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Protocolos utilizados.

Protocolo de pasaje celular (subcultivo).

Para el caso de T-75 el procedimiento a seguir es:

1. Se extrae utilizando una pipeta pasteur estéril con ayuda de una bomba
peristáltica el medio de cultivo del t-flask.
2. Se agregan 5 [mL] de PBS.
3. Se extrae el PBS, que se utiliza para lavado, utilizando una pipeta pasteur
estéril con ayuda de una bomba peristáltica.
4. Se agrega 1 [mL] de EDTA-Tripsina 1:100 en PBS.
5. Y se deja incubando a 37°C entre 3 a 5 minutos.
6. Se detiene la tripsinación agregando 23 [mL] de medio al 10% FBS (para
completar los 24 [mL]). Con mucho cuidado utilizando la pipeta se
homogeniza el medio.
7. Si se están cultivando las células en un medio bajo al 10% FBS el medio
con células se introducen en un tubo de centrífuga de 50 [mL] y se
centrifugan por 7 min a 10.000 RPM (Centrífuga Boeco C-28, rotor 1619).En
el caso de estar trabajando con un medio al 10% FBS se saltan los pasos
7 y 8.
8. Se elimina el medio y se resuspenden en 23 [mL] del medio en el que se
están cultivando.
9. Se tienen 2 T-75 previamente marcados para realizar el pasaje. A cada uno
de estos t-flask se les agregan 8 [mL] desde el t-flask que contiene 24 [mL]
o el tubo de centrífuga de 50 [mL] (en el caso de estar cultivándolas en un
medio con un suplemento menor a 10 % de FBS).
10. Finalmente se agregan 16 [mL] de medio a cada t-flask (completando los 24
[mL] de medio) y se dejan en incubadora a 37°C con 5% de CO2. No olvidar
marcar en el t-flask original el cambio de pasaje.

Para el caso de Spinner el procedimiento a seguir es:

1. Se extrae el medio con células se introducen en un tubo de centrífuga de 50


[mL] y se centrifugan por 7 min a 10.000 RPM (Centrífuga Boeco C-28, rotor
1619), se elimina el sobrenadante y se vuelve a llenar el tubo hasta
completar todo el medio del Spinner.
2. Se resuspenden en medio fresco de entre 20 y 40 mL.
3. Se cuentan las células totales y viables (ver protocolo a continuación).
4. Se resuspenden en un nuevo Spinner con medio fresco a una
concentración de aproximadamente 3,5x105 [cels/mL], con 900 [uL] de
Pluronic F68 a 90 [g/L] por cada 100 mL de medio fresco.
Es importante realizar todo el procedimiento bajo campana de flujo laminar
en estrictas condiciones de esterilidad. Además de todos los reactivos a utilizar
dejarlos previamente en un baño a 37°C para no causar estrés a las células.

Protocolo de congelamiento celular.

Para el caso de T-75 y células HEK 293.Se comienza realizando los pasos
1 a 7 (incluso si se está trabajando con un medio al 10% FBS) de protocolo
anterior, luego

8. Se elimina el sobrenadante y se resuspende en 2 [mL] de medio de cultivo


igual al que se está utilizando para crecimiento pero suplementado con un
10% de DMSO estéril.
9. Se utilizan 2 tubos para congelar con capacidad de 1,8 [mL] cada uno. Se
agrega 1 [mL] a cada tubo.
10. Se dejan inmediatamente los tubos en hielo (4°C) y luego se dejan por 24
horas a -80°C.
11. Pasadas las 24 horas se dejan en nitrógeno líquido.

Para el caso células HEK 293 creciendo en suspensión .Se comienza


realizando el paso 1 de protocolo anterior, luego

2. Se elimina el sobrenadante y se resuspende en un volumen tal de dejar


aproximadamente 1x107 [cel/mL] , en medio de cultivosuplementado al
10%FBS y 10% de DMSO estéril.
3. Se utilizan tubos para congelar con capacidad de 1,8 [mL] cada uno. Se
agrega 1,5 [mL] a cada tubo.
4. Se dejan inmediatamente los tubos en hielo (4°C) y luego se dejan por 24
horas a -80°C.
5. Pasadas las 24 horas se dejan en nitrógeno líquido.

Es recomendable después de 24 horas congeladas las células en nitrógeno


líquido, elegir un tubo al azar y descongelarlo para hacer un análisis de viabilidad.

Protocolo de descongelamiento desde nitrógeno líquido.

Para células HEK 293 congeladas en tubos de 1,5 [mL] en nitrógeno


líquido. Se debe realizar el siguiente procedimiento:

1. Se deja el tubo de 1,5 [mL] en baño a 37°C por 5 minutos.


2. Se aumenta el volumen con medio fresco tibio a 2 [mL]
3. Se deja 5 minutos en baño a 37°C.
4. Se en pone tubo de centrífuga de 15 [mL].
5. Se agrega lentamente 2 [mL] de medio tibio y se mezcla por inversión.
6. Se deja 5 minutos más en baño de 37°C.
7. Se agrega medio hasta doblar el volumen.
8. Se deja 5 minutos en baño a 37°C.
9. Luego se agrega medio hasta duplicar el inicial en el tubo. Invertir para
mezclar.
10. Se pasan las células a T-75 y se agrega medio tibio hasta completar los 24
[mL] dentro del t-flask.

