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UNIVERSIDAD SAN IGNACIO DE LOYOLA

FACULTAD DE INGENIERÍA Y ARQUITECTURA


CARRERA DE INGENIERÍA AGROINDUSTRIAL Y AGRONEGOCIOS - INGENIERIA EN INDUSTRIAS
ALIMENTARIAS
CURSO: MICROBIOLOGÍA AGROALIMENTARIA

PRÁCTICA DE LABORATORIO N° 2

TRANSMISIÓN DE MICROORGANISMOS POR MANIPULACIÓN DE ALIMENTOS

I. INTRODUCCIÓN

El Staphylococcus aureus está presente en la piel y en la zona nasofaringea de humanos y animales.


Frecuentemente, S. aureus contaminara alimentos vía manipuladores de alimentos, pieles de animales, o
superficies sucias de contacto de alimentos. Este microorganismo no puede crecer a temperaturas de
refrigeración y es un pobre competidor con otra microflora alimentaria. El crecimiento de S. aureus ocurre
durante el abuso de temperaturas (en la zona de 4.4°C hasta 60°C) por tiempos prolongados. Este
microorganismo produce una enterotoxina estable al calor.

La manipulación incorrecta de los alimentos por parte del personal involucrado en la preparación de estos puede
ocasionar problemas serios de salud. Cuando alimentos susceptibles son producidos con números bajos de
estafilococos, se mantendrán libres de enterotoxinas y otros peligros relacionados a ETAs si se mantienen por
debajo de 5°C o por encima de 60°C hasta que sean consumidos. Los cinco factores que contribuyen más
frecuentemente a los brotes de ETA son:
a. Refrigeración inadecuada
b. Preparación de alimentos con demasiada anticipación
c. Personas infectadas que practican una pobre higiene personal
d. Cocción o procesamiento térmico inadecuado
e. Retención del alimento en equipo de calentamiento (mesas de vapor, etc.) a temperaturas de
crecimiento bacteriano.

Las fuentes de alimentos involucradas en brotes de gastroenteritis por estafilococos son cerdo y sus productos,
productos de pastelería, carne, pavo, pollo y huevos. Sin embargo, se han dado brotes en leche chocolatada. La
dosis infecciosa mínima en adultos esta dada por la presencia de 1x 10 6 ufc/g, lo cual corresponde a 1 g de
enterotoxinas consumidas en el alimento. En niños la dosis mínima es menor: 0.2 g de enterotoxinas

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consumidas en el alimento. Es importante recordar que la enterotoxina estafilococica (SE) es más estable y
resistente al calor que las células de S. aureus. Entonces, niveles bajos de S. aureus no siempre son indicativos
de la presencia de SE en el alimento.

El objetivo de esta práctica es demostrar y cuantificar la contaminación de los alimentos por manipulación y
contaminación cruzada.

II. MATERIALES Y MÉTODOS

Materiales:
 Pechugas de pollo cortados en cuartos  Placas Petri con agar Manitol salado
 Hojas de lechuga lavadas y secas  Frascos y tubos de ensayo estériles
 Guantes de plástico desechables  Agua peptonada estéril
 Tubos con S. aureus en caldo nutritivo  Cuchillos
 Incubadora  Espátulas de Drigalsky
 Pipetas estériles
 Agar Manitol salado. Es un medio selectivo para estafilococos. La alta concentración de sal (7.5%) inhibe el
crecimiento de la mayoria de los microorganismos. El único carbohidrato fermentable es el manitol. Sobre
este medio, S. aureus aparece como una colonia amarilla, mientras que S. epidermidis manitol-negativo no
patogeno aparecera como una colonia roja.
 Caldo Nutritivo
 Plasma coagulasa con EDTA. EDTA es un anticoagulante. El plasma reconstituido se usa para determinar si
una especie estafilococica tiene la habilidad para producir la enzima coagulasa, que causara coagulación
del plasma de conejo. Un resultado de coagulasa positivo indica que la muestra
contiene Staphylococcus aureus

Metodología:
Primero, lavarse las manos, desinfectar el área de trabajo y ponerse los guantes. Además recuerde
que trabajará con una bacteria patógena por lo que debe extremar los cuidados antes y
después de la práctica.

