MAKALAH

BIOTEKNOLOGI FARMASI

KLONING GEN

Dosen Pengampu:
Rosmaya Dewi, M.Si

Disusun oleh:

Kelompok 3

Asti Juanti (31116105)

Ema Fitriani (31116113)
Maulidya Robiatul (31116125)
Rifky Eka Putra (31116135)
Zaky Thooriq M (31116150)

FARMASI 3C

(31116145)
SEKOLAH TINGGI ILMU KESEHATAN
BAKTI TUNAS HUSADA
TASIKMALAYA
2018
 KATA PENGANTAR
Puji syukur atas kehadirat Tuhan Yang Maha Esa karena atas Rahmat dan
Karunia-Nyalah sehingga makalah Bioteknologi Farmasi tentang teori “Kloning
DNA” ini dapat terselesaikan tepat pada waktunya.
Pada kesempatan kali ini, penulis tidak lupa untuk mengucapkan
terimakasih kepada dosen pengampu. Kami menyadari bahwa makalah ini masih
jauh dari kesempurnaan, oleh karena itu kritik dan saran dari semua pihak yang
bersifat membangun, selalu diharapkan demi kesempurnaan makalah ini.
Harapan penulis semoga makalah ini bisa bermanfaat dan dapat
menambah pengetahuan dan pengalaman bagi para pembaca, untuk kedepannya
dapat memperbaiki bentuk maupun menambah isi makalah agar menjadi lebih
baik lagi.

Tasikmalaya, Februari 2019

Penulis

i
 DAFTAR ISI

Kata Pengantar ....................................................................................................i

Daftar Isi..............................................................................................................ii

BAB I PENDAHULUAN
1.1. Latar Belakang ...........................................................................................1
1.2. Rumusan Masalah ......................................................................................4
1.3. Tujuan ........................................................................................................4

BAB II ISI
2.1. Definisi kloning...........................................................................................5
2.2. Isolasi DNA .................................................................................................6
2.3. Vektor DNA ................................................................................................8
2.4. Transformasi DNA ......................................................................................11
2.5. Seleksi transforman .....................................................................................13

BAB III PENUTUP

3.1. Kesimpulan ................................................................................................15
3.2. Saran ..........................................................................................................15

DAFTAR PUSTAKA ........................................................................................16

ii
 BAB I
PENDAHULUAN
A.Latar Belakang
Dewasa ini kloning telah menjadi ”the hottest topic” dalam studi
bioteknologi dan biomedik Kloning yang dipelopori oleh Dreisch pada akhir tahun
1800 telah berkembang pesat dan menyumbangkan penemuan-penemuan baru yang
sangat menjanjikan.
Secara umum kloning merupakan sejumlah proses yang dapat digunakan
untuk menghasilkan salinan suatu kesatuan biologik yang secara genetik identik
tanpa melalui reproduksi seksual Bahan salinan ini disebut klon (clone) dan
mempunyai genetik yang sama dengan asalnya.
Pada hakekatnya secara alamiah kloning organisme unisel sampai ke yang
multisel telah berlangsung selama ribuan tahun 1,3-5 Sebagai contoh, bakteri
menghasilkan turunannya melalui proses reproduksi aseksual, sel kanker yang
beranak pinak dalam tubuh manusia, tumbuhan dalam hutan sejenis, bahkan sampai
organisme multisel yang lebih tinggi yaitu mamalia, termasuk manusia Kembar
identik pada manusia dan mamalia terjadi bila sel telur yang telah difertilisasi
membelah dan menghasilkan dua atau lebih embrio yang menyandang DNA yang
hampir identik.
Dengan kemajuan biotekonologi maka terdapat perkembangan pesat dalam
kloning artifisial, Keberhasilan melakukan kloning pada mamalia dengan
menggunakan sel non embrionik yang diawali oleh hot issue Pada zaman sekarang,
di negara-negara maju dan berkembang bioteknologi berkembang dengan sangat
pesat.
Kemajuan ini ditandai dengan ditemukannya berbagai macam teknologi
seperti rekayasa genetika, kultur jaringan, DNA rekombinan pengembangbiakan sel
induk, kloning, dan lain-lain.
Teknologi ini memungkinkan kita untuk memperoleh penyembuhan penyakit-
penyakit genetik maupun kronis yang belum dapat disembuhkan. Selain itu hal hal
yang mendorong perkembangan bioteknologi ini adalah untuk meningkatkan mutu
baik itu dalam bidang pangan, medis, maupun bidang kehidupan lainnya,
Bioteknologi secara umum berarti meningkatkan kualitas suatu organisme melalui
aplikasi teknologi.

