld atau
Caberland), filter piringan abses (misalnya Seitz).
e. Sterilisasi dengan cara radiasi, sterilisasi ini terdiri atas beberaapa cara,
yaitu:
1) Sterilisasi dengan sinar ultraviolet (UV), ssterilisasi dengan sinar ini
mengakibatkan terjadinya denaturasi protein, kerusakan DNA,
hambatan replikasi DNA.
2) Sterilisasi dengan sinar X dan pengion lain, sterilisasi dengan cara ini
menyebabkan kerusakan atau kematian DNA sel. Sterilisasi ini
 5

biasanya dipergunakan untuk mensterilkan benang-benang bedah

semperit sekali pakai, pembalut lekat
f. Sterilisasi dengan ultrasonik dan geretan sonik, proses ini bersifat
bakteriosidal. Biasa menimbulkan guncangan mekanis dan pecahnya
kuman.
2. Sterilisasi secara kimia
Bahan kimia bersifat bakteriostatik. Hal ini disebabkan:
a) Bahan kimia tersebut dapat mengumpulkan protoplasma kuman
b) Bahan kimia tersebut dapat menimbulkan kerusakan selaput sitoplasma
c) Bahan kimia tersebut dapat mempengaruhi oksidasi atau pembakaran
protoplasma kuman
d) Bahan kimia tersebut dapat mempengaruhi enzim atau koenzim kuman.
Autoclave adalah alat untuk mensterilkan berbagai macam alat dan bahan
yang digunakan dalam mikrobiologi menggunakan uap air panas bertekanan.
Tekanan yang digunakan pada umumnya 15 Psi atau sekitar 2 atm dan dengan
suhu 121° C (250° F). Jadi, tekanan yang bekerja ke seluruh permukaan benda
adalah 15 pon tiap inchi2 (15 Psi = 15 pounds per square inch). Lama sterilisasi
yang dilakukan biasanya 15 menit untuk 121° C (Widodo, 2015: 6).
Menurut Widodo (2015: 6-7) cara penggunaan autoklaf yaitu sebagai
berikut :
1. Sebelum melakukan sterilisasi cek dahulu banyaknya air dalam autoklaf.
Jika air kurang dari batas yang ditentukan maka dapat ditambah air sampai
batas tersebut. Gunakan air hasil destilasi, untuk menghindari terbentuknya
kerak dan karat.
2. Masukkan peralatan dan bahan. Jika mensterilisasi botol bertutup ulir maka
tutup harus dikendurkan.
3. Tutup autoklaf dengan rapat lalu kencangkan baut pengaman agar tidak ada
uap yang keluar dari bibir autoklaf. Klep pengaman jangan dikencangkan
terlebih dahulu.
4. Autoklaf dinyalakan, diatur timer dengan waktu minimal 15 menit pada
suhu 121° C.
 6

5. Ditunggu sampai air mendidih sehingga uapnya memenuhi kompartemen

autoklaf dan terdesak keluar dari klep pengaman. Kemudian klep pengaman
ditutup (dikencangkan) dan ditunggu sampai selesai. Penghitungan waktu
15 menit dimulai sejak tekanan mencapai 2 atm.
6. Jika alarm tanda selesai berbunyi maka tunggu tekanan dalam kompartemen
turun hingga sama dengan tekanan udara di lingkungan (jarum pada
preissure gauge menunjuk ke angka nol). Kemudian klepklep pengaman
dibuka dan keluarkan isi autoklaf dengan hati-hati.

