L-asparaginasa: un biocatalizador prometedor para aplicaciones industriales y

clínicas
RESUMEN

La L-asparaginasa es una enzima versátil con aplicación en alimentos y terapéuticas y en constante búsqueda de una
fuente microbiana confiable para la producción comercial. La revisión es una ayuda para comprender los hitos clave de la
L-asparaginasa desde su descubrimiento, sus fuentes potenciales, estrategias de producción económicas utilizando
sustratos alternativos disponibles a bajo costo, su purificación y procedimientos posteriores informados hasta el
momento, su caracterización y la relevancia de su aplicación en Industria alimentaria y terapéutica con una perspectiva
clínica añadida.

1. INTRODUCCIÓN así un producto intermedio betaacil-enzima. En el

El descubrimiento fortuito de la L-asparaginasa se
informó por primera vez como la actividad antitumoral
del suero de cobaya contra dos cepas de linfoma murino
y una cepa de linfosarcoma en ratas (Kidd, 1953). Sin
embargo, Broome (1963) informó posteriormente que la
citotoxicidad del suero de cobaya se debía a la presencia
de altas concentraciones de L-asparaginasa en los sueros
de cobayas y otros miembros de especies similares. El
principio involucrado en la actividad citotóxica de la
enzima se basó en el hecho de que las células leucémicas
no pueden sintetizar la L-asparagina requerida para la
síntesis de proteínas y, posteriormente, deben depender
de un suministro externo disponible en el plasma y los
tejidos. La administración de la enzima, L-asparaginasa,
quita esta fuente libre de asparagina, muere de hambre y
destruye ciertas células cancerosas. La L-asparaginasa
también se usó para el tratamiento de tumores sólidos
junto con los cánceres del sistema linfático en niños, y la
eficacia del tratamiento fue informada por Tallal et al.
(1970). La enzima se revisó a principios de 1973
(McCredie et al., 1973), por su farmacología, toxicidad y
el mecanismo de resistencia a la L-asparaginasa que
implicaba el aclaramiento inmunológico. Desde su
descubrimiento, la L-asparaginasa continúa siendo una
búsqueda constante para los investigadores que
exploraron las fuentes microbianas que utilizaron
materiales más baratos o fácilmente disponibles para
producir la enzima con relativa facilidad en su
purificación. En los últimos años, se ha explorado la
eficacia terapéutica estable y mejorada, como se analiza
en esta revisión.
2. L-ASPARAGINASA- MECANISMO DE ACCIÓN.
El mecanismo del proceso de hidrólisis de la L-
asparagina por asparaginasa se produce en dos pasos a
través de una enzima beta-acilo intermedia (Fig. 1). En el
primer paso, el residuo nucleofílico de la enzima se
activa por una base fuerte (NH2) y, por lo tanto, ataca el
átomo de carbono amida de la L-asparagina, generando
siguiente paso, actúa sobre el carbono éster (R-C˭O)
producido por un nucleófilo activado por una molécula
de agua, que finalmente proporciona el producto ácido L-
aspártico, con liberación de amoníaco. Otras reacciones
de hidrólisis catalizadas por la L-asparaginasa son la
hidrólisis de la L-glutamina y el péptido β-aspartil amida;
sin embargo, el rendimiento de la reacción es muy bajo
(Cachumba et al., 2016).
3. FUENTES DE L-ASPARAGINASA
Se ha informado que la L-asparaginasa es producida por
varias plantas, mamíferos y microbios. La Tabla 1
enumera una gran cantidad de microbios que producen
L-asparaginasa. (Peterson y Ciegler, 1969) examinaron
más de 123 especies bacterianas para la producción de
L-asparaginasa y reportaron su actividad enzimática.
Entre estas bacterias, Erwinia aroideae NRRL B-138
proporcionó los rendimientos más altos. Desde entonces,
se informó que la L-asparaginasa es producida por
muchas bacterias diferentes, incluyendo Proteus vulgaris
(Tosa et al., 1971), Pseudomonas aeruginosa (El-
Bessoumy et al., 2004), E.coli (Ghasemi et al., 2008 ),
Streptomyces gulbargensis (Amena et al., 2010) etc.
Además, muchas enzimas bacterianas de importancia
comercial son ampliamente preferidas y exploradas por
las propiedades versátiles de mayor tolerancia a la
temperatura y el pH atribuido a los hábitats extremos
que habitan estas bacterias (Herbert, 1992). Muchos de
estos hábitats que son prospectados para bacterias que
producen L-asparaginasa incluyen, bacterias luminosas
marinas (Ramaiah y Chandramohan, 1992) donde los
autores informaron que aunque la producción de la
enzima L-asparaginasa no es uniforme entre la cepa de la
especie Vibrio examinada por ellos, y que no se informó
que ninguno de los Photobacterium phosphoreum
produjeran L-asparaginasa antes de este informe, y
también informan que, comparativamente, la enzima
secretada por los procariotas luminosos fue mayor que
la reportada para otras especies bacterianas.
 Fig. 1. Mecanismo de acción de la L-asparaginasa

Shome y Shome informaron a los productores de L- para explorar un potencial ilimitado para los
asparaginasa de los manglares de las islas Andamán en productores de L-asparaginasa (Izadpanah et al., 2018).
(2001), y entre los aislamientos, 87.9% y 33.3% fueron
capaces de crecer a pH 10 y 12 respectivamente y se 4. DETECCIÓN DE L-ASPARAGINASA
informó que el 6.6% era termotolerante, lo que produce
La detección de bacterias productoras de L-asparaginasa
Los candidatos ideales para ser aprovechados para la
ha sido prospectada por muchos métodos. La actividad
producción industrial de L-asparaginasa, que requiere la
de la L-asparaginasa se acompaña de un aumento del pH
estabilidad del producto en condiciones de producción
debido a la liberación de amoníaco. Esta propiedad se
de pH y temperatura altas (Shome y Shome, 2001). Los
usó y exploró al idear una técnica de detección rápida de
informes de actinomicetos marinos hiperproductivos
placas utilizando un medio incorporado con indicador de
capaces de una mayor actividad de la L-asparaginasa
pH que contiene L-asparagina como única fuente de
incluso cuando se utiliza un sustrato barato de bajo costo
nitrógeno (Gulati et al., 1997). El indicador de rojo fenol
como la harina de soya son notables en este contexto
que es amarillo en condiciones ácidas se vuelve rosa en
(Basha et al., 2009), Otro tipo de extremófilos, los
condiciones alcalinas debido a un aumento en el pH.
