TUGAS REVIEW JURNAL

KULTUR JARINGAN

“MOLECULAR CLONING, EXPRESSION AND CHARACTERIZATION

OF POXA1B GENE FROM PLEUROTUS OSTREATUS “

Diajukan sebagai salah satu syarat memenuhi tugas final mata kuliah

Kultur Jaringan

OLEH:

NAMA : EKA WIDIANTI SAPUTRI

NIM : O1A114097

JURUSAN FARMASI

FAKULTAS FARMASI

UNIVERSITAS HALU OLEO

KENDARI

2018
 Judul Molecular cloning, expression and
characterization of poxa1b gene
from Pleurotus ostreatus
Jurnal / Artikel An International Journal On Molecular
and Cellular Biology (Molecular
Biology Reports) / Original Article
Tanggal dan Tahun Terbit 17 Desember 2018

Penerbit Springer

Penulis Mahnaz Mohtashami, Jamshid Fooladi,

Aliakbar Haddad‑Mashadrizeh,
Mohammadreza Housaindokht.

PENDAHULUAN

Dalam beberapa dekade terakhir, lakase jamur (p-difenol-dioksigen

oksidoreduktase; EC 1.10.3.2) telah menarik perhatian para peneliti karena
beragamnya aplikasi bioteknologi dan industri. Dalam penelitian ini, telah
dilakukan proses mengkloning gen pengkodean lakase (poxa1b) dari Pleurotus
ostreatus dan kemudian diekspresikan secara heterologis dalam Escherichia coli
BL21. Lakase merupakan enzim ekstraseluler yang mengkatalisasi oksidasi dari
berbagai substrat organik dan anorganik dengan menggabungkan pengurangan O2
menjadi H2O. Lakase diproduksi melalui berbagai organisme seperti bakteri,
tanaman tingkat tinggi, serangga, dan jamur.
Jamur adalah pusat perhatian banyak peneliti dalam beberapa dekade
terakhir karena sifat-sifat tertentu seperti potensi rodex yang tinggi dan mereka
menunjukkan stabilitas yang ditingkatkan untuk aplikasi dalam kondisi yang keras
dari bidang industri. Pleurotus ostreatus (P. ostreatus), basidiomycete, telah
dianggap sebagai sumber potensial enzim lakase selama dekade terakhir. P.
ostreatus mengeluarkan isoenzim lakase ekstraseluler yang berbeda seperti fenol
oksidase A1b (POXA1b), POXA2, dan POXC. POXA1b adalah enzim lakase
yang berpotensial redoks tinggi (+ 0,650 V) yang menunjukkan potensi luar biasa
untuk aplikasi industri.
Ada berbagai macam inang untuk produksi protein jamur yang heterogen.
Escherichia coli (E. coli) adalah salah satu sistem ekspresi protein yang sangat
baik dan paling menguntungkan untuk produksi protein heterolog karena sifat
yang diinginkan, termasuk pertumbuhan yang cepat, ekspresi yang cepat,
kemudahan kultur dan hasil produksi yang tinggi. Optimasi kodon diperlukan
untuk meningkatkan produksi protein eukariota dalam sistem ekspresi E. Coli.
Optimalisasi Codon dilakukan oleh dua strategi alternatif, termasuk
memperkenalkan tRNA pengkodean plasmid yang langka pada E. coli atau
mengubah kodon langka pada gen target sesuai dengan karakteristik preferensi
kodon dari E. coli tanpa perubahan dalam urutan asam amino dari protein target.
Tujuan dari penelitian ini adalah untuk mengkloning dan mengekspresikan
gen poxa1b enzim lakase dari P. ostreatus di E. coli mengikuti optimasi kodon.
Selain itu, aktivitas dan stabilitas POXA1b rekombinan di bawah kondisi pH dan
suhu yang berbeda dievaluasi dan kemampuannya untuk oksidasi benzo [a]
pyrene (BaP) ditentukan.

