Anda di halaman 1dari 9

2.

1 Pengertian western blot

Menurut Fatchiyah, dkk (2011), western blot adalah istilah yang dipakai untuk proses transfer dan
imunodeteksi protein pada gel yang bertujuan untuk : (1) mengetahui keberadaan dan berat molekul
protein sampel dalam suatu campuran, (2) membandingkan reaksi silang antar protein, (3) mempelajari
modifikasi protein selama sintesis. Dengan cara ini, protein dalam hitungan nanogram dapat terdeteksi.
Nur & Adijuwana (1989) mengemukakan bahwa western blot adalah proses pemindahan hasil protein
dari gel hasil elektroforesis ke membran dan digunakan untuk mendeteksi protein pada sampel jaringan.
Imunoblot menggunakan elektroforesis gel untuk memisahkan protein asli. Hasil elektroforesis antigen
lalu ditransfer ke membran nitroselulosa dengan bantuan arus listrik. Antigen pada membran selanjutnya
akan dikenali oleh antibodi dari sampel. Pita-pita yang terpisah dapat dideteksi dengan terdatnya warna
pada membran.

Menurut Attwood et al., (2006) menyatakan bahwa Western Blot (WB) merupakan suatu teknik untuk
menandai suatu protein pada membran nitroselulosa, nilon, atau membran transfer lain setelah protein
tersebut terpisahkan melalui elektroforesis. Protein tersebut kemudian dapat dideteksi melalui metode
autoradiografi, pelabelan dengan senyawa-senyawa fluoresen, pelabelan dengan 125I, pelabelan dengan
antibodi terikat protein, lektin atau gen pengikat spesifik lainnya. Western blot digunakan secara luas
untuk menentukan ukuran antigen dan antibodi yang diketahui, serta untuk diidentifikasi. Teknik ini
memiliki beberapa keuntungan seperti :

1. Teknik ini mampu mendeteksi protein dengan sensitivitas tinggi karena protein dipekatkan dalam
volume kecil.

2. Waktu yang dibutuhkan efisien.

3. Reagens yang digunakan lebih ekonomis.

2.2 Prinsip Kerja Western Blot

Prinsip kerja western blotting dapat dilihat pada Gambar 2.1.

Gambar 2.1. Prinsip Kerja Western Blotting .

Berdasarkan Gambar 2.1 tersebut, prinsip teknik western blotting yaitu mendeteksi protein spesifik pada
sampel jaringan yang homogen ataupun dari suatu ekstraksi berdasarkan kemampuan protein tersebut
berikatan dengan antibodi. Teknik ini menggunakan gel elektroforesis untuk memisahkan protein
berdasarkan panjang polipeptida atau berdasarkan struktur 3D-nya. Protein tersebut kemudian
ditransfer ke sebuah membran, biasanya nitroselulosa atau PVDF, dimana mereka kemudian akan dilacak
dengan menggunakan antibodi yang spesifik kepada protein target.
Membran tersebut (PVDF) dapat diperlakukan lebih fleksibel daripada gel sehingga protein yang terblot
pada membran dapat dideteksi dengan cara visual maupun fluoresensi. Deteksi ekspresi protein pada
organisme dilakukan dengan prinsip imunologi menggunakan antibodi primer dan antibodi sekunder.
Setelah pemberian antibodi sekunder, deteksi dilakukan secara visual dengan pemberian kromogen atau
secara fluoresensi. Pada deteksi secara fluoresensi, reaksi antara antibodi primer dengan antibodi
sekunder akan memberikan hasil fluoresens yang selanjutnya akan membakar film X-ray, deteksi ini
dilakukan di kamar gelap.

Immunodeteksi tidak dilakukan langsung pada gel karena sifat gel yang rapuh untuk dapat melalui proses
inkubasi yang lama dan pencucian yang berulang kali. Untuk mengatasi hal ini, maka protein terlebih
dahulu ditansfer dari gel ke membran nitroselulosa (NC) atau membrane poliviniliden difluorida (PVDF).

Membran digunakan sebagai tempat melekatnya protein yang diuji karena:

1. Mudah manipulasinya

2. Mengurangi lama inkubasi dan pencucian.

3. Hasil protein yang ditrnsfer (hasil blot) dapat dipakai lagi untuk immunodeteksi protein yang lain
(sesudah diinkubasi dengan detergen untuk menghilangkan probing reagent.