halófilos o la sal Los organismos que aman a menudo
Recientemente (Mahajan et al., 2013) informaron sobre
habitan en ambientes hipersalinos que poseen la
un método mejorado para la detección de
capacidad de equilibrar la presión osmótica del ambiente
microorganismos que producen L-asparaginasa
hostil y, por lo tanto, resisten los efectos
extracelular en donde el azul de bromotimol (BTB) se
desnaturalizantes de las sales. Bacillus sp. Las bacterias
incorpora como indicador de pH en un medio que
halófilas BCCS 034 aisladas de Maharloo Salt Lake
contiene Lasparagine en lugar de rojo de fenol. Además,
mostraron una atractiva perspectiva para ser
BTB da un color verde transitorio a pH neutro, 7.0 y
aprovechadas para la producción comercial de L-
color azul oscuro a pH más alto 8.0–9.0, lo que indica la
asparaginasa (Ebrahiminezhad et al., 2011).
potencia del microorganismo para la producción de
Aparte de la aplicación clínica, la L-asparaginasa es Lasparaginase.
comercialmente importante en la industria alimentaria.
El ensayo cuantitativo de L-asparaginasa implica la
La necesidad de la termoestabilidad de la L-asparaginasa
detección de amoníaco liberado que se libera durante la
utilizada en altas temperaturas de procesamiento de
reacción catalizada por Lasparaginasa en su sustrato
alimentos para prevenir la formación de acrilamida es un
natural L-asparagina. Brevemente, este método de
requisito que no puede ser subestimado. La L-
nesslerización implica que la fuente de la enzima
asparaginasa producida por la cepa hswx88 de Bacillus
(sobrenadante crudo si el lisado extracelular o celular si
subtilis, aislada de la fuente Taptapani de Odisha, India,
es intracelular) se incuba con el sustrato durante 10
definitivamente es un potente candidato para tal
minutos, el amoníaco liberado se prueba mediante la
aplicación (Pradhan et al., 2013), etc. Por lo tanto, se
adición de reactivo de Nessler en la mezcla de sustrato
puede prever que ubicaciones geográficas de las cuales
de enzima diluida. La formación de coloración debida a la
Los productores de asparaginasa que están aislados
presencia de amoníaco se usa de forma cualitativa y
juegan un papel importante en la estabilidad, a pesar de
cuantitativa para determinar la actividad enzimática
las diferentes condiciones y propiedades de las L-
(Mashburn y Wriston, 1964). Una unidad de actividad
asparaginasas. Entre los otros hábitats, los microbios
enzimática se define como la cantidad de enzima que
marinos siguen siendo una perspectiva muy atractiva
produce 1 μmol de amoníaco por minuto a pH 8,6 y 37 °
C. Otros métodos de detección incluyen ensayos
continuos de L-asparaginasa mediante su acoplamiento
con la reacción glutámica deshidrogenasa y mediante un
electrodo de vidrio catiónico (Ferguson y Phillips, 1974).
La Tabla 2 enumera parte de la actividad significativa de
la L-asparaginasa de varios organismos.
5. CARBONO - METABOLISMO DEL NITRÓGENO DE LA
L-ASPARAGINASA EN MICROORGANISMOS.
Como se informó anteriormente, varios
microorganismos se presentan como productores de
Lasparaginasa; sin embargo, las bacterias E. coli y E.
chrysanthemi son los principales agentes microbianos
actuales para la producción a escala industrial en el área
farmacéutica, mientras que la L-asparaginasa del hongo
Aspergillus oryzae es la más utilizada en la industria
alimentaria. Para la producción de Lasparaginasa a gran
escala, muchos factores se consideran para optimizar un
proceso con mayor rendimiento y viabilidad económica.
Los factores como el tipo y la concentración de las
fuentes de carbono y nitrógeno, pH, aireación,
temperatura, tiempo de fermentación, tienen una gran
influencia en el proceso. Se han explorado diferentes
tipos de medios de cultivo para la producción de L-
asparaginasa. Sin embargo, la fuente de carbono y la
fuente de nitrógeno son los componentes que más
influyen, ya que la enzima que es una hidrolasa de
aminoácidos es inducida por el contenido de
aminoácidos en el medio de producción. Por ejemplo,
varios estudios han demostrado que los mejores
inductores para mayores rendimientos de L-
asparaginasa son L-asparagina, L-glutamina y L-prolina,
y la fuente de carbono más común es la glucosa, además
de otras fuentes nativas como el almidón y maltosa
(Baskar y Renganathan, 2009; Tippani y Sivadevuni,
2012), y la importancia de dichos componentes del
medio son revisados por Cachumba et al.
6. MEDIOS DE FERMENTACIÓN PARA LA
PRODUCCIÓN DE L-ASPARAGINASA POR BACTERIAS.
Con un conocimiento profundo de las fuentes de carbono
y nitrógeno requeridas para la producción de L-
asparaginasa, es imperativo diseñar un medio de
producción que pueda tener un balance de todos los
Tabla 1. Lista de diferentes fuentes microbianas de L-asparaginasa.
factores críticos como los nutrientes, la aireación, la
temperatura y el pH. Las condiciones de fermentación
varían de un organismo a otro para la producción de L-
asparaginasa, y puede producirse de forma constitutiva
(Mesas et al., 1990) o después de la inducción utilizando
un sustrato o condiciones adecuadas. La cinética de la
fermentación para la producción de L-asparaginasa ha
sido una parte esencial del estudio donde los factores y
parámetros limitantes de la velocidad se optimizan para
obtener una producción continua de la enzima. Este
estudio se ha realizado desde las últimas tres décadas
para organismos como Erwinia sp. (Deokar et al., 2010;
Liu y Zajic, 1973)
La elección del método que se utilizará para la
fermentación bacteriana, por estado sólido (SSF) o por
tipo sumergido (SmF), depende de la capacidad del
microorganismo para utilizar el sustrato directamente
en estado sólido o de si el sustrato se puede tratar
previamente y Proporcionado a los microbios en forma
fácilmente accesible respectivamente. Sin embargo,
algunos actinomicetos marinos han sido reportados
tanto para SmF como para SSF para la producción de L-
asparaginasa por Basha et al. (2009).