3
 Aplikasi teknologi tersebut dapat memodifikasi fungsi biologis suatu
organisme dengan menambahkan gen dari organisme lain atau merekayasa gen pada
organisme tersebut.
Salah satu penerapan bidang bioteknologi yang sering dibicarakan orang yaitu
kloning, Kloning merupakan salah satu bioteknologi mutakhir yang sangat bermanfaat
untuk memultiplikasi genotip hewan yang memiliki keunggulan tertentu dan
preservasi hewan yang hampir punah.
Walaupun keberhasilan produksi hewan kloning lewat transfer inti sel somatik
telah dicapai pada berbagai spesies, seperti domba, sapi, mencit, kambing babi,
kucing, dan kelinci, efisiensinya sampai sekarang masih sangat rendah yakni kurang
dari 1 persen, dengan sekitar 10% yang lahir hidup (Han et al., 2003 dalam Hine, T.
M, 2004).
Pemanfaatan kloning dapat sebagai terapeutik, reproduktif, dan replacement,
Kloning gen yang menghasilkan salinan gen atau segmen DNA dan kloning sel
punca ataupun sel dewasa dapat diaplikasikan dalam pengobatan kloning reproduktif
menghasilkan salinan hewan seutuhnya(termasuk manusia) dan sebagai
replacement yaitu berfungsi untuk penggantian bagian tubuh individu (yang
dilakukan kloning) yang mengalami kerusakan, atau gagal organ Salah satu isu
yang cukup meng gemparkan adalah menghasilkan klon manusia sebagai
replacement children dengan menggunakan sel somatik dari individu itu sendiri.
Masih banyak kendala, salah tanggap,ataupun kontroversi dalam proses
kloning, baik dalam hal teknologi, penelitian dan pengamatan, maupun tanggapan
dari pihak-pihak yang berkompeten, terlebih lagi bila kloning yang terkait langsung
dengan nilai-nilai kemanusiaan, hukum, dan etik.4,6,9Wa-laupun demikian bagi para
peneliti biomolekuler, kloning masih tetap merupakan topik yang sangat menarik,
marak dan penuh dengan tantangan, dan amat sangat patut di perjuangkan demi
kemajuan masa depan.
Diperlukan waktu yang cukup panjang untuk menentukan apakah impian para
peneliti akan terwujud atau tetap status quo sebagai masalah serius dan mendasar
secara etik, terlebih lagi mengenai keberadaan dan statusmoral embrio manusia dan
penggunaannya dalam penelitian.
Pada tahun 1800 Hans Dreisch memelopori melakukan kloning pada sea
urchins dengan dasar pemikiran hewan laut ini mempunyai sel embrio yang besar

4
dan dapat berkembang tanpa ketergantungan pada induknya. Dreich melakukan
kloning dengan memisahkan sel embrio bersel dua.
Selang 20 tahun kemudian yaitu tahun 1902 Hans Spemman berhasil
melakukan pemisahan sel embrio bersel dua dari salaman-der, yang selanjutnya
berkembang diluar tubuh induk.
Perkembangan yang pesat terjadi pada 1951 oleh tim peneliti di Philadelphia
yang melakukan kloning embrio katak, Inti sel embrio katak dikeluarkan untuk
menggantikan inti sel telur yang belum dibuahi.
Percobaan ini merupakan awal metode nuclear transplant.1,3 Penerobosan
yang bermakna terjadi pada tahun 1986 dengan dilakukannya koning mamalia oleh
dua tim peneliti di Inggris (kloning biri-biri) dan di Amerika (kloning sapi).
Walaupun demikian, tidak satupun tim yang berpendapat bahwa kloning ma-
malia dapat dilakukan dengan menggunakan sel somatik dewasa yang telah
berdiferensiasi. Tahun 1996 tim peneliti Wilmut et aldari Roslin Institute di
Scotlandia berhasil melakukan kloning biri-biri dengan menggunakan sel non
embrionik yaitu sel kelenjar mamma biri-biri dewasa, yang dikenal de-ngan ”Dolly
the sheep”.
Dengan berhasilnya proses kloning tersebut, maka peneliti -peneliti lainnya
berlomba-lomba melakukan kloning dengan menggunakan berbagai spesies hewan
embryo twinning tetapi memberi hasil yang relatif sama yaitu salinan genetik yang
sama.
Sel somatik yang dipakai adalah sel-sel di dalam tubuh selain sel sperma dan
sel telur Pada mamalia setiap sel somatik mempunyai dua set kromosom yang
lengkap. Inti sel somatik ditransfer ke sel telur yang telah dilakukan enukleasi Sel
telur dengan inti baru ini akan berlaku sebagai zigot, yang kemudian diimplantasikan
ke inang subtitusi.
SCNT bertujuan utama untuk menghasilkan embrio yang akan digunakan
pada riset, terutama riset sel punca. Sel-sel ini kemudian dipanen untuk digunakan
pada riset bioteknologi dengan harapan dapat diaplikasikan bagi berbagai aspek yang
menunjang kesejahteraan manusia, termasuk aspek kesehatan dan pengobatan.
Di dalam ilmu biologi kloning adalah proses untuk menghasilkan populasi
individu yang identik secara genetik, yang terjadi di dalam alam ketika organisme
seperti bakteri, insekta, atau tumbuhan bereproduksi secara aseksual. Secara lebih
rinci Bioteknologi menjelaskan kloning sebagai proses untuk menghasilkan salinan