Gambar 2: Proses Sterilisasi

Sumber: Widodo (2015:22).
Pada saat sumber panas dinyalakan, air dalam autoklaf lama kelamaan akan
mendidih dan uap air yang terbentuk mendesak udara yang mengisi autoklaf.
Setelah semua udara dalam autoklaf diganti dengan uap air, katup uap atau
udara ditutup sehingga tekanan udara dalam autoklaf naik. Pada saat tercapai
tekanan dan suhu yang sesuai, maka proses sterilisasi dimulai dan timer mulai
menghitung waktu mundur. Setelah proses sterilisasi selesai, sumber panas
dimatikan dan tekanan dibiarkan turun perlahan hingga mencapai 0 psi.
Autoklaf tidak boleh dibuka sebelum tekanan mencapai 0 psi (Widodo, 2015:
22).
Alat yang terbuat dari logam sebelum disteril dicuci terlebih dahulu.
Dibiasakan segera mencuci alat-alat begitu selesai memakainya agar kotoran
yang melengket mmudah dibersihkan. Alat-alat logam (jarum suntik, pinset,
gunting, jarum operasi, scalpel blede) maupun tabung reaksi, pipet, petrisdik,
mula-mulaa dibersihkan terlebih dahulu kemudian dibungkus dengan kain gas.
Setelah itu menggunakan metode pemanasan secara kerirng, suhu mencapai
 7

160°C, jarak waktu 1-2 jam, kemudian didiamkan agar suhu turun perlahan-
lahan. Media kultur yang akan disteril, terlebih dahulu dibungkus dengan
kertas agar setelah disteril dan dikeluarkan dari alat sterilisator tidak
terkontaminasi dengan kuman lagi (Gabriel, 2012: 35).
Menurut Widodo (2015: 22-23) beberapa media atau bahan yang tidak
disterilkan dengan autoklaf adalah sebagai berikut.
1. Bahan tidak tahan panas, seperti serum, vitamin, antibiotik, dan enzim.
2. Pelarut organik, seperti fenol.
3. Buffer dengan kandungan detergen, seperti SDS.
 8

C. Alat dan Bahan

1. Alat
2.
a. Labu Erlenmeyer 1 buah
b. Cawan Petri 2 buah
c. Tabung Reaksi 3 buah
d. Pipet Ukur 2 buah
e. Ozon sterilizer 1 unit
f. Autoklaf 1 unit
2. Bahan
a. Semua alat yang disterilisasi
b. Alumunium Foil secukupnya
c. HVS secukupnya
d. Label 5 lembar
e. Tisu secukupnya
f. Alkohol 50% secukupnya

D. Cara Kerja
1. Penggunaan ozon sterilizer
a. Alat yang akan di sterilisasi diambil, kemudian dicuci dengan
menggunakan air bersih
b. Alat yang sudah dicuci dikeringkan menggunakan tisu hingga benar-
benar kering
c. Permukaan alat-alat atau bahan yang akan disterilisasi dibungkus
menggunakan alumunium foil dan HVS untuk meminimalisir adanya
spora bakteri kontaminan
d. Setelah itu, alat yang sudah dibungkus disterilisasi menggunakan alat
ozon sterilizer
e. Alat dan atau bahan yang tidak tahan panas (<180°C) ditempatkan pada
rak pintu atas dan yang tahan panas (<250°C) pada rak pintu bawah
 9

f. Pintu sterilizer dalam keadaan tertutup sebelum dihubungkan ke stop

kontak
g. Ozon sterilizer dihubungkan dengan stop kontak pada sumber arus 220V
h. Alat Ozon sterilizer dihidupkan dengan cara menekan tombol “POWER”
i. Proses sterilisasi dapat dimulai dengan menkan tombol “DESINFECT”
(kiri power) hinggalampu indicator menyala merah
j. Untuk mengaktifkan sterilisasi teknologi ozone pada rak pintu atas,
dengan menekan tombol O3 (kiri disinfect) hingga lampu indicator
menyala kuning
k. Proses sterilisasi berjalan selama ± 10 menit setelah lampu indikator mati
(dilarang membuka pintu Ozon sterilizer) otomatis
l. Lampu indikator power ditunggu hingga menyala, lalu matikan dengan
menekan tombol power
m. Sebelum membuka pintu Ozone sterilizer disarankan untuk menunggu
±20 menit, terhitung waktu setelah proses sterilisasi berakhir
2. Penggunaan autoklaf
a. Air dimasukkan hingga menyentuh besi penyangga agar pemanasan lebih
maksimal
b. Aluminium foil dibungkus secara merata pada dasar panic pemanas
c. Alat dimasukkan ke dalam panic pemanas
d. Autoklaf ditutup kemudian selang di dalam autoklaf dimasukkan ke
dalam lubang yang berada di dalamnya
e. Autoklaf ditutup dengan rapat lalu dikunci dengan klap
f. Tombol on ditekan pada bagian bawah autoklaf dan diputar ke
temperature high
 10