Las fermentaciones sumergidas sufren las desventajas de
producir un rendimiento menor, mientras que las SSF
son más rentables. Sin embargo, el uso de nutrientes de
desperdicio más baratos en fermentaciones sumergidas
puede ayudar a mejorar la rentabilidad. Un ejemplo de
tal estudio de fermentación sumergida es cuando el
extracto de pastel de cacahuete se optimizó para la
producción de L-asparaginasa por Streptomyces
gulbargensis (Amena et al., 2010). Se ha reportado
fermentación en estado sólido para organismos como
Serratia marcescens (NCIM 2919) mientras se usa la
torta de aceite de coco (Ghosh et al., 2013) y Bacillus
subtillis mientras se usa la mazorca de maíz (Makky et
al., 2014). La fermentación en estado sólido (SSF) y la
fermentación sumergida (SmF) se reportan para
diferentes organismos por Batool et al. (2016).
De este modo, el uso de diferentes sustratos para la
producción de L-asparaginasa determina el tipo de
condiciones de fermentación.
7. UTILIZACIÓN DE RESIDUOS PARA LA PRODUCCIÓN
RENTABLE DE L-ASPARAGINASA
En India, aproximadamente 960 millones de toneladas
de desechos sólidos se generan anualmente como
subproductos durante procesos industriales, agrícolas y
otros. De los cuales, alrededor de 350 millones de
toneladas son desechos orgánicos de origen agrícola;
290 millones de toneladas son residuos inorgánicos de
los sectores industriales y mineros y casi 4,5 millones de
toneladas son de naturaleza peligrosa (Pappu et al.,
2007). En 2017, Kumar et al. Informaron sobre un
seminario internacional sobre 'Gestión sostenible de
residuos sólidos para ciudades: oportunidades en países
de la Asociación de Asia Meridional para la Cooperación
Regional (SAARC)' organizado por el Consejo de
Investigación Científica e Industrial-Instituto Nacional de
Investigación de Ingeniería Ambiental y la Royal Society,
donde la prioridad era cambiar de la dependencia de los
vertederos que no ofrecen protección ambiental a la
gestión de desechos.
El uso de desechos disponibles a bajo costo como fuentes
de nutrientes en el medio de producción para las
bacterias puede ser otro método de producción rentable
de L-asparaginasa. Diferentes tipos de desechos
industriales y agroalimentarios pueden servir a este
propósito al ser el sustrato nutricional para la
fermentación bacteriana, así como a la remediación de
Tabla 2 Lista de microorganismos que producen L-asparaginasa y su rendimiento (Cachumba et al., 2016).
Tabla 3. Producción de L-asparaginasa utilizando materiales de desecho.
los desechos, resolviendo así los problemas asociados
con su eliminación. La actividad de la L-asparaginasa
también se informa en el suelo de arroz sumergido
modificado con compost de desechos sólidos
municipales y estiércol de vaca descompuesto, lo que
sugiere que los desechos pueden tener una profunda
influencia en la producción de L-asparaginasa por parte
de los microbios (Bhattacharyya et al., 2007). Por lo
tanto, también se sabe que los microbios desempeñan un
papel crítico en la descomposición de la materia orgánica
y en el ciclo de los nutrientes, y por lo tanto, pueden
aprovecharse para la producción comercial de productos
industrialmente importantes utilizando nutrientes más
baratos y una política de cero desperdicios (Das et al.,
2013). .
Tal intento de utilización de muchos residuos agrícolas
como sustratos alternativos para la producción de L-
asparaginasa como la mazorca de maíz también ha
resultado en un aumento del rendimiento de L-
asparaginasa por parte de las bacterias (Makky et al.,
2014). Algunas de estas estrategias de utilización de
desechos aplicadas para la producción de L-asparaginasa
se enumeran en la Tabla 3. Por lo tanto, es una
perspectiva valiosa utilizar los desechos disponibles a
bajo costo para producir una enzima con tal valor
comercial al tiempo que se logra una biorremediación y
una preocupación económica favorable.
Caseína y licor de maíz.
Cultivos leguminosos
Harina de soja y astillas de madera
Harina de soja
Pastel de nuez molida
Salvado de trigo, salvado de arroz y bagazo
Elote
Pastel de aceite de coco
Pastel de aceite de palma
Efluente industrial
Cáscaras de ajo cebolla
Harina De Piel De Pasión
Fig. 2. Pasos implicados en la producción de L-asparaginasa.
8. MÉTODOS DE OPTIMIZACIÓN ESTADÍSTICA PARA
MEDIOS Y PARÁMETROS PARA LA PRODUCCIÓN DE
L-ASPARAGINASA.
Los métodos convencionales utilizados para probar los
parámetros de fermentación individuales son laboriosos
y requieren mucho tiempo y, sin embargo, no
proporcionan información sobre la interacción entre los
factores para el aumento de la productividad general. La
importancia de los métodos estadísticos, por lo tanto, no
se puede descartar. Las operaciones estadísticas ayudan
a la evaluación de cada parámetro como significativo o
insignificante para afectar el rendimiento final y se
pueden expresar simplemente en formas matemáticas de
ecuación. Los métodos estadísticos son rápidos y
confiables, pueden identificar nutrientes significativos,
ayudan a comprender las interacciones entre los
nutrientes en diversas concentraciones y también
reducen enormemente el número total de ensayos
experimentales. Uno de los diseños más antiguos, el
Plackett-Burman (PBD) ayuda a identificar los
compuestos más significativos y sus concentraciones a
partir de una gran cantidad de factores para la
optimización del proceso (Plackett y Burman, 2018).