5
fragmen DNA (kloning molekular), sel (kloning sel), atau organisme (kloning
organisme).
Transfer inti melibatkan suatu seri prosedur yang kompleks termasuk kultur
sel donor, maturasi oosit in vitro, enukleasi, injeksi sel atau inti, fusi, aktivasi, kulturin
vitro reconstructed embryo, dan transfer embrio, Jika salah satu dari tahap-tahap ini
kurang optimal, produksi embrio atau hewan kloning dapat terpengaruh.

B. Rumusan Masalah
Berdasarkan latar belakang masalah di atas, dapat kita angkat beberapa
permasalahan yaitu:
1. Bagaimana isolasi DNA dan karakterisasi?
2. Bagaimana DNA vektor untuk kloning?
3. Bagaimana transformasi DNA?
4. Bagaimana seleksi sel transforman?

C.Tujuan
1.Untuk mengetahui tentang isolasi DNA dan karakterisasi
2.Untuk mengetahui teknik DNA vektor untuk kloning
3.Untuk mengetahui perkembangan transformasi DNA
4.Untuk mengetahui seleksi sel transforman

6
 BAB II
PEMBAHASAN

2.1 Definisi Kloning

Klon berasal dari kata klόόn (yunani), yang artinya ranting. Kloning adalah
tindakan menggandakan atau mendapatkan keturunan jasad hidup tanpa fertilisasi,
berasal dari induk yang sama, mempunyai susunan (jumlah dan gen) yang sama dan
kemungkinan besar mempunyai fenotip yang sama. Kloning manusia adalah teknik
membuat keturunan dengan kode genetik yang sama dengan induknya yang berupa
manusia. Kloning adalah cara bereproduksi secara aseksual atau untuk membuat
salinan atau satu set salinan organisme mengikuti fusi atau memasukan inti
diploid kedalam oosit (Seidel ,GE Jr., 2000 dalam Tong, W F., 2002).

Americaan Medical Association mendefinisikan kloning sebagai produksi

dari organisme identik secara genetik melalui sel somatik transfer nuklir, walaupun
definisi yang lebih luas sering digunakan untuk memasukkan produksi jaringan dan
organ dari kultur sel atau jaringan menggunakan sel (Tong, W F., 2002).

Kloning dalam biologi adalah proses menghasilkan populasi serupa genetik

individu identik yang terjadi di alam saat organisme seperti bakteri, serangga atau
tanaman bereproduksi secara aseksual. Secara definisi, klon adalah sekelompok
organisme hewan maupun tumbuhan melalui proses reproduksi aseksual yang berasal
dari satu induk yang sama. Setiap anggota klon tersebut memiliki jumlah dan susunan
gen yang sama sehingga kemungkinan besar fenotifnya juga sama (Rusda, M, 2003).

Kloning pada tanaman dalam arti melalui kultur sel mula-mula dilakukan pada
tanaman wortel. Dalam hal ini sel akar wortel dikultur, dan tiap selnya dapat tumbuh
menjadi tanaman lengkap. Teknik ini digunakan untuk membuat klon tanaman dalam
perkebunan. Dari sebuah sel yang mempunyai sifat unggul, kemudian dipacu untuk
membelah dalam kultur, sampai ribuan atau bahkan sampai jutaan sel. Tiap sel
mempunyai susunan gen yang sama, sehingga tiap sel merupakan klon dari tanaman
tersebut.

7
2.2 Isolasi DNA

Deoxyribonucleic acid atau DNA merupakan senyawa kimia yang paling

penting dalam makhluk hidup.DNA merupakan senyawa yang mengandung informasi
genetik makhluk hidup dari satu generasi ke generasi selanjutnya. Keseluruhan DNA
dalam suatu sel akan membentuk genom. Genom meliputi bagian gen yang fungsional
maupun non-fungsional dalam sel organisme. DNA genom meliputi gen danintergen
(Suryo, 2004).