4. Blot dapat disimpan sampai 1 bulan

5. Blot sesuai untuk berbagai prosedur deteksi (fatchiyah dkk, 2011).

Proses mendeteksi protein target dapat dilakukan secara direct dan indirect. Pendetksian secara direct
(langsung) tidak membutuhkan antibodi sekunder karena antibodi primer sudah langsung dilabeli oleh
enzim maupun pewarna fluorescent. Sedangkan pendeteksian secara indirect (tidak langsung) yaitu
antibodi primer ditambahkan lebih dahulu supaya berikatan dengan protein antigen dalam sampel, lalu
diikuti penambahan antibodi sekunder sehingga antibodi sekunder dapat langsung berikatan dengan
antibodi primer. Label yang digunakan adalah konjugat enzim (substrat) chemiluminescent horseradish
peroxidase (HRP). Perbandingan procedur pendeteksian protein antara direct dan indirect dapat dilihat
pada Gambar 2.2. pendeteksian protein target secara indirect lebih banyak digunakan karena memiliki
lelebihan antara lain antibodi sekunder dapat memperkuat sinyal pendeteksi, pelabelan tidak
mempengaruhi imunoreaktivitas antibodi primer, dan satu antibodi sekunder dapat digunakan untuk
beberapa antibodi primer (Rockoff dan Cole, 2011).
Gambar 2.2. Perbandingan pendeteksian protein direct dan indirect (Sumber: Rockoff dan Cole, 2011).

2.3 Langkah Kerja Western Blot

Berdasarkan pengertian dari Western Blot tersebut, Western Blot dapat dilakukan melalui beberapa
tahapan.

1. Tahap pertama yaitu elektoforesis

2. Ttahap kedua yaitu elektotransfer,

3. Tahap ketiga yaitu deteksi.

Adapun gambar alur dari tahapan western blot dapat dilihat pada Gambar 2.3

Gambar 1: Tahapan dalam Western Blot


Gambar 2.3. Gambar alur tahapan Western Blot (Sumber: Kindt et al., 2007).

1. Tahap Pertama (Elektroforesis)

Pada tahap pertama ini, protein yang diinginkan dipisahkan dari sampel secara elektroforesis.
Elektroforesis merupakan pemisahan protein berdasarkan ukuran molekul dalam suatu tegangan listrik
tertentu. Dalam elektroforesis, biasanya sampel yang mengandung protein biasanya dicampur dengan
SDS. SDS merupakan suatu detergen yang memiliki muatan negatif. Muatan negatif SDS tersebut
mengganggu kestabilan protein, sehingga protein mengalami denaturasi. Interaksi ionik, jembatan
disulfida, ikatan hidrogen yang menyebabkan suatu protein mengalami folding untuk menjaga
kestabilannya menjadi terganggu akibat adanya SDS.

Suatu protein multimer juga akan terurai menjadi monomer penyusunnya. Akibatnya, protein-protein
yang ada dalam sampel membentuk suatu rantai polipeptida lurus. Semakin besar berat molekul suatu
protein, maka rantai polipeptida tersebut semakin panjang. Sampel dengan protein rantai polipeptida
lurus tersebut dimasukkan dalam suatu membran poliakrilamid yang dialiri arus listrik. Protein yang telah
bermuatan negatif akan bergerak dari kutub negatif menuju kutub positif. Laju pergerakan protein dalam
membran poliakrilamid tersebut berbeda-beda tergantung pada daya hambat antara protein dan
membran.

Protein yang berukuran lebih besar akan memiliki daya hambat lebih besar sehingga pergerakannya
menjadi lebih lambat dibandingkan dengan pergerakan protein yang berukuran lebih kecil. Setelah dialiri
arus listrik selama beberapa waktu, masing-masing protein akan terpisah berdasarkan ukuran
molekulnya. Protein yang lebih kecil atau memiliki berat molekul rendah akan bergerak lebih jauh
dibanding protein yang lebih besar. Dalam gel poliakrilamid tersebut akan terbentuk pita-pita yang
merupakan protein-protein yang telah terpisah berdasarkan berat molekul, dapat terlihat pada Gambar
2.4 dibawah (Koolman dan Roehm, 2005).
Gambar 2.4. Proses yang terjadi dalam gel poliakrilamid (Sumber: Koolman dan Roehm, 2005).

2. Tahap kedua (elektotransfer)

Tahap kedua dalam Western Blot yaitu pemindahan protein dari gel poliakrilamid menuju gel
transfer. Tahap pemindahan tersebut menggunakan arus listrik sebagai faktor pendorong transfer
protein. Oleh karena itu, proses pemindahan tersebut disebut juga elektrotransfer. Menurut Bollag et al.,
(1996), elektrotransfer dapat dilakukan dengan dua metode, yaitu:

a. Blotting Semi Kering

Blotting semi kering menggunakan kertas saring yang telah dibasahi dengan buffer transfer. Kertas saring
tersebut diletakkan diantara gel poliakrilamid dan gel transfer. Transfer seperti ini dapat dilakukan
selama 10-30 menit dengan listrik tertentu.

b. Blotting Basah

Blotting basah tidak menggunakan kertas saring diantara gel poliakrilamid dan gel transfer, tetapi kedua
gel tersebut diimpitkan dan direndam dalam buffer transfer (Wenk dan Fernandis, 2007). Transfer
dengan blotting basah dapat dilakukan 45 menit hingga 1 malam. Metode blotting basah lebih umum
digunakan karena fleksibilitas metode tersebut yang lebih baik.