El diseño de PB permite la evaluación de cada variable
en dos niveles, a saber, "alto" (+1) y "bajo" (−1). Factores
ANOVA como los valores F y p ayudan a decidir la
idoneidad del modelo para el diseño. La representación
gráfica como la tabla de Paretos ayuda a comprender el
factor más significativo en el orden descendente de
importancia. Se informó que el diseño factorial de
Plackett Burman optimiza varios parámetros de medios
y para múltiples aislamientos que se convierten así en
ahorro de tiempo y uno de esos informes fue donde el
pH, el hidrolizado de caseína y el licor de maíz fueron los
factores más importantes que mejoraron el proceso de
producción de enzimas en la selección entre 15
condiciones de cultivo para Pseudomonas Aeruginosa
para producir L-asparaginasa (Abdel-Fattah y Olama,
2002). Venil et al. (2009) informaron un método de
optimización que combinaba el diseño de Plackett-
Burman, un diseño factorial y el método de superficie de
respuesta, que se utilizó para optimizar el medio para la
producción de L-asparaginasa por Serratia marcescens
SB08. El impacto de las fuentes de carbono y nitrógeno
en la producción de L-asparaginasa se informó utilizando
una herramienta estadística llamada Plackett and
Burman (Hymavathi and Sathish, 2010).
La metodología de superficie de respuesta (RSM) implica
el uso de diferentes factores que se evalúan en los
niveles α + 1 y −1 y el resultado resultante en términos
de rendimiento se analiza estadísticamente para
determinar su importancia y el proceso biológico se
puede dar como una ecuación matemática en una
cuadrática. o de manera lineal dependiendo de la
interacción de los factores en cuestión. ANOVA también
ayuda a comprender la importancia del modelo diseñado
y los factores de interacción en términos de los valores F
y p. Como un paso adelante en la optimización, se puede
utilizar un algoritmo genético junto con RSM. La
optimización de las condiciones de cultivo para la
producción de Lasparaginasa por fermentación
sumergida de Aspergillus terreus MTCC 1782 se estudió
utilizando un diseño compuesto central de 3 niveles de
RSM y un algoritmo genético artificial vinculado a redes
neuronales que se encontró que era más eficiente que la
metodología de superficie de respuesta sola (Gurunathan
y Sahadevan , 2012). Las ventajas de RSM sobre el
enfoque de factor a tiempo convencional (OFAT) se han
demostrado claramente en un estudio comparativo para
la producción de L-asparaginasa por Serratia
marcescens, utilizando parámetros de cantidad de
sustrato de torta de aceite de coco, contenido de
humedad inicial, pH y temperatura, donde El enfoque de
optimización de RSM mejora la producción de enzimas al
33% en comparación con el método clásico (Ghosh et al.,
2013). El diseño rotativo compuesto central (CCRD) se
informa más comúnmente como uno de los pasos en la
optimización secuencial que involucra factores distintos
a los constituyentes del medio como el pH inicial óptimo
del medio de cultivo y la concentración de inóculo que
muestran un aumento notable en el rendimiento de L-
asparaginasa (Dias y Sato , 2016). Los informes más
recientes de da Cunha et al. (2018) también sugieren que
mediante la optimización del proceso se obtuvo un
aumento (57%) en la actividad de Lasparaginasa
(3746.78 U / gds) utilizando las condiciones optimizadas
de la harina de cáscara de fruta de la pasión con un
contenido de humedad inicial y concentraciones de
inóculo, otros factores, en comparación con el Los
valores iniciales se obtuvieron en el método de "un
factor a la vez".
Otro diseño en la metodología de superficie de respuesta,
los diseños de Box-Behnken se usan generalmente
cuando tenemos menos puntos de diseño que los diseños
centrales compuestos y, por lo tanto, son menos costosos
de ejecutar. Los diseños de Box-Behnken tienen 3 niveles
por factor, a diferencia de los diseños centrales
compuestos que pueden tener hasta 5, ya que no
incluyen carreras donde todos los factores están en su
configuración extrema. Sin embargo, el método se ha
informado para la optimización de la producción de L-
asparaginasa incluso recientemente para los factores de
los parámetros de cultivo, como el pH, la temperatura y
el contenido de humedad, y dio un resultado significativo
(Doriya y Kumar, 2018).
Por lo tanto, las optimizaciones estadísticas dan como
resultado un mayor rendimiento de la producción de L-
asparaginasa a escala comercial.
9. PURIFICACIÓN Y CARACTERIZACIÓN DE LA L-
ASPARAGINASA.
La purificación de la L-asparaginasa hasta casi la
homogeneidad se informa a partir de diversas fuentes
bacterianas e implica múltiples pasos dependiendo de la
naturaleza intracelular o extracelular de la enzima. En
cualquier caso, las proteínas se eliminan mediante
técnicas de precipitación como el sulfato de amonio. La
proteína precipitada se dializa luego y se somete
adicionalmente a cromatografía en columna. La elección
de la cromatografía en columna varía según el
microorganismo fuente y el tamaño de la L-asparaginasa
involucrada. Pueden involucrarse múltiples etapas de la
cromatografía utilizando dos o más tipos de métodos de
columna. La separación basada en cromatografía de
Tabla 4 Purificación y caracterización de la L-asparaginasa a partir de diferentes microorganismos.
Se han explorado muchos métodos novedosos para
purificar la L-asparaginasa. Uno de estos métodos es la
extracción in situ de L-asparaginasa intracelular que
utiliza un sistema de dos fases acuosas de separación
térmica que produce un mayor rendimiento y una mayor
actividad específica cuando se compara con el proceso de
extracción de dos fases acuosa convencional (Zhu et al.,
2007). ). Además, Zhu et al. (2007) informaron una
recuperación mejorada de la enzima en la
homogeneización a alta presión combinada con
extracción acuosa de dos fases para la purificación de la
L-asparaginasa I intracelular (Ferrara et al., 2010)
informaron la extracción de la L-asparaginasa
periplásmica de Pichia pastoris recombinante que
filtración por gel utilizando materiales como el gel
Sephadex G-100 se utiliza cuando la enzima se separa
fácilmente basándose únicamente en el tamaño
molecular. Las fracciones obtenidas de este modo se
analizan para determinar la presencia de la enzima
mediante protocolos de ensayo y luego las fracciones que
contienen la enzima se pueden agrupar, concentrar y
seguir aplicando a la matriz de cromatografía de
intercambio iónico como la resina de intercambio iónico
CM-Sephadex C50 y eluir en un gradiente. de
concentración de NaCl (0.1–0.5 M) para lograr una
separación basada en la carga. Por lo tanto, los métodos
de purificación han sido casi convencionales durante un
largo período de tiempo (El-Bessoumy et al., 2004;
Gaffar y Shethna, 1977). La estrategia general de
purificación puede ser la que se enumera en la Tabla 4.
contiene El gen ASP3 de Saccharomyces cerevisiae.
