Enzimas y Biotecnología

Producción Enzimas diseñadas para

de enzimas de un proceso particular
1
uso industrial

Aplicaciones
Industriales de las
Enzimas

Detergentes Alimentos Papel

Textil Energía

Productos
Farmacéuticos
2

1
Alimentos

Papel

Amilasas

Celulasas Lacasas

Hemicelulasas Lipasas/esterasas

Pectinasas Xilanasas
4

2
 Textil JEANS

Amilasas: para eliminar el almidón que recubre a las telas: DESENGOMADO.

Lipasas: produce el DESENGRASANDO las telas.

Pectinasas: extrae las pectinas algodón, permitiendo que la fibra quede más
limpia y absorbente.

Catalasas y peroxidasas: descompone al H2O2 remanente del blanqueo de las

fibras de algodón para que las fibras puedan ser teñidas.

Celulasas: degradan las fibras de la superficie haciendo a los tejidos más lisos y
suaves. Otorga apariencia de lavado a piedra del jean.

Lacasas: para la oxidación del índigo (colorante de tipo fenólico) en la

preparación de telas para jeans. 5

Energía

Residuos vegetales y forestales

Residuos animales
Biomasa
Residuos de la industria agrícola

Residuos urbanos

Biodiesel Bioetanol

3
 Productos
Farmacéuticos
CREMAS EXFOLIANTES Y LIMPIADORAS

COMPRESAS CICATRIZANTES

ENZIMAS TERAPEUTICAS

BROMELINA
L -ASPARRAGINASA
TRIPSINA 7

Detergentes
 Lipasas
 Amilasas
 Proteasas

4
 INMOVILIZACIÓN
DE ENZIMAS

Proceso en el cual se confina o localiza a una enzima en una

región definida del espacio para dar lugar a formas insolubles
que retienen su actividad catalítica las cuales pueden ser
reutilizadas repetidamente.

ORGÁNULOS,
INMOVILIZACIÓN CÉLULAS
ORGANELAS.
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INMOVILIZACION

ENZIMA SOPORTE

Propiedades Bioquímicas Características Químicas

Tipo de reacción o cinética Propiedades Mecánicas

Método de Eficiencia (E) Estabilidad

Inmovilización Operacional
Rendimiento (%) # Ciclos

Productividad 10

5
 ATRIBUTOS DE UN SOPORTE IDEAL
PARA INMOVILIZACIÓN

 Elevada Área Superficial

 Buena Permeablilidad
 Insolublilidad

 Regenerabilidad
 Resistente al ataque microbiano y químico
 Establilidad térmica y mecánica

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Ventajas del empleo de Enzimas Inmovilizadas

1.- El aumento de la estabilidad de la enzima.
2.- La reutilización del catalizador (disminución de costos)
3.- Facilidad en la separación del producto.
4.- Posibilidad del desarrollo de un proceso catalítico en continuo

Los principales inconvenientes del Proceso de Inmovilización

1.- Puede haber una pérdida de actividad de la enzima durante la Inmovilización.

2.- La gran heterogeneidad del sistema enzima-soporte donde pueden existir
distintas fracciones de proteínas inmovilizadas con un diferente número de uniones
al soporte.
3.- El biocatalizador es más caro que la enzima nativa.

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6
 Efectos del proceso de inmovilización
sobre la Enzima

CONFORMACION CATÁLISIS

Estabilidad Actividad enzimática

estabilidad conformacional >rigidez
protección frente a las proteasas
evita la agregación intermolecular
alteración del microentorno del SA
disminución: difusional, estérica, y del
microentorno
pérdida total: si el sustrato no ingresa al
sitio activo, cambio conformacional, pasaje a
la forma inactiva y/o desnaturalización
aumento

Tipo de Catálisis: CATALISIS

HOMOGENEA ? CATALISIS
HETEROGENEA

HETEROGENIZACIÓN DE LA
CATÁLISIS HOMOGÉNEA 13

REQUISITOS PARA DESARROLLAR UN

BIOCATALIZADOR INMOVILIZADO

Evaluación preliminar

1- esquema de reacción

2- enzima

3- tipo de soporte

4- método empleado para la inmovilización

Preparación del biocatalizador inmovilizado (o derivado inmovilizado)