Gel transfer yang umum digunakan pada western bolt ada dua, yaitu nitroselulosa dan nilon. Pada
sebagian besar aplikasi, nitroselulosa lebih umum digunakan karena relatif tidak mahal dan bloking
mudah dan cepat dilakukan. Nilon juga digunakan terutama pada beberapa keadaan khusus. Pertama,
kapasitas pengikatan dengan protein yang dibutuhkan jauh lebih besar dari kapasitas pengikatan
nitroselulosa dan protein. Kedua, protein terikat sangat lemah pada nitroselulosa. Ketiga, adanya
kebutuhan resistensi terhadap tekanan mekanik (Bollag et al., 1996).

Transfer protein dari gel poliakrilamid menuju gel transfer merupakan tahap yang sangat penting dalam
western bolt. Oleh karena itu, ada beberapa faktor yang harus diperhatikan dalam proses transfer
protein tersebut.

a. Arus listrik yang digunakan harus diperhatikan karena arus yang terlalu tinggi dapat menghasilkan
panas selama transfer yang dapat menimbulkan masalah

b. Kekuatan ion rendah buffer transfer dapat digunakan pada tegangan listrik yang tinggi tanpa perlu
dikhawatirkan menghasilkan panas yang tinggi.
c. Salah satu arus listrik yang dapat digunakan adalah 200 mA selama 2 jam

d. Untuk transfer protein dengan ukuran molekul besar, penggunaan gel dengan konsentrasi
poliakrilamid yang rendah.

3. Tahap ketiga (Deteksi)

Tahap ini merupakan deteksi protein yang telah dipindahkan ke membran transfer. Deteksi protein
tersebut memanfaatkan interaksi antara antigen dan antibodi yang bersifat spesifik. Variasi metode-
metode tersebut terutama terletak pada penggunaan antibodi primer dan sekunder, serta penggunaan
molekul penanda. Berdasarkan penggunaan antibodi primer dan antibodi sekunder, ada dua metode
deteksi, yaitu: metode langsung dan metode tidak langsung. Metode langsung menggunakan antibodi
primer yang telah terkonjugasi dengan molekul marker. Metode tidak langsung menggunakan antibodi
primer dan antibodi sekunder. Antibodi primer berfunsi mengikat protein target, sedangkan antibodi
sekunder berfungsi mengikat antibodi primer dan terkonjugasi dengan molekul penanda. Molekul
penanda yang digunakan juga bervariasi. Molekul penanda yang umum digunakan diantaranya adalah
enzim alkalin fosfatase (AP), enzim horsedish peroksidase (HRP), immunogold, dan 125I. Masing-masing
molekul penanda tersebut memiliki kelebihan dan kekurangan. Molekul penanda immunogold memiliki
sensitifitas paling tinggi, yaitu immunogold (1-25 pg). HRP, AP dan 125I memiliki sensitivitas relatif
rendah yaitu 10-20 pg, 10-50 pg, dan 50-100 pg (Bollag et al., 1996).

Deteksi dilakukan dengan antibodi yang telah dimodifikasi bersama dengan sebuah enzim yang disebut
reporter enzyme. Proses deteksi biasanya berlangsung dalam dua tahap, yaitu :

1. Antibodi Primer

Antibodi yang digunakan di sini adalah antibodi yang pertama kali dihasilkan sistem imun ketika
terpajang protein target. Antibodi terlarut kemudian diinkubasi bersama kertas membran paling sedikit
selama 30 menit.

2. Antibodi Sekunder

Setelah diinkubasi bersama antibodi primer, kertas mebran dibilas terlebih dahulu barulah diinkubasi
dengan antibodi sekunder. Antobodi sekunder adalah antobodi yang spesifik untuk suatu spesies pada
antibodi primer. Misalnya, anti-tikus hanya akan berikatan pada antibodi primer yang berasal dari tikus.
Antibodi sekunder biasanya berikatan dengan enzim reporter seperti alkaline fosfatase atau horseradish
peroxidase. Antibodi sekunder ini kemudian akan menguatkan sinyal yang dihasilkan oleh antibodi
primer. Sekarang, proses deteksi dapat dilakukan dengan satu langkah saja, yaitu dengan menggunakan
antibodi yang dapat mengenali protein yang diinginkan sekaligus memiliki label yang mudah dideteksi.
2.4 Aplikasi dan Manfaat Western Blot

2.4.1 Aplikasi Teknik Western Blot

Teknik western blot telah banyak dikembangkan dalam berbagai penelitian, salah satunya pada
penelitian mengenai spesifitas dan sensitifitas antibodi anti eRF3 ragi Saccharomyces cerevisia. Protein
eRF3 (eukaryotic release factor-3) merupakan salah satu protein yang berperan pada proses terminasi
translasi. Protein ini bersama-sama dengan eRF1 (eukaryotic release factor-1) saling berinteraksi
membentuk kompleks release factor dalam memediasi pelepasan rantai polipeptida dari ribosom.