Obtuvieron altos rendimientos de extracción y
recuperación de enzimas utilizando ciclos de congelación
y descongelación, tratamiento con etanol y extracción
alcalina en presencia y ausencia de cisteína.
Se idean estrategias de purificación de proteínas
similares para obtener L-asparaginasa purificada que se
confirma aún más mediante técnicas electroforéticas. La
homogeneidad de la proteína purificada se confirma
mediante una banda única de proteína en la PAGE nativa
seguida del tamaño de la subunidad obtenida en la SDS
PAGE. Los tamaños así inferidos dan una idea del
carácter de la enzima como homo o hetro-mer.
10. MASA MOLECULAR DE LA L-ASPARAGINASA
PURIFICADA.
Los tamaños de la L-asparaginasa varían de cada
organismo a otro en términos de género y especie. En el
caso de las bacterias Gram negativas Serratia sp. existe
como pentámero o hexámero con un peso molecular
promedio de 170 a 180 kDa según lo informado por
(Stern et al., 1976). Mientras que la L-asparaginasa se
encontró que era un homotetramer con subunidades
idénticas (38,000 Da) en E. coli (Muller y Boos, 1998). El
tamaño molecular y las subunidades de la L-
asparaginasa en Pseudomonas varían de una sola
subunidad de 34–33 kDa en condiciones de
desnaturalización y desnaturalización, respectivamente.
La L-asparaginasa también existe como un monómero
con un tamaño de 160 kDa en Pseudomonas según lo
informado por (El-Bessoumy et al., 2004). Por lo tanto, la
L-asparaginasa muestra una amplia variación estructural
en las subunidades de las bacterias mencionadas
anteriormente. La tabla .4 enumera los pasos de
purificación y las propiedades de la enzima purificada.
11. GENÉTICA MOLECULAR DE LA L-ASPARAGINASA
Y CLONACIÓN Y SOBREEXPRESIÓN DE LA L-
ASPARAGINASA.
La L-asparaginasa está regulada por diferentes
elementos moleculares en diferentes organismos.
Escherichia coli produce dos L-asparaginasas con
propiedades notablemente diferentes, donde la L-
asparaginasa I tiene una baja afinidad por la L-
asparagina, es citoplásmica y se produce de manera
constitutiva, mientras que la L-asparaginasa II es una
enzima de alta afinidad y es se secreta en el periplasma, y
su expresión está regulada positivamente por diferentes
inductores, a saber, la proteína del receptor de AMP
cíclico y la anerobiosis (la Fumarate and Nitrate
Reductase o la proteína FNR) (Jennings y Beacham,
1990). Las secuencias de estos dos genes codificantes de
L-asparaginasa son bastante diferentes. La comprensión
molecular de la genética de la L-asparaginasa ha
revelado que ansA codifica la L-asparaginasa I, mientras
Tabla 5 Tecnología de ADN recombinante en la clonación de genes de L-asparaginasa de origen microbiano.
que el gen ansB codifica la L-asparaginasa II. Dado que la
asparaginasa II tiene una alta afinidad por la L-
asparagina, es de gran interés en la quimioterapia.
Los intentos de clonar ansB y la sobreexpresión de L-
asparaginasa se han realizado con éxito y dieron como
resultado la producción de una enzima funcional (Vidya
y Vasudevan, 2011). La clonación del gen Tk1656 que
codifica la L-asparaginasa termófila de Thermococcus
kodakarensis KOD1 se realizó en Escherichia coli BLR
(DE3). La proteína recombinante se sobreexpresó,
purificó y caracterizó con éxito (Hong et al., 2014).
En Bacillus sp. La L-asparaginasa está regulada por dos
genes controlados diferencialmente. Los estudios con
Bacillus subtilis revelaron que la expresión de los dos
conjuntos de genes que codifican la L-asparaginasa está
controlada por factores reguladores independientes,
donde se demostró que el gen ansZ codifica una L-
asparaginasa funcional cuya expresión se activa durante
el crecimiento limitado por el nitrógeno por el TnrA.
factor de transcripcion. TnrA regula la expresión de ansZ
mediante la unión a un sitio de ADN que se encuentra
aguas arriba del promotor ansZ.
Sin embargo, la expresión del gen ansA, que codifica otra
Lasparaginasa, fue inducida por asparagina. El gen ansA
se encuentra en un operón junto con ansB, que codifica
la L-aspartasa y la expresión del operón ansAB es
reprimida por AnsR, y se ha hipotetizado que la actividad
de AnsR está regulada por la asparagina o el aspartato
(Fisher y Wray, 2002). Se demostró con éxito la
clonación del gen que codifica Lasparaginasa (ansZ) de
una cepa no patógena de Bacillus subtilis B11-06 y su
sobreexpresión y purificación de la proteína
termoestable (Jia et al., 2013). La lista de organismos
cuyos genes se han clonado para la expresión excesiva de
L-asparaginasa se ha incluido en la Tabla 5.
Por lo tanto, la tecnología de ADN recombinante se ha
aplicado con éxito para producir una producción de L-
asparaginasa mucho mayor y para poseer propiedades
mejoradas de actividad y estabilidad (Zuo et al., 2015).
12. EFECTOS DEL PH, LA TEMPERATURA Y LOS
EFECTORES SOBRE LA ACTIVIDAD DE LA L-
ASPARAGINASA Y LOS ESTUDIOS DE CINÉTICA DE LA
L ASPARAGINASA
Las L-asparaginasas de diferentes organismos difieren
en sus propiedades bioquímicas. la temperatura óptima
general para la actividad de la L-asparaginasa está entre
30 y 40 ° C; sin embargo, varias especies de Yersinia y
Streptomyces tienen temperaturas óptimas más altas
(40–60 ° C), mientras que las L-asparaginasas
hipertermofílicas de la archaea Thermococcus
kodakarensis KOD1 y P. furiosus tienen temperaturas
óptimas a 85 ° C y 80 ° C, respectivamente. La L-
asparaginasa es generalmente activa en un amplio rango
de pH, con una actividad óptima en el rango de 6.0 a 9.5;
sin embargo, la mayoría de ellos son activos a pH
alcalino. La L-asparaginasa de Streptomyces
gulbargensis se mantuvo estable a pH alcalino, mientras
que mantuvo una actividad del 55% a 80 ° C durante 1 h
(Amena et al., 2010).