MEDIA

Media yang digunakan dalam proses kloning, sebagai berikut :

 Sel kompeten E. coli DH5a dan sel kompeten E. coli BL21 (DE3) digunakan
sebagai inang untuk kloning dan ekspresi protein. Strain E. coli DH5a dan
BL21 (DE3) dikultur dalam medium agar Luria-Bertani (LB) (10 g / l tryptone
bacto, 10 g / l NaCl, 5 g / l ekstrak ragi). Media selektif ditambah dengan 100
μg / ml ampisilin.
 Plasmid PET-22b (+) digunakan sebagai vektor untuk kloning dan ekspresi
poxa1b.

METODE

Strategi optimasi kodon yang digunakan dalam penelitian ini disebut

sebagai 'satu asam amino-satu kodon'. Dalam metode ini, kodon yang paling
disukai dari sistem ekspresi E. coli untuk asam amino yang diberikan digunakan
dalam urutan target.
Penelitian ini menggunakan suatu aplikasi server web untuk
mempermudah dalam pengerjaan metode di atas. Beberapa server web yang
digunakan ialah :
 GeneBank (GenBank AJ005018)
Digunakan untuk mengetahui Urutan kode genetika dari P. Ostreatus.
 (http: //www.genom s.uvr.es)
Digunakan untuk deteksi kodon yang langka.
 (http: //www.facul ty.ucr.edu)
Digunakan untuk optimasi urutan gen.
 (http: //www.genes cript .com)
Diterapkan untuk menganalisis urutan yang dirancang oleh Codon Adaptation
Index (CAI).
Berikut langkah dalam melakukan kloning poxa1b dari P. Ostreatus :
1. Kloning dan Ekspresi Gen poxa1b
Urutan kodon dioptimalkan poxa1b dengan gen asli (1647-bp) disintesis
oleh Green Biosystems Company dan dikloning dalam vektor Pet-22b (+).
Fragmen yang diharapkan dikonfirmasi menggunakan pencernaan oleh enzim
restriksi XhoI dan XbaI dan elektroforesis gel agarosa. POX1Ab / Pet-22b (+)
berubah menjadi sel kompeten E. coli DH5α melalui metode heat shock.
Komponen sel terutama diperoleh dengan metode kompeten sel E. coli Kalsium.
Media LB yang mengandung 100 μg / ml ampisilin digunakan untuk memilih titik
dua yang diinginkan. Isolasi plasmid dilakukan oleh kit ekstraksi plasmid
(Thermo Fisher Scientific).
Rekombinan Pet / poxa1b diubah menjadi sel kompeten E. coli BL21
(DE3) untuk kelebihan protein. Strain E. coli BL21 ditumbuhkan dalam medium
LB ditambah 2 mg / ml ampisilin dan diinkubasi pada suhu 37 ° C selama 18 jam
dengan getaran 250 rpm. Pada kultur kaldu OD600 dari 0,4-0,7 ekspresi protein
rekombinan diinduksi dengan melengkapi dengan 1 mM isopropil-β-d-
1thiogalactopyranoside (IPTG) dan 0,25 mM CuSo4. Sel-sel diinkubasi dalam
inkubator pengocok (200 rpm) pada 30 ° C selama 12 jam. Selain itu, untuk
menyelidiki kondisi optimal ekspresi POXA1b dalam E. coli BL21 (DE3), proses
ekspresi dilakukan di bawah kondisi budidaya yang berbeda seperti konsentrasi
IPTG yang berbeda (0,5-2,5 mM), waktu induksi (2–12 jam) dan suhu (20–45 °
C). Sel dikumpulkan dengan sentrifugasi dan kemudian disuspensi kembali dalam
buffer resuspensi sel (pH 7,9) yang mengandung 500 mM NaCl, 20 mM Tris-HCl,
5 mM Imidazole. Setelah sonikasi, ekstrak sel diproses untuk digunakan dalam
elektroforesis gel natrium dodesil sulfat-poliakrilamida (SDS-PAGE) dan
aktivitas analitik lak.
2. Analisis Elektroforesis
SDS-PAGE digunakan untuk mengkonfirmasi proses ekspresi protein
rekombinan dan untuk menentukan berat molekul enzim lakase dalam sampel asli
yang dioptimalkan dengan kodon asli. SDS-PAGE dilakukan dalam gel poliakril
amida 12% dan protein divisualisasikan dengan pewarnaan gel dengan warna biru
cemerlang Coomassie. Berat molekul lakase yang diekspresikan diperkirakan oleh
penanda berat molekul standar (10–250 kDa, Bio-Rad).
3. Pengujian Enzim Lakase
Total kandungan Protein dalam ekstrak sel dari sampel yang dioptimasi
kodon dan sampel asli diukur menggunakan uji Bradford berdasarkan kurva