DNA adalah asam nukleat yang mengandung materi genetik dan berfungsi
untuk mengatur perkembangan biologis seluruh bentuk kehidupan secara seluler.
DNA terdapat pada nukleus, mitikondria, dan kloroplas. Perbedaan ketiganya adalah
DNA nukleus berbentuk linier dan berasosiasi sangat erat dengan protein histon,
sedangkan DNA mitokondria dan kloroplas berbentuk sirkular dan tidak berasosiasi
dengan protein histon. Selain itu DNA mitokondria dan kloroplas memiliki ciri khas,
yaitu hanya mewariskan sifat-sifat yang berasal dari garis ibu. Sedangkan DNA
nukleus memiliki pola pewarisan sifat dari kedua orangtua. Dilihat dari organismenya,
struktur DNA prokariot tidak memiliki protein histon dan berbentuk sirkular,
sedangkan DNA eukariot berbentuk linier dan memiliki protein histon (Kirsman,
2010).

Isolasi DNA merupakan langkah mempelajari DNA. Salah satu prinsipisolasi

DNA yaitu dengan sentrifugasi. Sentrifugasi merupakan teknik untukmemisahkan
campuran berdasarkan berat molekul komponennya. Molekul yang mempunyai berat
molekul besar akan berada di bagian bawah tabung dan molekul ringan akan berada
pada bagian atas tabung . Hasil sentrifugasi akan menunjukkan dua macam fraksi
yang terpisah, yaitu supernatan pada bagian atas dan pelet pada bagian bawah
(Rachmat, 2012).

Pemisahan DNA dari materi seluler lainnya merupakan hal yang signifikan
dan mengharuskan penyallinan DNA menjadi RNA dan translasi RNA menjadi
protein berlangsung dalam kompartemen( ruang ) yang berbeda yaitu secara berturut-
turut dalam nucleus dan sitoplasma ( Elrod, 2007 ).

Terdapat organel-organel bermembran ganda di dalam sitoplasma, termasuk

mitokondria baik pada tumbuhan maupun hewan. Oleh karena itu perlu dilakukan

8
isolasi DNA pada tanaman dan hewan untuk mengetahui dan mempelajari DNA dari
tanaman dan hewan tersebut. Sel eukariotik memiliki DNA lebih banyak, lengkap
dengan komponen-komponen lain. DNA tanaman dan hewan tersimpan dalam
nucleusyang terbungkus oleh membran. Isolasi DNA merupakan langkah yang tepat
untuk mempelajari DNA. Prinsipnya ada dua, yaitu sentrifugasi dan
presipitasi.Sentrifugasi merupakan teknik untuk memisahkan campuran berdasarkan
berat molekul komponennya. Molekul yang mempunyai berat molekul besar akan
berada di bagian bawah tabung dan molekul ringan akan berada pada bagian atas
tabung. Hasil sentrifugasi akan menunjukkan dua macam fraksi yang terpisah, yaitu
supernatan pada bagian atas dan pelet pada bagian bawah. Presipitasi merupakan
langkah yang dilakukan untuk mengendapkan suatu komponen dari campuran (Albert,
1994).

DNA pada makhluk hidup dapat diisolasi secara sederhana. Pengisolasian

DNA secara sederhana dapat dilakukan dengan memecahkan dinding sel, membran
plasma dan membran inti baik secara mekanik maupun secara kimiawi. Isolasi DNA
merupakan suatu teknik yang digunakan untuk memperoleh DNA murni, yaitu tanpa
protein dan RNA dari suatu sel dalam jaringan. Pemecahan dinding sel secara
mekanik dapat dilakukan dengan pemblenderan atau penggerus menggunakan mortar
dan pistil. Sedangkan secara kimiawi dapat dilakukan dengan pemberian detergen.
Penambahan sabun cair dan garam dapur adalah untuk melisiskan membran inti untuk
mengeluarkan isi inti sel yang berisi DNA (Rachmat, 2012). Isolasi DNA dapat
dilakukan melalui tahapan-tahapan antara lain: preparasi ekstrak sel, pemurnian DNA
dari ekstrsk sel dan presipitasi DNA. Meskipun isolasi DNA dapat dilakukan dengan
berbagai cara, akan tetapi pada setiap jenis atau bagian tanaman dapat memberikan
hasil yang berbeda, hal ini dikarenakan adanya senyawa polifenol dan polisakarida
dalam konsentrasi tinggi yang dapat menghambat pemurnian DNA. Jika isolasi DNA
dilakukan dengan sample buah, maka kadar air pada masing-masing buah berbeda,
dapat memberi hasil yang berbeda-beda pula. Semakin tinggi kadar air, maka sel yang
terlarut di dalam ekstrak akan semakin sedikit, sehingga DNA yang terpretisipasi juga
akan sedikit (Kirsman, 2010).