Se encontró que la L-asparaginasa purificada a partir de
Bacillus licheniformis está activa en el rango de pH 6.0-
10.0 y temperatura de 40 ° C (Mahajan et al., 2014). L-
asparaginasa producida por Streptobacillus sp. KK2S4.
mostró que la actividad óptima de la enzima purificada
se registró a pH 8,5 y 35 ° C (Makky et al., 2014). La L-
asparaginasa de Pseudomonas otitidis mostró que la
actividad óptima de la asparaginasa se logró a 40 ºC y pH
7,5, que está cerca del entorno interno del cuerpo
humano (Husain et al., 2016).
Por otro lado, diferentes iones tienen diferentes
influencias en la actividad de la L-asparaginasa y el
conocimiento de tales efectores ayuda en la comprensión
del sitio activo de la enzima, que puede llevar a estudios
en ingeniería de la especificidad o actividad de su
sustrato. Warangkar y Khobragade (2010) informaron el
efecto de mejora del EDTA sobre la actividad de
Tabla 6 Parámetros cinéticos de la L-asparaginasa por su sustrato natural L-asparagina.
Lasparaginasa, que se interpretó que la enzima no era
una metaloproteína. Este informe también fue apoyado
por los informes de Jia et al. (2013), Kumar et al. (2011),
Singh et al. (2013).
De manera similar, la inhibición de la actividad
enzimática en presencia de Hg2 +, Cd2 + y Zn2 +,
incrementó la activación con agentes reductores como el
2-mercaptoetanol (2-ME), el ditiotreitol (DTT) y la
reducción del glutatión (GSH) y la inhibición en
presencia de bloqueo del grupo tiol. Los reactivos, a
saber, PCMB (benzoato de p-cloro mercurio) fueron
indicativos del papel de los grupos sulfhidrilo de la
enzima para la catálisis productiva. Kumar et al. (2011)
documentaron la inhibición completa de la actividad de
la L-asparaginasa de P. carotovorum MTCC 1428 en
presencia de los cationes di-valentes Cu2 +, Cd2 + y Hg2
+ (Jia et al., 2013) informaron que Fe3 + inhibió
fuertemente la Bacillus subtilis B11-06 L Actividad de la
asparaginasa.
Estudio de la cinética de la L-asparaginasa con respecto a
su sustrato Lasparagina proporciona una idea de la
afinidad por el sustrato. Los valores de Vmax y Km son
una indicación de la velocidad de reacción y la afinidad
del sustrato en bajas concentraciones. Los valores de km
de asparaginasas de diferentes fuentes varían
ampliamente. Los parámetros cinéticos Km se calculan
mediante análisis de regresión no lineal de datos
experimentales de estado estacionario. El conocimiento
de la afinidad enzimática por la L-asparagina puede
abordar el potencial de la enzima para interactuar con su
sustrato en la menor concentración disponible como en
los sueros humanos. Por lo tanto, la enzima con el Km
más bajo es la más buscada para la aplicación
terapéutica en tiempo real. El valor de Km por lo tanto
sirve como una denominación de comparación de la
enzima de varias fuentes para su afinidad de sustrato. La
Tabla 6 enumera algunos de los organismos que
producen L-asparaginasa y sus parámetros cinéticos.
13. APLICACIONES DE LA L-ASPARAGINASA EN LA
INDUSTRIA ALIMENTARIA.
La acrilamida está clasificada por la IARC como
"probablemente carcinogénica para los humanos" y se
forma como resultado de la reacción de Maillard entre la
asparagina y los compuestos carbonílicos, como la
reducción de azúcares en productos como los productos
de papas fritas y otros productos alimenticios, incluidos
los productos de cereales. Bocadillos de café, chocolate y
papas (Vinci et al., 2011).
Sin embargo, las reacciones de Milliard sí imparten
muchos cambios favorables en la industria alimentaria
aparte de la formación de acrilamida y debido a que su
formación no puede erradicarse completamente. Sin
embargo, la aplicación de la L-asparaginasa proporciona
un posible método alternativo para la mitigación de la
acrilamida que debería tener un efecto muy limitado en
la formación general de los productos de Maillard. La L-
asparaginasa de varias fuentes ha sido evaluada para la
mitigación de la acrilamida. La L-asparaginasa de
Aspergillus oryzae se probó en una amplia gama de
productos alimenticios, incluidas las aplicaciones
basadas en masa (galletas semidulces, galletas de
jengibre, pan crujiente) donde se observó una reducción
del 34–92% del contenido de acrilamida, en papas fritas,
aproximadamente 60–85%. y se documentaron
rebanadas de papas fritas hasta un 60% de reducción
(Hendriksen et al., 2009). Mahajan et al. (2012)
demostraron la degradación de la acrilamida por la L-
asparaginasa de Bacillus licheniformis que inhibió la
formación de poliacrilamida en solución de acrilamida al
10% y redujo la formación de acrilamida en papas fritas
en un 80%. Además, la L-asparaginasa termófila
recombinante de Thermococcus kodakarensis KOD1
mostró una reducción en los contenidos de acrilamida en
la masa horneada se redujo a sesenta por ciento después
del tratamiento con TkAsn recombinante en
comparación con el control no tratado (Hong et al.,
2014). El impacto de la acrilamida en las potencias
neurológicas y el efecto mitigador de la L-asparaginasa
se demostró de manera eficiente utilizando C.elegans
como modelo animal al estudiar el efecto de la
exposición a la acrilamida sobre la capacidad
quimiotáctica de los nematodos. Este estudio demostró
la aplicabilidad de la L-asparaginasa y la necesidad de la
mitigación de acrilamida (Shakambari et al., 2017). Por
lo tanto, la L-asparaginasa encuentra una aplicación en la
industria alimentaria para prevenir la acumulación de
acrilamida (Fig. 3).