standar albumin serum sapi. Aktivitas enzim dalam ekstrak sel diuji dengan
mengukur oksidasi ABTS pada 25 ° C. Tingkat oksidasi ABTS ditentukan dengan
memantau peningkatan A420 (ε 420 = 3600 LM − 1 cm− 1). Campuran reaksi
mengandung 1 mM ABTS, 0,1 M natrium asetat buffer (pH 5), 100 μl supernatan
kultur dan diinkubasi selama 10 menit. Nilai absorbansi sampel dibaca
menggunakan pembaca plat spektrofotometri pada 420 nm terhadap kosong yang
memuaskan. Satu unit aktivitas enzim lakase dinyatakan sebagai jumlah enzim
yang mengoksidasi 1 μmol ABTS per menit dan ditentukan setelah waktu uji 2
menit menggunakan rumus ini [32]: A (UL − 1) = EVt ∕ 0,036Vs . Dalam
persamaan ini U adalah aktivitas enzim, ∆E adalah peningkatan dalam absorbansi
per menit, Vt adalah volume total kuvet (ml), dan Vs adalah volume sampel
dalam kuvet (ml).
4. Oksidasi Hidrokarbon Aromatik Polisiklik (PAH) Oleh POXA1b
Rekombinan
BaP sebagai substrat khas lakase diuji untuk mengevaluasi oksidasi PAH
dengan POXA1b yang dioptimalkan dengan kodon dalam kondisi berikut seperti
(1) POXA1b denaturasi panas (dididihkan pada 100 ° C selama 20 menit), dan
BaP sebagai sampel kontrol, (2) POXA1b dan BaP, dan (3) POXA1b, BaP dan
ABTS. Semua percobaan dilakukan dalam tabung 40 ml yang berisi volume
reaksi 5 ml dengan POXA1b disesuaikan dengan 4 U / ml dengan pengenceran
dengan buffer Na-asetat (pH 4,5). BaP dilarutkan dalam aseton untuk memberikan
konsentrasi 10 mM dan 35 μl ditambahkan ke campuran reaksi ke konsentrasi
akhir 70 μM. Ketersediaan hayati PAH meningkat dengan menambahkan tween-
80 ke semua tabung ke konsentrasi akhir 1%. ABTS ditambahkan ke satu
percobaan pada konsentrasi akhir 1 mM untuk menentukan pengaruh itu pada
oksidasi BaP. Setelah inkubasi selama 24 jam pada 30 ° C, semua percobaan
disentrifugasi pada 13.000 × g selama 10 menit dan supernatan kemudian
dianalisis dengan kromatografi cair kinerja tinggi (HPLC). Sistem HPLC (Knauer,
Bad Homburg, Jerman) yang dilengkapi dengan detektor absorbansi λ ganda dan
kolom Supercosil LC-PAH (5 µm, 25.0 cm × 4.6 mm ID) diaplikasikan untuk
memisahkan Bap. Analisis dilakukan dengan menggunakan 40 menit yang
diprogram dalam mode gradien asetonitril / air (0–5 menit 40: 60%, ramp 5–30
menit ke 0: 100% dan 30–40 menit ditahan pada 0: 100%) pada laju aliran 1,5 ml
/ menit. Panjang gelombang yang digunakan untuk menentukan konsentrasi BaP
adalah 254 nm. Persentase BaP teroksidasi dihitung dari area di bawah puncak
absorbansi menggunakan rumus ini: [34] [(Ci - Cf) / Cf] × 100. Dalam persamaan
ini Ci dan Cf adalah konsentrasi BaP dalam percobaan dan kontrol masing-masing
. Semua percobaan termasuk kontrol dilakukan dalam rangkap tiga.
5. Pengujian pH dan Stabilitas Termal Aktivitas Lakase
Pengaruh suhu pada aktivitas lakase yang dioptimalkan dengan kodon dan
stabilitas termal diperiksa pada berbagai suhu inkubasi (25, 30, 35, 40, 45, 50, 55,
60 dan 65°C) pada pH 4 untuk 0,5, 2 dan 10 jam. Aktivitas lakase sebagai fungsi
pH dan stabilitas pH ditentukan pada kisaran pH 3-10 (3–7, buffer sitrat fosfat; 8,
buffer fosfat; 9, buffer bikarbonat) pada 25°C untuk 0,5, 2, dan 10 jam. Setelah
inkubasi supernatan kultur 100 μl yang mengandung enzim yang dioptimalkan
dengan kodon dalam kondisi yang ditunjukkan, aktivitas enzim diukur dengan
adanya ABTS (1 mM) dalam waktu 10 menit.
6. Analisis Analitik
Dalam penelitian ini, semua percobaan dilakukan dalam rangkap tiga dan
disajikan sebagai mean ± SD. Analisis varian diikuti oleh tes post-hoc Tukey.
Menggunakan perangkat lunak SPSS (versi 18.0). p <0,05 analisis statistik
dianggap signifikan.