E. Hasil Pengamatan
Dokumentasi Cara Kerja
No Nama Gambar (Foto) Tujuan Perlakuan
Kerja
 11

Kegiatan ke 2
Pembuatan Nutrient Agar dan Penanaman Bakteri

A. Tujuan Kegiatan
1. Mahasiswa dapat mengetahui pembuatan nutrient agar
2. Mahasiswa dapat mengisolasi mikroorganisme dari bahan pemeriksaan
3. Mahasiswa dapat membuat kultur mikroorganisme
4. Mahasiswa dapat menyimpan stok bakteri

B. Kajian Pustaka
Untuk dapat bertahan hidup di alam, bakteri harus dapat tumbuh dengan
baik. Kondisi yang memungkinkan sel bakteri dapat tumbuh adalah keberadaan
nutrisi yang dibutuhkannya. Nutrisi yang dibutuhkan sel bakteri harus ada
dalam jumlah yang cukup dalam media pertumbuhannya (Boleng, 2015 : 79).
Nutrisi yang diperlukan oleh bakteri untuk meningkatkan komponen -
komponen penyusun selnya, merupakan kebutuhan yang harus terpenuhi dan
tersedia dalam media pertumbuhannya di laboratorium. Hal ini didasarkan pada
kebutuhan sel bakteri akan karbon (C), hydrogen (H), nitrogen (N), sulfur (S),
air, beberapa unsur logam seperti: Ca, Mg, Zn, Pb, Co; vitamin. Semua unsur-
unsur kimia ini terdapat dalam nutrsi, dan dibutuhkan oleh bakteri untuk
menyususn komponen-komponen, dan aktivitas selnya.
Menurut (Boleng, 2015: 80) Agar bakteri dapat hidup dan berkembang
dengan baik didalam media, diperlukan persyaratan media tertentu yaitu:
1) Media mengandung semua unsur hara yang diperlukan untuk pertumbuhan
dan perkembangbiakan bakteri.
2) Media mempunyai tekanan osmosa dan pH yang sesuai untuk bakteri
3) Media harus dalam keadaan steril.
Bentuk media ditentukan oleh ada atau tidak adanya zat pemadat seperti
agar, gelatin. Berdasarkan bentuk, dikenal tiga jenis media, yaitu: media padat,
media cair, media semi-padat.
 12