9
2.3 Vektor DNA

Vektor merupakan molekul DNA yang membawa suatu DNA asing kedalam
sel inang, dengan harapan sifat yang ada pada DNA asing tersebut dapat terekspresi
dalam sel inang. Salah satu vektor yang bisa digunakan untuk membawa molekul
DNA asing masuk dalam sel inang adalah plasmid. Plasmid digunakan untuk
melakukan rekayasa pada berbagai organisme yang tidak bisa diperoleh secara alami.
Rekayasa ini dilakukan pada tingkat genetik sehingga disebut sebagai rekayasa
genetika.

Plasmid adalah molekul DNA sirkuler (lingkaran tertutup) yang berantai

ganda dan dapat bereplikasi sendiri di luar kromosom dan tidak mengandung gen-gen
esensial. Plasmid terdapat secara alami maupun sudah mengalami modifikasi yang
disesuaikan dengan keperluan manipulasi genetik. Plasmid terdapat pada organisme
prokariot maupun eukariot. Plasmid inilah yang berfungsi sebagai pembawa sifat
rekombinan pada organisme yang akan direkayasa. Plasmid memilki ciri-ciri antara
lain :

a. Berbentuk lingkaran tertutup dan untaiannya ganda (double stranded)

b. Dapat melakukan replikasi sendiri di luar kromosom inti

c. Terdapat di luar kromosom

d. Secara genetik dapat ditransfer secara stabil

Agar dapat digunakan sebagai vektor, plasmid harus memiliki syarat-syarat

diantaranya sebagai berikut :

a. ukurannya relatif kecil dibanding dengan pori dinding sel inangnya

b. mempunyai sekurang-kurangnya 2 gen marker yang dapat menandai masuk

tidaknya plasmid ke dalam sel inang

c. mempunyai tempat pengenalan restriksi sekurang-kurangnya di dalam salah satu

marker yang dapat digunakan sebagai tempat penyisipan fragmen DNA asing

d. memiliki titik awal replikasi sehingga dapat melakukan replikasi dalam sel inang

Menurut tujuan penggunaannya, plasmid dibedakan menjadi 2 yaitu :

10
a. plasmid untuk kloning prokariot, sebagai contoh adalah plasmid pUC 19 dan pBR
322

b. plasmid yang digunakan untuk kloning eukariot yang digunakan adalah plasmid
Ti

B. Kegunaan plasmid

Plasmid digunakan sebagai vektor dalam rekayasa genetika. Dalam hal ini
plasmid digunakan untuk membawa suatu rangkaian fragmen DNA asing masuk
dalam sel inang dengan harapan plasmid rekombinan itu mengalami replikasi dan
mengekspresikan sifat baru pada DNA asing tersebut, sehingga sifat yang diinginkan
dapat diperoleh dari plasmid rekombinan tersebut.

C. Proses penggunaan plasmid di dalam rekayasa genetika

Penggunaan plasmid untuk rekayasa genetika harus disesuaikan kebutuhannya

sebab ada berbagai macam plasmid yang digunakan. Proses penggunaan plasmid
dalam rekayasa genetika melalui langkah-langkah sebagai berikut :

1. Penentuan terlebih dahulu jenis plasmid yang hendak digunakan sebab ada
beberapa jenis plasmid seperti pBR 322 dan pUC19 yang bisa digunakan untuk
prokariot dan plasmid Ti yang bisa digunakan untuk organisme eukariot

2. Bila plasmid telah ditentukan maka selanjutnya adalah menentukan tempat

pengenalan enzim restriksi (pemotongan) yang hendak digunakan sebagai tempat
penyisipan DNA asing dan marker untuk menandai masuk tidaknya plasmid pada sel
inang

3. Apabila telah diketahui tempat pengenalan restriksi dan markernya maka langkah
selanjutnya adalah menyiapkan enzim restriksi sebagai pemotong plasmid. Enzim
yang digunakan untuk memotong plasmid harus sama dengan pemotong DNA asing
sehingga nanti keduanya bisa bersatu misal : EcoR1

4. Langkah selanjutnya adalah plasmid dipotong dengan enzim restriksi yang sesuai
pada daerah potongannya

5. Plasmid siap disambungkan dengan DNA asing yang memiliki sifat tertentu, yang
telah dipotong juga dengan enzim restriksi yang sama dengan pemotong plasmid