PEMBAHASAN

Beberapa sifat seperti potensi redoks yang tinggi, stabilitas dalam kisaran
pH dan suhu yang luas dan hasil produksi yang tinggi pada ekspresi heterolog
telah membujuk para peneliti untuk menggunakan lakase jamur, seperti POXA1b
dari P. ostreatus untuk aplikasi bioteknologi dan industri. Untuk mencapai hasil
maksimal optimalisasi protein rekombinan kodon langka pada E. coli diperlukan
sistem ekspresi. Dalam hal ini, gen poxa1b dari P. ostreatus dioptimalkan sesuai
dengan karakteristik preferensi kodon dari E. coli tanpa perubahan dalam urutan
asam amino dan ini diekspresikan dalam E. coli secara heterologis. Efek dari
kondisi seperti konsentrasi IPTG, suhu dan waktu induksi juga dievaluasi dalam
ekspresi enzim. Setelah fase ekspresi, sifat biokimia termasuk massa molekul,
aktivitas enzimatik, aktivitas tergantung pada pH dan suhu dipelajari. Kami juga
menyelidiki oksidasi PAH dengan menyatakan POXA1b. Hasil SDS-PAGE
menunjukkan bahwa POXA1b yang di-codonoptimized dari P. ostreatus memiliki
struktur monomer dalam media dan berat molekulnya adalah 57 kDa.

KESIMPULAN

Dalam penelitian ini, kami telah berhasil mengkloning dan

mengekspresikan gen poxa1b dari P. ostreatus di E. coli setelah optimasi kodon.
Hasil ekspresi dan efisiensi aktivitas enzim sangat tinggi pada enzim yang
dioptimalkan kodon dibandingkan dengan bentuk asli. Sifat biokimia dari
POXA1b yang dioptimalkan dengan kodon dikarakterisasi dan menemukan
bahwa mereka stabil pada kisaran suhu 25 hingga 45 ° C serta kisaran pH 2,5
hingga 4,5 untuk inkubasi 2 jam. Kami juga memperhatikan bahwa POXA1b
codonoptimized secara signifikan mengoksidasi BaP di hadapan ABTS. Penelitian
ini adalah laporan pertama tentang keberhasilan produksi rekombinan POXA1b
dengan fitur unik menggunakan optimasi kodon dalam E. coli bahwa ini
merupakan peluang untuk produksi enzim dalam skala besar.