Media padat (media solid); merupakan media yang berbentuk padat, yang
terdiri atas nutrisi yang ditambah dengan Agar-Agar sebagai pemadat, yang dibuat
padat dalam cawan (plate) atau dalam bentuk Agar miring alam tabung. Media
padat, dibuat dengan menambahkan komponen pemadat seperti Agar ke dalam
medium kaldu. Contoh media padat adalah Nutrien Agar (NA). Media padat
umumnya dipergunakan untuk mempelajari penampilan atau koloni bakteri.
Selain itu, media padat dipergunakan juga mengasingkan kuman untuk
mendapatkan koloni terpisah (untuk memperoleh biakan murni)
Media cair (media broth ); merupakan media yang terdiri dari nutrisi-
nutrisi yang berbentuk cair. Media ini tidak ditambahkan dengan komponen
pemadat seperti Agar. Oleh karena itu, dalam suhu kamar, wujud media ini selalu
cair. Contoh media cair adalah kaldu nutrient (nutrient broth). Media cair
dipergunakan untuk: membiakan mikroorganisme dalam jumlah besar, penelaan
fermentasi, perlakuan berbgai macam uji. Media ini tidak cocok untuk
pengasingan bakteri untuk memperoleh biakan murni, juga tidak dapat dipakai
untuk mempelajari koloni bakteri.
Media setengah padat (semi-solid); merupakan media yang dibuat dengan
menambahkan komponen pemadat, misalnya Agar, yang hanya setengah atau
kurang dari seharusnya kedalam nutrsi. Dengan demikian, tingkat konsistensi
media ini lebih rendah jika dibandingkan dengan media padat (media solid).
Media setengah padat dipergunakan untuk: menguji ada tidaknya motilitas
(pergerakan) sel bakteri, menguji ada tidaknya kemampuan fermentasi bakteri.
Berdasarkan sifat atau kegunaannya, media pertumbuhan bakteri
dikelompokkan menjadi: media umum, media sederhana, media pengaya, media
pemupuk, media diferesiasi, media selektif, media khusus, media serbaguna.
Media umum; adalah media yang dipergunakan untuk pertumbuhan dan
perkembangbiakan satu lebih kelompok mikroba (bakteri) secara umum. Contoh
media ini adalah agar kaldu nutrsi.
Media pengaya; adalah dimna suatu jenis diberi kesempatan untuk tumbuh
lebih cepat dari jenis bakteri yang lain yang sama-sama berada di dalam satu
 13

media.. misalnya kaldu selenit atau kaldu tertrationat untuk memisahkan

Salonella typhi dari mikroba lain yang ada dalam feces.
Media pemupuk (enrichment); merupakan media yang ditambah dengan
suatu bahan, untuk mempersubur bakteri tertentu saja, dan bahan yang
ditambahkan tersebut dapat menghambat pertumbuhan bakteri lain.
Media pembanding (diffrensial); merupakan media yang dipergunakan
untuk pertmbuhn bakteri tertentu, serta penentuan sifat-sifatnya. Media
pembanding dipergunakan untuk membedakan dua kelompok bakteri tertentu,
berdasarkan sifat metabolisme kedua kelompok bakteri tersebut. Misalnya
penggunaan media untuk menentukan kemampuan memfermentasi laktosa dari
bakteri.
Media selektif; merupakan media yang hanya dapat ditumbuhi oleh satu
atau jenis bakteri tertentu, tetapi menghambat atau mematikan jenis-jenis bakteri
lainnya . media ini mengandung zat-zat kimia tertentu yang dapat menghambat
pertumbuhan satu kelompok bakteri atau lebih, tanpa menghambat pertumbuhan
organisme yang diinginkan. Misalnya media SS (salmonella-shigella) Agar, untuk
menumbuhkan salmonella shigella, tetapi media ini dapat menghambat atau
mematikan bakteri lain yang tidak dikehendaki.
Media khusus; merupakan media yang ditambahkan dengan suatu bahan
untuk pertumbuhan suatu bakteri tertentu. Misalnya, media yang ditambah dengan
darah domba, kelinci, atau kuda; untuk mengathui kemampuan bakteri dalam
melakukan hemolisa.
Media serbaguna; merupakan media yang dapat menunjang pertumbuhan
sebagian besar bakteri. Misalnya kaldu nutrient (nutrient broth).
Populasi bakteri di alam sangat banyak. Keberadaan bakteri di alam, dapat
dijumpai di udara, tanah, dan air. Bakteri-bakteri yang di alam terdiri atas banyak
jenis. Oleh karena itu, jika ditumbuhkan dalam media yang memungkinkan
seluruh jenis bakteri tumbuh, maka akan diperoleh kultur campuran (bakteri yang
terdiri atas berbagai spesies).
Untuk memperoleh kultur murni, maka dalam kultivasi (penanaman)
bakteri di laboratorium, dilakukan metode penanaman tertentu. Metode-metode
 14