11
D. Enzim restriksi sebagai pemotong plasmid

Untuk memotong plasmid digunakan enzim restriksi. Enzim restriksi adalah

enzim yang digunakan untuk memotong DNA secara spesifik. Enzim restriksi disebut
sebagai gunting biologi. Enzim ini diisolasi dari bakteri. Restriksi yang digunakan
untuk memotong plasmid harus sama dengan pemotong DNA asing agar urutan
basanya bisa sesuai sehingga antara plasmid dan DNA asing yang disisipkan
bisa bersatu. Prinsip kerja enzim restriksi adalah:

1. Enzim restriksi yang digunakan adalah enzim endonuklease restriksi. Enzim

pemotong ini mengenali DNA pada situs kusus dan memotong pada situs tersebut

2. Situs pengenalan enzim restriksi adalah daerah yang simetri dengan poliandrom,
artinya bila kedua utas DNA tersebut masing-masing dibaca dengan arah yang sama
akan memberikan urutan yang sama pula nukleotidanya

3. Pemotongan enzim restriksi akan menghasilkan potongan yaitu ujung kohesif

(sticky end) dan ujung rata (blunt end).

Enzim Ligase sebagai penyembung plasmid dengan DNA asing

Enzim ligase adalah enzim yang berfungsi untuk menyambung dua ujung potongan
DNA. Enzim ligase yang sering digunakan adalah DNA ligase dari E. Coli dan DNA
ligase dari Fage T4. Prinsip kerja enzim ligase sebagai berikut:

1. Enzim ligase menyambung dua ujung DNA yang semulanya terpotong

2. Penyambungan dilakukan dengan cara menyambung 2 ujung DNA melalui ikatan

kovalen antara ujung 3’OH dari utas satu dengan ujung 5’P dari utas yang lain

3. Penggunaan ligasi DNA ini mengkatalis ikatan fosfodiester antara kedua ujung
DNA sehingga kedua fragmen DNA yang berupa potongan bisa bersatu menjadi satu.

F. Pemotongan dan penyambungan plasmid dan DNA asing sehingga dihasilkan

Plasmid Rekombinan

Untuk menciptakan plasmid rekombinan yang mengandung sifat DNA asing

tertentu yang dilakukan adalah dengan menyambung DNA asing tersebut dengan
plasmid yang ada. Plasmid rekombinan terbentuk sebagai sambungan antara plasmid

12
dengan DNA asing, sehingga plasmid tersebut mengandung sifat tertentu yang telah
disesuaikan dengan kebutuhan. Secara sederhana prosedur untuk menciptakan
plasmid rekombinan dapat dilakukan sebagai berikut:

1. Menyiapkan bakteri yang mengandung DNA asing dengan sifat tertentu

2. Menyiapkan plasmid yang akan digunakan sebagai vektor

3. Pemotongan DNA asing dengan sifat yang dibutuhkan dengan enzimrestriksi

semisal dari E. coli

4. Pemotongan plasmid yang akan digunakan sebagai vektor dengan enzim restriksi
yang sama yaitu E. Coli

5. Hasil potongan DNA dengan sifat tertentu disambungkan pada plasmid dngan
menggunakan enzim penyambung yaitu DNA ligase. DNA ligase akan mengikat
ujung 3’OH dengan ujung 5’P dan membentuk ikatan fosfodiester sehingga plasmid
dan DNA asing dengan sifat tertentu bisa bersatu

6. Terbentuklah plasmid rekombinan yang membawa DNA asing dengan sifat

tertentu tersebut. Plasmid ini siap ditransfer ke dalam sel inang untuk memperoleh
organisme transgenik.

2.4 Transformasi DNA

Transformasi DNA merupakan salah satu metode untuk memasukkan DNA ke

dalam sel bakteri (Cowell & Austin 1997). Metode ini sekarang secara luas dipakai
untuk mentransfer plasmid kecil dari satu galur bakteri ke galur lainnya
(Hanahan 1983). Prinsip dari transformasi adalah dengan ekstraksi DNA
dari sel donor, kemudian dicampur dengan sel resipien yang telah
dibuat rentanterhadap masuknya molekul DNA melalui pori atau saluran dalam
dinding dan membran sel (Cowell & Austin 1997).

Transformasi adalah proses masuknya molekul DNA asing dalam protoplas

atau sel inang yang mengakibatkan perubahan materi genetika (Gillian dkk., 2010).