1- condiciones de reacción (que no alteren la inmovilización)
2- rendimiento de la inmovilización, eficiencia de transferencia de masa,
número de ciclos: PRODUCTIVIDAD 14

7
 EFECTOS DE LA INMOVILIZACIÓN SOBRE LA ENZIMA

Proteína unida

Actividad específica

Tiempo de incubación

Actividad enzimática inmov = Actividad enzimática E libre

<
Cantidad Enzima inmoviliza Cantidad de enzima Libre
>

= inmovilización eficiente
< inactivación de la enzima en el proceso de inmovilización
> la inmovilización “sobreactiva” a la enzima
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TIPOS DE INMOVILIZACIÓN

Atrapamiento Esferas de geles

en matrices
Retención Física
Micro-encapsulación
Inclusión en
Membranas Reactores de
Membranas

Adsorción
Unión a Soportes
Unión covalente
Unión Química
Reticulado o Cross-linking

16

8
 Retención Física
Atrapamiento en matrices

Inmovilización física por atrapamiento dentro de las cavidades

interiores de una matriz sólida porosa constituída generalmente por
prepolímeros entrecruzables (poliacrilamida, colágeno, alginato,
carraginato, resinas de poliuretano, etc.).

Solución de enzima
en polímero

Solución Solución de
de enzima monómero
Esfera
de gel

Polimerización ATRAPAMIENTO
(T°; qco).

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Retención Física
Inclusión en membranas

MICROENCAPSULACIÓN

 E rodeadas por membranas permeables a S y P, (pero no a la E).

 Las microcápsulas son esféricas, (de 1-100µm de diám.)
 Se pueden encapsular: enzimas, células biomoléculas, etc.

SUSTRATO

E
PRODUCTO

Micelas reversas

9
 Retención Física
Inclusión en membranas

REACTORES DE MEMBRANAS

E atrapadas en fibras huecas. Reactores de membrana

S
P
E P
P
E membrana
permeable al P
S E E
E E
E P
P

P
La E se encuentra en el interior La E está dentro de la
de la fibra membrana
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REACTOR DE FIBRA HUECA

20

10
 TIPOS DE INMOVILIZACIÓN

En geles
Atrapamiento
En fibras
en matrices
Retención Física
Micro-encapsulación
Inclusión en
Membranas Reactores de
Membranas

Adsorción
Unión a Soportes
Unión covalente
Unión Química
Reticulado o Cross-linking

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Unión Química
Unión a soportes

Naturales (arcillas, piedra pómez, bentoninas, silice, etc).

Soportes
Inorgánicos Manufacturados (óxidos de metales, vidrio de poro controlado,
alúmina, cerámicas, gel de silice, etc)

Polímeros Naturales:
Polisacáridos (celulosa almidón, dextranos, agar, alginatos
agarosa, quitina, chitosán, etc.),
Soporte Proteínas fibrosas (colágeno, queratina, etc.).
Orgánicos
Polímeros Sintéticos:
Poliolefinas (poliestireno).
Polímeros acrílicos (poliacrilatos, poliacrilamidas,
polimetacrilatos,...)
Otros (alcohol polivinílico, poliamidas, etc.)
22

11
 Unión Química
Unión a soportes

E E

E E

E E

Adsorción Unión
covalente

Los soportes se presentan en distintas formas:

 cilindros,
 hojas,
 fibras
 esferas. 23

Unión Química
Unión a soportes

Adsorción - INTERACCIONES IÓNICAS

- PUENTES HIDRÓGENO

Factores que influyen:

 pH del medio
 fuerza iónica μ  desorción
 diámetro del poro (≈ 2 veces díam. E)
 presencia de iones (cofactores)

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12
 Unión Química
Unión a soportes

Unión covalente
- Es la más importante para la industria.
- Requiere activación de grupos químicos del soporte para reacciones
con ciertos AA de las proteínas
- AA más importantes:
- Lisina
- Cisteína
- Tirosina
- Histidina
- Metionina
- Triptófano
- Arginina
- Ácidos Glutámico y Aspártico

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Unión Química
Unión a soportes

Unión covalente
ventajas
- preparación sencilla
- los derivados se utilizan en: reactores continuos, lechos fijos,
fluidizados y tanques agitados.
- Alta resistencia a la desactivación por T, solventes orgánicos o del pH

desventajas
- se necesita conocer la densidad de grupos activos/área.
- está condicionada por el n° de uniones E-soporte y por la geometría.
- En general los linkers son compuestos tóxicos
- no se aconseja para E sensibles al pH, μ, etc.
26

13
 Unión Química
Unión a soportes

Unión covalente, ejemplo

28

14
 29

Unión Química

Reticulado
- También se lo denomina: Entrecruzamiento o Cross-linking.
- Se utilizan reactivos bi o multi-funcionalizados que originan uniones
intermoleculares entre las moléculas de E.: uniones irreversibles.