kultivasi yang dapat diterapkan dalam upaya memperoleh kultur murni, adalah:
metode goresan dilakukan dengan menggoreskan sel-sel bakteri dengan
menggunakan ose pada media padat di dalam cawan petri, atau media padat
miring di dalam tabung. Metode tuang, dilakukan dengan didahului mengencerkan
sampel yang mengandung bakteri. Dalam metode tuang, setelah dilakukan
pengenceran, kemudian sampel tersebut disedot dengan jumlah tertentu dengan
menggunakan pipet, dan dimasukkan ke dalam cawan petri. Selanjutnya,
ditambahkan dengan media padat, digoyang-goyang agar media dan sampel dapat
bercampur dengan merata.
Media perbenihan adalah media nutrsi yang disiapkan untuk
menumbuhkan bakteri di dalam skala laboratorium. Beberapa bakteri dapat
tumbuh dengan baik pada setiap media perbenihan, sedangkan yang lain
mebutuhkan media khusus.
Media perbenihan harus dapat menyediakan energy yang dibutuhkan
untuk pertumbuhan bakteri. Media harus mengandung sumber karbon, nitrogen,
sulfur, fosfor, dan factor pertumbuhan organic.
Sejumlah bakteri yang diinokulasikan pada sebuah media perbenihan
disebut inoculum. Bakteri yang tumbuh dan berkembang biak dalam media
perbenihan itu disebut biakan bakteri. Media perbenihan harus memenuhi
persyaratan sebagai berikut.
1) Harus mengandung nutrsi yang tepat untuk bakteri spesifik yang akan
dibiakkan.
2) Kelembapan harus cukup, pH sesuai, dan kadar oksigen cukup baik.
3) Media perbenihan harus steril dan tidak mengandung mikroorganisme
lain.
4) Media iinkubasi pada suhu tertentu.
Jika ingin menumbuhkan bakteri pada media padat, agar ditambahkan kedalam
media pertumbuhan. Agar adalah kompleks polisakarida yang diperoleh dari
ganggang laut. Beberapa mikroba mampu menyintesis senyawa agar sehingga
membentuk padatan. Agar mencair pada suhu sekitar 100oC. pada suu ini, agar
 15

belum mencair kembali. Sifat ini sangat berguna untuk menumbuhkan bakteri
termofilik.
Media agar biasanya dimasukkanke dalam tabung reaksi atau ke dalam
cawan petri. Agar yang ditempatkan di dalam tabung reaksi dengan posisi tabung
dimiringkan disebut dengan agar miring (slant). Agar miring mempunyai luas
permukaan yang lebih luas untuk pertumbuhan dibandingkan agar tegak. (Radji,
2010: 29).
Media Nutrient Agar (NA) sering digunakan untuk media biakan bakteri
dilaboratorium. Media NA dibuat dari 3 g ekstrak daging, 5 g pepton, 1000 ml
air dan 15 g agar-agar. Ekstrak daging dapat digantikan dengan air kaldu yang
dibuat dari 1 kg daging segar bebas lemak yang direbus dengan air sampai
diperoleh air kaldu 2000 ml, kemudian ditambah 0,5% natrium klorida. Nutrisi
yang dibutuhkan untuk pertumbuhan mikroorganisme yaitu karbon, nitrogen,
unsur non logam (sulfur, fosfor), unsur logam (Ca++, Zn++, Na+, K+, Cu++,
Mn++, Mg++ dan Fe+2+3), vitamin, air, energi. Bakteri membutuhkan sumber –
sumber makanan yang mengandung C,H, O dan N yang berguna untuk
menyusun protoplasma (Ariyanti, 2016 : 2).
Menurut Waluyo (2007 : 61 – 62), beberapa langkah pada pekerjaan
inokulasi dan isolasi mikroba adalah sebagai berikut:
1. Menyiapkan ruangan
Ruang tempat inokulasi harus bersih, dan bebas angin. Dinding ruang
yang basah menyebabkan butir-butir debu menempel. Pada waktu
mengadakan inokulasi, baik sekali bila meja tempat inokulasi didasari
dengan kain basah. Pekerjaan inokulasi dapat dilakukan di dalam suatu
kotak berkaca (ent-kas)
2. Pemindahan dengan kawat inokulasi
Ujung kawat inokulasi sebaiknya dari platina atau dari nikrom, ujung
kawat boleh lurus, boleh juga berupa kolongan yang berdiameter 1-3 mm.
Lebih dahulu ujung kawat ini dipijarkan sedang sisanya sampai tangkai
cukup dilewatkan nyala api saja. Setelah dingin kembali, ujung kawat itu
disentuhkan suatu koloni
 16