Transformasi pada kapang dapat dilakukan dengan cara transformasi protoplas

dengan penambahan larutan polietilenglikol, elektroporasi, tranformasi dengan
bantuan Agrobacterium tumefaciens, dan particle bombardment. Pada Penelitian ini

13
plasmid pTRLI akan ditransformasikan dengan teknik transformasi elektroporasi.
Beberapa kapang yang telah berhasil ditransformasi dengan elektroporasi diantaranya:
Neurospora crassa (Chakraborty dan Kapoor, 1990); Epichloe typhina(Dombrowski
dkk., 2011) Tyromyces palustris, coriolus versicolor (Furuno dkk.,
1994);Thermomyces lanuginosus (Gangavaram dkk., 2009); Pleurotus ostreatus (Jing
dkk., 2002); Lentinula edodes (Kuo dkk., 2008)

Transformasi DNA merupakan salah satu metode untuk memasukkan DNA ke

dalam sel bakteri. Metode transformasi ini pertama kali dikembangkan untuk
memindahkan sifat-sifat genetika yang membawa kenyataan bahwa DNA adalah
bahan genetika. Meskipun transformasi telah dieksploitasi untuk mempelajari pautan
gen pada berbagai organisme, metode ini sekarang secara luas dipakai untuk
mentransfer plasmid-plasmid kecil dari satu galur bakteri ke galur lainnya. Prinsip
dari transformasi adalah dengan ekstraksi DNA dari sel donor, kemudian dicampur
dengan sel resipien yang telah dibuat rentan terhadap masuknya molekul DNA
melalui pori atau saluran dalam dinding dan membran sel (Lodishet al 2000).

Setiap sel termasuk bakteri memiliki sistem pertahanan diri terhadap benda
asing termasuk DNA. Jika sel bakteri menemukan adanya DNA asing, maka enzim
restriksi sebagai penjaga benteng akan memotong-motong DNA tersebut hingga
menjadi pendek dan tak berfungsi lagi. Agar DNA plasmid yang ditransformasi tidak
dicincang oleh enzim restriksi, maka ia harus memiliki bagian yang dinamakan ori
atau origin of replication yang dikenali oleh bakteri yang bersangkutan. Ori ini
berfungsi mengelabui bakteri agar tidak menganggapnya sebagai DNA asing. Ori juga
merupakan signal agar bakteri tersebut melakukan replikasi DNA plasmid secara
independen seiring dengan replikasi DNA genomnya (Wibowo 2002).

Untuk membedakan antara bakteri yang sudah dimasuki DNA plasmid dan
yang tidak, umumnya digunakan seleksi antibiotik. Umumnya bakteri tidak dapat
hidup pada media yang mengandung antibiotik. Untuk itu pada DNA plasmid yang
kita transformasikan harus ada gen penyandi antibiotik resisten agar bakteri hostnya
menjadi tahan hidup di media yang mengandung antibiotik. Jadi, bakteri yang tidak
berhasil disusupi oleh plasmid akan mati dengan sendirinya(Sambrook&Russel 2001).

Untuk membedakan antara bakteri yang plasmidnya memiliki insert atau tidak.
Insert biasanya disisipkan di pertengahan gen lacZ yang merupakan penyandi enzim

14
ß-galactosidase. Enzim ini dapat memecah substrat X-gal (suatu galaktosa yang
dimodifikasi) menjadi galaktosa dan pre-chromophore 5-bromo-4-chloro-3-
hydroxyindole, yang selanjutnya dioksidasi menjadi 5,5′-dibromo-4,4′-dichloro-
indigo yang berwarna biru. Jika gen LacZinimasihutuh, maka koloni bakteri akan
berwarna biru akibat pengaruh zat warna indigo yang dihasilkan. Tetapi jika insert
berhasil disisipkan (diligasikan) dengan vektor, sehingga gen lacZ-nya akan
terdisrupsi (rusak) dan ujung-ujungnya tidak mampu menghasilkan indigo yang
berwarna biru, sehingga koloni bakteri akan berwarna putih. Jadi hanyakoloni putih
yang tumbuh pada media yang mengandung antibiotik dan X-Gal saja yang
kemungkinan mengandung gen yang kita transformasikan. Inilah yang dinamakan
seleksi biru-putih (Sambrook&Russel 2001).