REACTIVOS BI-FUNCIONALIZADOS:
E P DIALDEHÍDOS,
E DIIMINOESTERES,
E DIISOCIANATOS,
SALES DE BIDIAZONIO,
E P DIAMINAS
E E
Ej glutaraldehído
reticulado co-reticulado

 CLECs: Cristalización de la enzima + reticulado con glutaraldehído.

Soportan altas T° y son resistentes a proteasas. La propia E cristalizada
actúa como soporte, posee canales microscópicos 20-50Ǻ
30

15
 Reactores en Discontinuos

Tanque agitado con paletas Tanque agitado con deflectores

que incluyen la E inmovilizada que incluyen la E inmovilizada

Reactor de lecho «empaquetado» Reactor de lecho fluidificado

con reciclado con reciclado
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Reactores Continuos

Reactor de lecho Reactor de lecho Reactor de

«empaquetado» fluidificado fibra hueca

32

16
 OTRA CLASIFICACIÓN DE LA INMOVILIZACIÓN

Unión a Soportes: Unión covalente

IRREVERSIBLE
Reticulado o Cross-linking

Atrapamiento en matrices:
Micro encapsulación

Unión a Soportes: Adsorción

REVERSIBLE Inclusión en
Membranas

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APLICACIONES de la INMOVILIZACION
DE ENZIMAS

 Aplicaciones analíticas : Biosensores, Kits bioquímicos

 Aplicaciones industriales:

 Química,

 Alimenticia,

 Farmacéutica

 Tratamientos de residuos

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 Aplicaciones Industriales de la Inmovilización de E

INDUSTRIA FARMACÉUTICA:
• síntesis en pasos clave de la producción de moléculas lábiles
• obtención de antibióticos beta-lactámicos o fármacos ópticamente puros

INDUSTRIA ALIMENTICIA:
• reutilización en operaciones continuas, hidrólisis de proteínas e hidratos
de carbono
• mejoras organolépticas
• obtención de edulcorantes y aditivos alimentarios
ej: lipasas inmovilizadas (ind del chocolate)

INDUSTRIA QUÍMICA:
• síntesis de péptidos, fragancias, insecticidas, etc
• obtención de acrilamida

TRATAMIENTOS DE AGUAS RESIDUALES:

• conversión de nitritos a nitratos
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• degradación de benceno

INMOVILIZACIÓN DE CÉLULAS

• Puede ser PERMANENTE o TEMPORAL

• Presenta ventajas técnicas y económicas para el manejo de una alta  celular,
comparada con los procesos de fermentación tradicionales.
• Mejor control en procesos continuos de fermentación
• Recuperación de biomasa para reutilización

MÉTODOS DE INMOVILIZACIÓN DE CÉLULAS

• AUTO-FLOCULACIÓN
• ADSORCIÓN SOBRE SOPORTES
• ATRAPAMIENTO EN MATRICES SÓLIDAS

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 AUTO-FLOCULACIÓN

es un proceso que muchas cepas sufren en ciertas condiciones

del medio:
• pH,
• [Ca2+]
• T°
• Agitación

ADSORCION SOBRE SOPORTES

Adhesión de células (levaduras) a la superficie externa de un

soporte como :
Ejs: GLUTEN, DEAE-Celulosa.

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ATRAPAMIENTO

• Incorporación de células a matrices sólidas por atrapamiento en el

seno del material polimérico.
• El atrapamiento puede realizarse por :
 difusión de las células a la matriz sólida sintetizada previamente
 por la formación de las matrices alrededor de las células.

Ej: Inmovilización de levaduras en perlas de alginato y poliacrilamida:

• Producción del vino blanco
• Producción de etanol

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