3. Pemindahan dengan pipet

Cara ini dilakukan misalnya pada penyelidikan air murni atau
penyelidikan susu
4. Teknik biakan murni (Cara menyendirikan piaraan murni)
Dialam bebas tidak ada mikroba yang hidup tersendiri terlepas dari
spesies lain. Seringkali mikroba patogen kedapatan secara bersama-sama
dengan mikroba saproba (saprobakteri). Dalam tekni biakan murni tidak
saja diperlukan bagaimana memperoleh suatu biakan murni, tetapi juga
bagaimana memelihara serta mencegah pencemaran dari luar. Medium
untuk membiakkan mikroba haruslah steril sebelum digunakan.
Pencemaran (kontaminasi) dari luar terutama berasal dari udara yang
mengandung banyak mikroorganisme. Teknik biakan murni untuk spesies
dikenal dengan beberapa cara.
 17

C. Alat dan Bahan

1. Alat
a. Batang Pengaduk 1 buah
b. Bola Hisap 2 buah
c. Bunsen 1 unit
d. Cawan Petri 2 buah
e. Hot Plate 1 unit
f. Inkubator 1 unit
g. Jarum Ose 1 buah
h. Labu Erlenmeyer 1 buah
i. Ozone Sterilizer 1 buah
j. autoklaf 1 buah
k. Pipet Ukur 2 buah
l. Rak Tabung Reaksi 1 buah
m. Spatula 1 buah
n. Tabung Reaksi 3 buah
o. Timbangan Digital 1 unit
2. Bahan
a. Aluminium Foil Secukupnya
b. Aquades 250 ml
c. Label
d. Nutrient Agar (NA) sebanyak 5 gram untuk pembuatan larutan
sebanyak 250 ml
e. Susu Pasteurisasi 100 ml
f. Tisu Secukupnya

D. Cara Kerja
1. Pembuatan Nutrient Agar (NA)
a. Timbangan digital yang akan digunakan disiapkan, kemudian
hidupkan dan dikalibrasi.
 18

b. Kertas HVS diletakkan di atas timbangan sebagai alas untuk

menimbang Nutrient Agar, kemudian dikalibrasi kembali.
c. Nutrient Agar diambil nmenggunakan spatula dan letakkan di atas
timbangan digital sebanyak 5 gr.
d. Nutrient Agar yang sudah ditimbang dimasukkan ke dalam labu
erlenmeyer.
e. Aquades sebanyak 250 ml dimasukkan ke dalam labu erlenmeyer
yang berisi Nutrient Agar tadi.
f. Nutrient Agar dengan air dihomogenkan .
g. Setelah homogen, bagian atasnya ditutup dengan menggunakan
alumunium foil.
h. Lalu dimasukkan ke dalam autoklaf dan tungggu hingga proses
sterilisasi selesai.

2. Metode Tuang (Pour Plate)

a. Aquades dimasukkan ke dalam labu erlenmeyer sebanyak 250 ml.
b. Susu pasteurisasi dimasukkan ke dalam labu erlenmeyer sebanyak 100
ml.
c. 3 tabung reaksi yang sudah disterilisasi disiapkan dan letakkan pada
rak tabung reaksi .
d. Susu pasteurisasi dimasukkan ke dalam tabung reaksi I, sebanyak 1 ml
menggunakan pipet ukur dengan bantuan bola hisap.
e. Aquades ditambahkan sebanyak 9 ml menggunakan pipet ukur dengan
bantuan bola hisap.
f. Larutan yang berada pada tabung reaksi I diambil untuk dimasukkan
ke dalam tabung reaksi II sebanyak 1 ml menggunakan pipet ukur
dengan bantuan bola hisap .
g. Aquades sebanyak 9 ml ditambahkan, menggunakan pipet ukur
dengan bantuan bola hisap.
 19