2.5 Seleksi Transforman

Seleksi transforman dan seleksi rekombinan. Cara seleksi sel transforman akan
diuraikan lebih rinci pada penjelasan tentang plasmid. Pada dasarnya ada
tiga kemungkinan yang dapat terjadi setelah transformasi dilakukan, yaitu sel inang
tidak dimasuki DNA apa pun atau berarti transformasi gagal,sel inang dimasuki
vektor religasi atau berarti ligasi gagal, dan sel inang dimasuki vektor rekombinan
dengan atau tanpa fragmen sisipan atau gen yang diinginkan. Untuk membedakan
antara kemungkinan pertama dan kedua dilihat perubahan sifat yang terjadi pada sel
inang. Jika sel inangmemperlihatkan dua sifat marker vektor, maka dapat
dipastikan bahwa kemungkinan kedualah yang terjadi. Seleksi sel rekombinan yang
membawa fragmen yang diinginkan dilakukan dengan mencari fragmen tersebut
menggunakan fragmen pelacak yang pembuatannya dilakukan secara in
vitro menggunakan teknik reaksi polimerisasi berantai atau polymerase chain
reaction .

Rekombinasi memiliki tiga mekanisme dasar dalam menjalani prosesnya.

Yaitu transformasi, konjugasi dan transduksi. Transformasi merupakan transfer DNA
telanjang yang umumnya berasal dari satu sel bakteri ke dalam sel yang berbeda.
Prosesnya adalah ketika sebuah sel bakteri pecah atau lisis maka DNA sirkular akan
terlepas ke lingkungan. Efisiensi transformasi bergantung pada kompetensi sel.
Konjugasi merupakan pemindahan materi genetik berupa plasmid secara langsung
melalui kontak sel dengan membentuk struktur seperti jembatan diantara dua sel

15
bakteri yang berdekatan. Umumnya terjadi pada bakteri gram negatif.
Sedangkan transduksi merupakan transfer materi genetik dari satu bakteri ke bakteri
lainnya dengan menggunakan virus bakteri sebagai vektor. Transfer ini menggunakan
prinsip dasar dari galur donor yang menyediakan DNA bagi galur resipien. Perbedaan
utamanya dengan transfer DNA lainnya adalah DNA ditransfer melalui
perantaraan bakteriofag. Terdapat beberapa jenis teknologi rekombinasi yang sedang
berkembang saat ini, diantaranya adalah:

1. Homologous recombination

 Meningkatkan keragaman
 Menjaga integritas genome (DNA repair)

2. Site-specific recombination

 Termasuk non homolog bagian DNA rekombinasi di bagian spesifik.

 Fragmen DNA bergabung kembali untuk membuat kombinasi baru
 Fragmen yang menyediakan lokasi tertentu dimana akan terjadinya
rekombinasi dan integrasih genom virus Immunoglobulin gen _ DNA splicing

3. Transposition

 Bagian terkecil DNA (transposons) yang dapat bergerak sendiri untuk

beberapa lokasi dalam kromosom inang DNA.
 Integrasi segmen kecil dari DNA ke dalam kromosom
 Terjadi di lokasi yang berbeda dalam genom segmen DNA.

16
 BAB III
PENUTUP

A. Kesimpulan

Kloning berasal dari kata ‘Clone” yang diturunkan dari bahasa Yunani “Klon”
yang artinya potongan yang digunakan untuk memperbanyak tanaman. Kloning
adalah langkah penggandaan (pembuatan tiruan yang sama persis) dari suatu makhluk
hidup dengan menggunakan kode DNA makhluk tersebut.

B. Saran
Orang yang melakukan kloning sebaiknya dilakukan oleh suami istri yang sah,
yang mana sama sekali tidak bisa memiliki keturunan. Dengan melakukan kloning.
Sebelum melakukan kloning sebaiknya pasangan suami istri mengkonsultasikannnya
dengan dokter.

17
 DAFTAR PUSTAKA

Wibowo M. 2002. Tranformasi fragmen DNA kromosom Xanthomonas

campestriskedalamEscherichia coli. J Makara Sains6(1): 21-24.

Balajee, M.S., 2009, Aspergillus terreus complex, Medical Mycology, 47: S42 – S46.

Chakraborty B.N. and M. Kapoor, 1990, Transformation of Filamentpus Fungi by

Electroporation, Nucleic Acids Research, 18 (22): 6737.

Dombrowski, J. E., J.C. Baldwin, S.C. Alderman, and R.C. Martin, 2011, Transformation of
Epichloe typhina by Electroporation of Conidia, BMC Research Notes, 4:46 1-7.

Lodish H, Arnold B, Lawrence Z, Paul M, David B. 2000. Molecular Cell Biology. New
York: Wh Freeman Company

Pasternak JJ, Bernard RG. 2003. Molecular Biotechnology: Principle and Appplication of
Recombinant DNA. Washington DC: ASM Press.

Sambrook J,Russel DW. 2001. Molecular Cloning: A Laboratory Manual 3rd Ed. New York:
Cold Spring Harbor Laboratory Press.

18