Protocolo del cálculo de concentración celular y viabilidad para células


creciendo adheridas.

Para el caso de T-25 y células HEK 293:

1. Se extrae utilizando una pipeta pasteur estéril con ayuda de una bomba
peristáltica el medio de cultivo del t-flask.
2. Se agregan 2 [mL] de PBS.
3. Se extrae el PBS, que se utiliza para lavado, utilizando una pipeta pasteur
estéril con ayuda de una bomba peristáltica.
4. Se agregan 0,5 [mL] de Tripsina 1:100 en PBS.
5. Y se deja incubando a 37°C entre 3 a 5 minutos.
6. Se detiene la tripsinación agregando 2 [mL] de medio al 10% FBS. Con
mucho cuidado utilizando la pipeta estéril se homogeniza el medio.
7. Se extraen 100 [µL] y se guardan en un tubo eppendorf de 1,5 [mL]; se
agregan 100 µL de Trypan Blue al 0,1% y se homogenizan pipeteando
suavemente.
8. Se agregan 20 [µL] de la mezcla anterior en un hemocitómetro y bajo un
microscopio se cuentan tanto las células vivas como las muertas (las
muestras se visualizan azules y las vivas blancas).
9. Y se calcula la concentración celular:

Dilución
N °céluas = contadas ´ ´ 10.000
8

En este caso la dilución es 2.

Y la viabilidad corresponde a la razón entre las células vivas y las células


totales (suma entre vivas y muertas).

Cuando se está siguiendo el crecimiento celular el protocolo se realiza una


o dos veces al día por el total de días que las células presentan una viabilidad
mayor o igual al 50%. Para el caso de células HEK 293 creciendo adheridas en
medio DMEM/F12 suplementado al 10% con FBS corresponden a
aproximadamente 12 días. Y en suspensión a aproximadamente 8 días.
Protocolo de cálculo de concentración celular y viabilidad para células
creciendo en suspensión en medio libre de suero.

1. Mediante una pipeta estéril se extrae una muestra del cultivo agitado de 2
[mL], y se divide en dos tubos Eppendorf de 1,5 [mL], depositando 1 [mL] en
cada uno.
2. Ambos tubos se centrifugan por 7 minutos a 1.000 RPM.
3. Los sobrenadantes se guardan en otros tubos para futuras cuantificaciones
de metabolitos; y en un tubo se agregan 100 [uL] de tripsina 1:50 y en el
otro 1 mL de cristal violeta.
4. El con tripsina se incuba por 30 minutos a 37°C con agitación ocasional.
5. El con cristal violeta se mezcla un minuto en vortex para romper las células
y permitir que el colorante llegue a los núcleos celulares.
6. Se agregan 20 [µL] de la mezcla anterior en un hemocitómetro y bajo un
microscopio se cuentan los núcleos de dos cuadrantes.
7. Y se calcula la concentración de células:

Dilución
N °céluas = contadas ´ ´ 10.000
2
8. En el tubo con Tripsina, pasados los 30 minutos con micropipeta de 200
[µL] se resuspende el pellet eliminando las acumulaciones celulares.
9. Las células se centrifugan 7 minutos a 1.000 RPM (Centrífuga Boeco C-28,
rotor 1619).
10. Se elimina el sobrenadante y el pellet se resuspende en 1 [µL] de medio
suplementado al 10%FBS.
11. Se cuentan en hemocitometro y se realizan los mismos cálculos que en el
protocolo de cálculo de concentración celular y viabilidad para células
creciendo adheridas.

Protocolo de cálculo de concentración celular y viabilidad para células


creciendo en microcarriers.

1. Mediante una pipeta estéril se extrae una muestra del cultivo agitado de 2
[mL], y se divide en dos tubos Eppendorf de 1,5 [mL], depositando 1 [mL] en
cada uno.
2. Se dejan decantar los microcarriers, se extrae el máximo posible de
sobrenadante.
3. Los sobrenadantes se guardan en otros tubos para futuras cuantificaciones
de metabolitos; y en un tubo se agrega 1 [mL] de cristal violeta y con este
se procede de la misma manera que para cuantificación de células
creciendo en suspensión.
4. El otro se lava con 1 [mL] de PBS, se deja sedimentar nuevamente y se
remueve el sobrenadante.
5. Se agrega 1 [mL] de solución de tripsina 1:50 y se incuba por 30 minutos a
37°C con agitación ocasional.
6. Los microcarriers decantan y el sobrenadante se transfiere a otro tubo
eppendorf de 1,5 [mL].
7. Los microcarriers se lavan con 2 [mL] de medio suplementado al 10% FBS
y el sobrenadante se junta con el sobrenadante del punto anterior.
8. Las células que se encuentran en los sobrenadantes se centrifugan 5
minutos a 500 RPM (Centrífuga Boeco C-28, rotor 1619).
9. Se elimina el sobrenadante y el pellet se resuspende en 200 [µL] de medio
+ 200 [µL] de Trypan-Blue.
10. Se cuentan en hemocitometro y se realizan los mismos cálculos que en el
protocolo de cálculo de concentración celular y viabilidad para células
creciendo adheridas.