1. Tomar 1 ml del cultivo puro de S. aureus, agregar a 9 ml de agua peptonada, y hacer las diluciones
correspondientes a la Figura 6.1. (esta será la dilución inicial 1/10). Sembrar en agar Manitol utilizando una
espátula de Drigalsky para luego cuantificar el microorganismo. Este es el control.
2. Tomar 1 ml de S. aureus en caldo nutritivo y verter sobre el trozo de pollo crudo (sin salpicar). Dejar reposar
x 15 minutos.

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3. Con una mano enguantada sujetar el pollo y con la otra mano cortar el pollo en tiras con un cuchillo limpio.
Enseguida, tomar el guante (que estuvo en contacto con el pollo), voltear por el revés, agregar 10 ml de
agua peptonada a su interior. Con mucho cuidado, pipetear 1 ml en un tubo con 9 ml de agua peptonada.
Y continuar con el esquema de dilución de la Figura 6.1. Sembrar sobre agar manitol con una espátula de
Drigalsky para observar si hubo o no transmisión del microorganismo a la mano y enumerar las colonias.
4. Después de cortar el pollo, tomar una hoja de lechuga con un guante limpio y cortarla en tiras con un
cuchillo limpio, sobre la tabla donde se corto el pollo crudo. Tomar la hoja de lechuga cortada, ponerla
dentro de un frasco estéril. Agregar 10 ml de agua peptonada y llevar al vórtex para mezclar (desprender
los microorganismos adheridos a los trozos de lechuga). Con mucho cuidado, pipetear 1 ml en un tubo con
9 ml de agua peptonada. Y continuar con el esquema de dilución de la Figura 6.1.
5. Luego, tomar 0.1 ml y verter sobre la superficie del agar Manitol esparciéndolo con una espátula de
Drigalsky para observar si hubo o no transmisión del microorganismo de la tabla a la lechuga.
6. Incubar las placas a 37°C x 24 horas. Observar y cuantificar el número de colonias de S. aureus en las
placas (control, guantes, lechuga).

Figura 6.1. Esquema de dilución

1 ml 1 ml 1 ml 1 ml

Vol (ml) 9 9 9 9
Dilución 1/10 1/10 1/10 1/10
Dilución Total 10-1 10-2 10-3 10-4

0.1 ml 0.1 0.1 0.1 ml


ml ml
Dilución
10-2 10-3 10-4 10-5
en placa

III. RESULTADOS Y DISCUSIÓN

1. Observe las placas. Cuente las colonias amarillas sobre agar manitol y calcule “S. aureus presuntivo ufc/g”.

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2. Para confirmación, escoja dos colonias representativas. Usando un asa de Kolle flameada transfiera cada
colonia en un tubo de caldo nutritivo (1 colonia por tubo). Incube a 37°C x 24 a 28 h.

Prueba de la Coagulasa para confirmar presencia de S. aureus


1. Agregar 0.2 ml de un cultivo de 24-28 h a 0.5 ml de plasma coagulasa con EDTA en tubos de 10 x 75 mm.
2. Incubar en baño María a 37°C, y examinar periódicamente para la formación de coagulos. S. aureus
coagulara el plasma en 4 horas.
3. Cuando las colonias representativas son coagulasa positivas, se confirma la presencia de S. aureus.

Conteo S. aureus presuntivo


Dilución en placa UFC/placa UFC/placa Promedio
10-2
10-3
10-4
10-5
ufc/g =

1. Reúna los datos de todas las muestras tomadas y prepare el informe correspondiente.
2. Hay un reporte de un brote de ETA for consumo de queso Cheddar. Las victimas tienen los síntomas clásicos
de envenenamiento estafilococico. Los síntomas incluyen vómitos y diarrea sin fiebre dentro de las 4 horas
siguientes a la ingestión del queso. Los síntomas solo duran un tiempo corto (8 a 12 h). Como buen
microbiologo de alimentos, Ud. plaquea el producto y encuentra que no hay S. aureus detectables. Como
podría Ud. confirmar o eliminar SEs como la causa de este brote?
3. ¿Cuáles son las características de crecimiento de S. aureus? (en función de los factores extrínsecos
importantes para el crecimiento microbiano)
4. ¿Habría diferencia en la transmisión de este microorganismo si no se utilizaran guantes? ¿Por que?
Explique.
5. ¿Por qué es importante entrenar al personal de la industria alimentaria en Buenas Prácticas de Higiene?

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