Untuk memahami mekanisme terminasi translasi dalam sistem eukariot dilakukan evaluasi struktur
fungsi eRF1 yang dilanjutkan dengan studi in vitro eRF1 mutan dan eRF1 wild type dengan eRF3. Namun
demikian hasil deteksi dari studi interaksi in vitro sulit terdeteksi secara kuantitatif. Untuk dapat
mengkuantisasi pita-pita eRF3 hasil studi interaksi in vitro diperlukan antibodi anti eRF3.

2.4.2 Manfaat Western Blot

Adapun manfaat secara umum dari analisis westrern blot antara lain:

1.1 Untuk mengidentifikasi dan memposisikan protein berdasarkan kemampuannya untuk berikatan
dengan antibodi yang spesifik

2.1 Dapat memberikan informasi tentang ukuran dari protein

Berdasarkan penguraian aplikasi teknik western blot , salah satu manfaat yang telah diperoleh dari
analisis western blot ini yaitu konstruksi antibodi anti eRF3 telah dilakukan meskipun antibodi belum
terkarakterisasi dengan baik. Sehingga dilakukanlah analisis western blot dengan cara mengukur tingkat
spesifitas dan sensitifitas antibodi anti eRF3 terhadap protein eRF3. Spesifitas antibodi ditentukan
berdasarkan kemampuan antibodi ini dalam mengenali epitop protein eRF3 dari berbagai protein yang
terdapat pada crude extract ragi, sedangkan sensitifitasnya ditentukan melalui variasi jumlah antigen
(eRF3) yang berinteraksi dengan antibodi tersebut.
BAB III

KESIMPULAN

3.1 Kesimpulan

Berdasarkan pembahasan yang sudah diuraikan, maka dapat ditarik beberapa kesimpulan antara lain:

1. Western blot adalah proses pemindahan hasil protein dari gel hasil elektroforesis ke membran dan
digunakan untuk mendeteksi protein pada sampel jaringan. Imunoblot menggunakan elektroforesis gel
untuk memisahkan protein asli.

2. Prinsip kerja western blot adalah yaitu mendeteksi protein spesifik pada sampel jaringan yang
homogen ataupun dari suatu ekstraksi berdasarkan kemampuan protein tersebut berikatan dengan
antibodi.

3. Langkah kerja dalam analisis western blot dapat dilakukan dalam beberapa tahapan yaitu (1) tahap
elektroforesis, (2) tahap elektrotransfer, dan (3) tahap deteksi.

4. Salah satu aplikasi dari teknik western blot yang dapat dilakukan adalah mengenai spesifitas dan
sensitifitas antibodi anti eRF3 ragi Saccharomyces cerevisia.

5. Adapun manfaat dari western blot secara umum yaitu (1) untuk mengidentifikasi dan
memposisikan protein berdasarkan kemampuannya untuk berikatan dengan antibodi yang spesifik, (2)
dapat memberikan informasi tentang ukuran dari protein.
DAFTAR PUSATAKA

Atwood, T.K., P.N. Campbell, J.H. Parish, A.D. Smith, J.L. Stirling dan F. Vella (Ed). 2006. Oxford Dictionary
of Biochemistry and Molecular Biology, Revised Edition. Oxford. University Press.

Bollag, D.M., M.D. Rozycki, S.J. Edelstein. 1996. Protein Method. Wiley-Liss. Inc.

Davidson, 2000. Western Blot Procedure.


http://www.bio.davidson.edu/course/genomics/method/westernblot.html. Diakses pada tanggal 9
November 2016.

Fatchiyah, dkk. 2011. Biologi Molekular. Jakarta. Erlangga.

Kindt, T.J., R.A.Goldsby, B.A. Osborne, J. Kuby. 2007. Kuby Immunology. W.H. Freeman. New York.

Koolman, J. dan K. Roehm, 2005. Color Atlas of Biochemistry, Second Edition. Revised and Enlarged.
Thieme.

Rockoff, A. dan G.W. Cole. 2011. Hives (urticaria & angioedema).


http://www.medicinenet.com/hives/article.html. Diakses pada tanggal 9 November 2016.

Wenk, M.R. dan A.Z. Fernandis. 2007. Manuals in Biomedical Research : A Manual For Biochemistry
Protocols. World Scientific Publishing Co. Pte. Ltd.