Protocolo de cuantificación de Glucosa.

Para cuantificar glucosa se utiliza el kit “Labkit GLUCOSE GOD-PAP”. Los


pasos a seguir son:

1. Se preparan los reactivos: disolviendo el reactivo 2 en el reactivo 1. Esta


solución monorreactiva es estable hasta la fecha indicada en la etiqueta a
2-8ºC y protegida de la luz. ( el reactivo 1 corresponde a un buffer y el 2 a la
solución enzimática)
2. Se utiliza glucosa a 5 [g/L] en agua destilada como estándar.
3. Se prepara un blanco con 2 [mL] de reactivos.
4. Se prepara un estándar con 20 [µL] de glucosa y 20 [mL] de reactivo.
5. Se prepara la muestra con 20 [µL] de muestra y 2 [mL] de reactivo.
6. Todas mezclas anteriores se incuban 10 minutos a 37°C a temperatura
ambiente.
7. Se mide la absorbancia a 505 nm (490-550) contra el blanco. (El color es
estable por 30 minutos).
8. Se calcula la concentración de Glucosa:

Abs.muestra
Glu cos a[mg / dL] = ´ cocentración _ de _ estándar
Abs.estándar

[mg/dL] x 0,0555 = [mmol/L]

Si la concentración de glucosa es mayor a 500 [mg/dL] se debe diluir la


muestra con solución salina y repetir el procedimiento.

Protocolo de cuantificación de lactato.

1. Se prepara un reactivo de uso: se mezclan 4 partes de R1 más una parte


de R2 (por ejemplo 12 mL R1 más 3 mL R2). El reactivo de uso se puede
emplear durante 14 días a una temperatura de 2 a 8 °C
2. Se mezclan 10 [µL] de muestra con 1 [mL] de reactivo de uso en una
cubeta de espectrofotómetro de 2 [mL].
3. La mezcla se deja incubar 5 minutos a 37ºC.
4. Dentro de los 30 minutos siguientes se debe leer la absorbancia a 340 nm.
5. Como blanco se utiliza agua. Por lo tanto, para el cero del
espectrofotómetro se introduce agua a la cubeta y se mide absorbancia a
340 nm.
6. Cálculo de concentración de lactato:

Abs.muestra
Lactato[mg / dL] = ´ cocentración _ de _ estándar
Abs.estándar

[mmol/L] x 9,01 = [mg/dL] Lactato.

Protocolo de tinción con MTT.

Se realiza la tinción con MTT para visualizar las células adheridas a los
microcarriers. Los pasos a seguir son:

1. Utilizando una pipeta estéril se extrae 1 [mL] de muestra del cultivo agitado
en un tubo Eppendorf de1,5 [mL].
2. Se deja decantar.
3. Se descarta el sobrenadante y se lavan los microcarriers con 1 [mL] de
PBS.
4. Sedimentan los microcarriers nuevamente y se remueve el sobrenadante,
hasta dejar 400 [µL] de pellet.
5. Se mezcla con 400 [µL] de solución MTT, esta mezcla se incuba a 37 ºC
con agitación ocasional entre 5 a 10 minutos (en este tiempo es posible
detectar los microcarriers como pequeños puntos azules a simple vista.)
6. A continuación se observan las células viables sobre los microcarriers
esparciendo una gota de esta solución sobre un porta-objeto en el
microscopio de contraste de fase utilizando un objetivo 20X.

Microcarrier Culture Counting Stain


Crystal Violet (0.1% wt) in Citric Acid (0.1M)
Materials:
1. 500 mL media bottle, non-sterile
2. citric acid (caution: not salt of citrate)
3. crystal violet
4. 1 pair gloves
5. distilled water
Procedure:
1. Make 0.1M citric acid (MW 210.14) (H3C6H5O7-H2O) in a beaker
a. 2.1 g citric acid (one hydrated water)
b. 100 mL water
2. Make 0.1% (wt) crystal violet solution (wear gloves)
a. 0.1 g crystal violet
b. 100 mL 0.1 M citric acid from step one
3. Stir with magnetic stirrer
4. If crystal violet is not completely dissolved, filter out the undissolved crystal
violet with filter paper)
5. Transfer to 100 mL storage bottle
Note: clean up any crystal violet stains with ethanol

Fixative Stain
Crystal violet 0.5% in Ethanol 40% and PBS 60%
Materials:
1. 500 mL media bottle, non-sterile
2. Crystal Violet powder
3. Absolute Ethanol (95% in water) Note: may substitute methanol
4. 1X PBS
5. 1 pair gloves

Procedure:
1. Combine the following:
a. 40 mL ethanol
b. 60 mL PBS
c. 0.5 g crystal violet (in 100 mL ethanol/PBS solution)