14. APLICACIÓN DE LA L-ASPARAGINASA COMO
RÉGIMEN DE TERAPIA DEL CÁNCER.
Los efectos anti linfoma de la L-asparaginasa se han
informado desde 1968 (Broome, 1968). Las células
cancerosas, principalmente de origen linfoide, requieren
una gran cantidad de asparagina para un crecimiento
rápido y maligno. De esta manera, las células cancerosas
necesitan el aminoácido de la dieta. Sin embargo, los
linfoblastos leucémicos y algunas otras células tumorales
son auxótrofos de la L-asparagina y tienen un bajo nivel
de sintetasa de L-asparagina necesaria para la síntesis de
la L-asparagina. Por lo tanto, estas células malignas
dependen del suministro exógeno de L-asparagina del
suero sanguíneo para su proliferación y supervivencia
(Fig. 4). La L-asparaginasa hidroliza la asparagina del
suero sanguíneo, causando la muerte de las células
tumorales al carecer de un factor esencial para las
proteínas sintetasas (apoptosis dependiente de p53). Sin
embargo, las células sanas no se ven afectadas, ya que
pueden producir asparagina utilizando la L-asparagina
sintetasa presente en cantidades suficientes.
Se probaron ensayos clínicos extensos para el
tratamiento de muchos tipos de tumores malignos,
incluidos los de las enfermedades hematopoyéticas, la
leucemia linfoblástica aguda (LLA) y los linfomas no
Hodgkin, en los que la L-asparaginasa fue una de las
combinaciones en quimioterapia. El tratamiento de la
LLA en pacientes pediátricos mostró una alta tasa de
supervivencia (70%) junto con informes muy bajos de
reacciones de hipersensibilidad e interferencias
inmunológicas. (Muller y Boos, 1998)
La sensibilidad de las células cancerosas al tratamiento
con L-asparaginasa se ha atribuido a más que la
auxotrofia para la L-asparagina sintetasa. La principal
limitación del tratamiento con L-asparaginasa en la LLA
es el rápido desarrollo de la resistencia clínica, ya sea
debido al rápido aclaramiento de la L-asparaginasa por
un mecanismo inmunológico, o la síntesis activa de la L-
asparagina que conduce a un suministro suficiente del
aminoácido necesario para la célula. supervivencia. En
las células leucémicas humanas, la resistencia está
relacionada, al menos en parte, con la actividad sintetasa
de la asparagina, donde hay un aumento de siete veces
en la actividad sintetasa de la asparagina cuando se
administró la asparaginasa como tratamiento (McCredie
et al., 1973).
La última década ha conducido a una comprensión más
profunda de la comprensión molecular de la razón de la
sensibilidad de la LLA al tratamiento con L-asparaginasa.
La translocación t (12; 21) que resulta en la fusión del
gen TEL / AML1 está presente en aproximadamente el
25% de los pacientes con leucemia linfoblástica aguda
pediátrica (LLA) pediátrica de precursor B, que puede
causar sensibilidad a la L-asparaginasa sola, en dosis que
aseguran Completar el agotamiento de la asparagina
(Woerden et al., 2000).
Por lo tanto, la L-asparaginasa está actualmente
disponible para el tratamiento en tres formas, a saber, la
L-asparaginasa nativa de Escherichia coli (asparaginasa
de E. coli), una forma PEGilada (PEG: polietilenglicol) de
L-asparaginasa (PEG-asparaginasa) y L- asparaginasa de
Erwinia chrysanthemi (asparaginasa de Erwinia). E. coli
asparaginasa o PEGasparaginasa se usa como
tratamiento de primera línea de la LLA infantil en los
protocolos de tratamiento actuales y Erwinia
asparaginasa se adoptó en los protocolos europeos y
estadounidenses para tratamientos de segunda o tercera
línea (Zuo et al., 2015). Hasta la fecha, la L-asparaginasa
sigue siendo prospectiva en el tratamiento de muchas
neoplasias malignas debido al mecanismo de
agotamiento de la acumulación de L-asparagina en las
células que conduce a la muerte celular (Shrivastava et
al., 2016).
Investigaciones recientes sobre el mecanismo de acción
de la L-asparaginasa por agotamiento de la asparagina
revelaron que una nueva variante de baja L-glutaminasa
que se desarrolló en la columna vertebral de la L-
asparaginasa aprobada por la FDA de Erwinia
chrysanthemi fue altamente eficaz contra la T de todas
las células T y B. mientras que muestra características
reducidas de toxicidad aguda. Estos resultados allanan el
camino para el desarrollo de una nueva generación de
Lasparaginasas sin actividad de L-glutaminasa para un
tratamiento más seguro de la LLA humana (Nguyen et al.,
2018).
Fig. 3. Aplicación de la L-asparaginasa en la industria alimentaria para la mitigación de la acrilamida, que se forma
espontáneamente durante la cocción y la exposición a altas temperaturas.
15. INMOVILIZACIÓN Y FORMULACIÓN DE L-
ASPARAGINASA PARA AUMENTAR LA EFICACIA.
La inmovilización de la L-asparaginasa se realiza con la
perspectiva de aumentar su vida media, disminuir las
reacciones inmunológicas y la eficiencia. El uso de la
técnica de mutagénesis dirigida al sitio seguida por el
acoplamiento covalente del éster N-hidroxisuccinimida
de succinato de metoxipoli (etilenglicol) a L-
asparaginasa de E. carotovora mostró una mejor
resistencia a la tripsina y una mayor termoestabilidad.
Kotzia y Labrou inmovilizaron la L-asparaginasa
recombinante de E. chrysanthemi 3937 en Sefarosa CL-
6B activada con epoxi, que exhibió alta estabilidad a 4 ° C
(Kotzia y Labrou, 2011). Zhang et al. (2008), idearon un
método para preparar nanopartículas de fibroína de
seda y L-asparaginasa inmovilizada mediante
reticulación con glutaraldehído. Además, Zhang et al.