h. Larutan yang berada pada tabung reaksi II diambil, untuk dimasukkan

ke dalam tabung reaksi III sebanyak 1 ml menggunakan pipet ukur
dengan bantuan bola hisap.
i. Aquades sebanyak 9 ml ditambahkan, menggunakan pipet ukur
dengan bantuan bola hisap.
j. Langkah d-i diulangi dengan menggunakan tabung reaksi yang
berbeda.
k. Tabung reaksi bagian atas ditutup menggunakan Alumunium foil dan
diberi label (10-1, 10-2 dan 10-3).
l. Rak tabung reaksi diletakkan dekat dengan bunsen, setelah proses
pengenceran selesai dilanjutkan pembuatan media tanam dengan
metode tuang.
m. Larutan Nutrient Agar yang sudah disterilisasi dipanaskan
menggunakan Hot plate sambil diaduk menggunakan batang
pengaduk.
n. 3 cawan petri disiapkan dan diletakkan didekat bunsen.
o. Larutan Nutrient Agar yang sudah dihomogenkan dimasukkan ke
dalam cawan petri dengan hati-hati kemudian cawan petri ditutup
dengan kaca penutupnya.
p. Larutan susu ditambahkan pada tabung reaksi III yang merupakan
hasil pengenceran sebelumnya, sebanyak 1 ml
q. Cawan petri yang berisi larutan Nutrient Agar dan susu (hasil
pengenceran) divorteks agar homogen.
r. Cawan petri kedua ditambahkan dengan larutan susu pada tabung
reaksi II hasil pengenceran sebelumnya sebanyak 1 ml (sebagai
perbandingan), kemudian dihomogenkan hingga memadat.
s. Cawan petri yang telah memadat masing-masing dimasukkan ke
dalam inkubator selama 48 jam dengan suhu 37◦C dengan posisi
terbalik.

3. Metode Gores (Streak Plate)

 20

a. Nutrient Agar yang sudah disterilisasi dipanaskan menggunakan Hot

plate sambil diaduk menggunakan batang pengaduk.
b. Larutan Nutrient Agar yang sudah disterilisasi dari hot plate
didinginkan beberapa saat.
c. 2 cawan petri yang sudah disterilisasi disiapkan dan diletakkan di
dekat bunsen
d. Nutrient Agar yang sudah panas dimasukkan ke dalam cawan petri
dengan hati-hati hingga terisi setengah dari cawan petri.
e. Nutrien Agar didiamkan ± 30 menit hingga memadat.
f. Nutrien Agar padat, cawan petri dibalik kemudian buat garis yang
membagi cawan petri menjadi 4 bagian (kuadran) (I,II,III,IV) yang
sama besar.
g. Jarum Ose dipanaskan menggunakan bunsen, lalu celupkan ke dalam
susu pasteurisasi dan digoreskan ke kuadran I secara perlahan dengan
arah zig zag yang rapat.
h. Jarum ose dipanaskan kembali dengan menggunakan Bunsen dan
digoreskan ke kuadran II dengan arah zig zag yang lebih renggang
dari kuadran I.
i. Jarum ose dipanaskan kembali dengan menggunakan Bunsen dan
digoreskan ke kuadran III dengan arah zig zag yang lebih renggang
dari kuadran II.
j. Jarum ose dipanaskan kembali dengan menggunakan Bunsen dan
digoreskan ke kuadran IV dengan arah zig zag yang lebih renggang
dari kuadran III
k. Cawan Petri diberi label bagian atas dan bawah
l. Setelah itu, dimasukkan ke dalam inkubator dengan bagian bawah
menghadap keatas selama 48 jam dengan suhu 37◦C.

E. Hasil Pengamatan
Dokumentasi Cara Kerja
 21

No Nama Gambar (Foto) Keterangan Cara

Kerja