(2011) publicaron otra novela y un método para
procesar nanopartículas de fibroína de seda cristalina
fina que albergan bio-conjugados de L-asparaginasa en
presencia de solventes orgánicos. Mientras que las
nanopartículas de óxido metálico sufren las desventajas
de la toxicidad aguda a veces, los bio-conjugados de
ácido graso L-asparaginasa mostraron aplicabilidad para
la administración intravenosa de L-asparaginasa, se
evaluaron y se encontró que su cinética era mejor que la
L-asparaginasa nativa. . Además, esta forma modificada
de enzima ha mejorado la vida media biológica, ha
anulado la toxicidad aguda y ha preservado la actividad
antitumoral incluso cuando se probó in vivo con
respecto a la L-ASNasa nativa (Ashrafi et al., 2013). La
Tabla 7 enumera los métodos para la inmovilización de
la L-asparaginasa.
16. PERSPECTIVA FARMACÉUTICA Y CLÍNICA DE LA
TERAPIA ACTUAL CON LASPARAGINASA.
Biobetter o biosuperior es un término genérico, para
referirse a los productos biológicos de valor agregado,
representa una ventaja de un mecanismo establecido de
acción, seguridad y perfil de eficacia de un biológico
conocido. Tal bio mejor aprobada para la L-asparaginasa
es el Oncaspar aprobado por la FDA, para el tratamiento
de pacientes con leucemia aguda hipersensibles a la
asparaginasa. Este Oncaspar es una L-asparaginasa
derivada de E. coli conjugada covalentemente con
monometoxi polietilenglicol (mPEG) para reducir la
frecuencia de dosificación una vez cada 2 semanas y
también reducir la incidencia de reacciones de
hipersensibilidad en los pacientes (Singh, 2017).
Pegcristantaspase, una asparaginasa PEGilada
recombinante de Erwinia con farmacocinética mejorada,
fue desarrollada para pacientes con hipersensibilidad a
la pegasparie, sin embargo, cuando los pacientes
pediátricos con LLA o linfoma linfoblástico e
hipersensibilidad a la pegaspase, recibieron pegrosis
sexual en el Children's Oncology Group, una serie de
011), los resultados mostraron una inmunogenicidad
preexistente contra el resto PEG de pegaspargase que
condujo a hipersensibilidad a la manifestación de
pegcrisantaspase y un rápido aclaramiento de la
actividad de asparaginasa sérica. Esto plantea la cuestión
de si la PEGilación puede ser una estrategia efectiva para
optimizar la administración de la asparaginasa de
Erwinia (Rau et al., 2018).
Las revisiones recientes sobre este tema para abordar
los problemas asociados con la hipersensibilidad
sugieren que la asparaginasa nativa de E. coli se debe
usar en pacientes sin anticuerpos anti-asparaginasa y
pegcrisantaspasa para aquellos sin anticuerpos contra
PEG, sin embargo, el uso de fármacos inmunosupresores
adicionales que preceden la administración de
pegasparga , estaba garantizado para reducir la
frecuencia de las reacciones de hipersensibilidad o
Fig. 4. Modo de citotoxicidad de la L-asparaginasa en células cancerosas.
disminuir la inactivación silenciosa de pegaspargase (Pui
et al., 2018).
Como justificación de la sugerencia, se evidenció la
quimioterapia con tratamiento con Dexamethasone,
Methotrexate, Ifosfamide, L-Asparaginase y Etoposide
seguida de radioterapia para el linfoma natural killer / T
en estadio temprano con invasividad de tumores local
como protocolo tolerable con eficacia. sin mortalidad
(Gupta et al., 2018).
En una nota similar, una nueva terapia de inducción
llamada Tandem HiCHOP-LA que involucró la
administración de ciclofosfamida por vía intravenosa los
días 2 y 23; daunorubicina por vía intravenosa los días 3,
4, 24 y 25; vincristina por vía intravenosa en los días 1, 8,
15 y 22; L-asparaginasa intravenosa o intramuscular los
días 8, 10, 12, 15, 17, 19, 22, 24 y 26; prednisolona por
vía oral en los días 7–28; y metotrexato, citarabina y
prednisolona por vía intratecal en los días 1 y 21 a
adolescentes y adultos jóvenes con pacientes con LLA
negativos para Filadelfia, y fue seguido por un trasplante
de sangre de cordón umbilical (TCC). El estudio informó
que todos los pacientes lograron una remisión completa
y procedieron a un trasplante de sangre de cordón
umbilical sin casos de mortalidad observada o
recurrencia (Kojima et al., 2018).
En conclusión, se puede percibir que la L-asparaginasa
es un candidato eficaz en un régimen de tratamiento
para enfermedades malignas del sistema linfático. Esta
revisión sostiene, por lo tanto, que los estudios
microbiológicos, biológicos y biológicos y clínicos
realizados hasta el momento dejan una enorme
búsqueda para que los investigadores exploren para
descubrir una posible fuente de organismo de L-
asparaginasa, una estrategia de producción más
económica y rentable mediante la utilización de
desechos, la optimización estadística y Preparación
biocompatible para liberación sostenida y estabilidad
aumentada de la enzima. Estas estrategias hacen que la
L-asparaginasa sea un candidato rentable, confiable y
competente para la aplicación farmacéutica.
 Tabla 7 Inmovilización de L-asparaginasa microbiana Fuente: (Zuo et al., 2015).

Fuente microbiana de la L-asparaginasa.

Método de preparación

Acoplamiento covalente de metoxipol (etilenglicol) succinato éster N-hidroxisuccinimida

Sefarosa CL-6B activada con epoxi reticulado
Nanopartículas de fibroína de seda que reticulan glutaraldehído
Inmovilizado por nanofibra de polianilina.
Albúmina de suero bovino, ovoalbúmina por reticulación usando glutaraldehído, N-bromosuccinimida y
monometoxioxietilenglicol

EXPRESIONES DE GRATITUD

Los autores agradecen a la Junta de Investigación de Ciencia e Ingeniería (SERB), Departamento de Ciencia y Tecnología,
India (Ref. No SB / EMEQ-128/2013), la Comisión de Subvenciones Universitarias UGC India-17-06 / 2012 (i) EUV, DST -
PURSO y UGC - SAP y UGC UPE para el apoyo financiero.