1. Se extrae utilizando una pipeta pasteur estéril con ayuda de una bomba
peristáltica el medio de cultivo del t-flask.
2. Se agregan 5 [mL] de PBS.
3. Se extrae el PBS, que se utiliza para lavado, utilizando una pipeta pasteur
estéril con ayuda de una bomba peristáltica.
4. Se agrega 1 [mL] de EDTA-Tripsina 1:100 en PBS.
5. Y se deja incubando a 37°C entre 3 a 5 minutos.
6. Se detiene la tripsinación agregando 23 [mL] de medio al 10% FBS (para
completar los 24 [mL]). Con mucho cuidado utilizando la pipeta se
homogeniza el medio.
7. Si se están cultivando las células en un medio bajo al 10% FBS el medio
con células se introducen en un tubo de centrífuga de 50 [mL] y se
centrifugan por 7 min a 10.000 RPM (Centrífuga Boeco C-28, rotor 1619).En
el caso de estar trabajando con un medio al 10% FBS se saltan los pasos
7 y 8.
8. Se elimina el medio y se resuspenden en 23 [mL] del medio en el que se
están cultivando.
9. Se tienen 2 T-75 previamente marcados para realizar el pasaje. A cada uno
de estos t-flask se les agregan 8 [mL] desde el t-flask que contiene 24 [mL]
o el tubo de centrífuga de 50 [mL] (en el caso de estar cultivándolas en un
medio con un suplemento menor a 10 % de FBS).
10. Finalmente se agregan 16 [mL] de medio a cada t-flask (completando los 24
[mL] de medio) y se dejan en incubadora a 37°C con 5% de CO2. No olvidar
marcar en el t-flask original el cambio de pasaje.
Para el caso de T-75 y células HEK 293.Se comienza realizando los pasos
1 a 7 (incluso si se está trabajando con un medio al 10% FBS) de protocolo
anterior, luego
1. Se extrae utilizando una pipeta pasteur estéril con ayuda de una bomba
peristáltica el medio de cultivo del t-flask.
2. Se agregan 2 [mL] de PBS.
3. Se extrae el PBS, que se utiliza para lavado, utilizando una pipeta pasteur
estéril con ayuda de una bomba peristáltica.
4. Se agregan 0,5 [mL] de Tripsina 1:100 en PBS.
5. Y se deja incubando a 37°C entre 3 a 5 minutos.
6. Se detiene la tripsinación agregando 2 [mL] de medio al 10% FBS. Con
mucho cuidado utilizando la pipeta estéril se homogeniza el medio.
7. Se extraen 100 [µL] y se guardan en un tubo eppendorf de 1,5 [mL]; se
agregan 100 µL de Trypan Blue al 0,1% y se homogenizan pipeteando
suavemente.
8. Se agregan 20 [µL] de la mezcla anterior en un hemocitómetro y bajo un
microscopio se cuentan tanto las células vivas como las muertas (las
muestras se visualizan azules y las vivas blancas).
9. Y se calcula la concentración celular:
Dilución
N °céluas = contadas ´ ´ 10.000
8
1. Mediante una pipeta estéril se extrae una muestra del cultivo agitado de 2
[mL], y se divide en dos tubos Eppendorf de 1,5 [mL], depositando 1 [mL] en
cada uno.
2. Ambos tubos se centrifugan por 7 minutos a 1.000 RPM.
3. Los sobrenadantes se guardan en otros tubos para futuras cuantificaciones
de metabolitos; y en un tubo se agregan 100 [uL] de tripsina 1:50 y en el
otro 1 mL de cristal violeta.
4. El con tripsina se incuba por 30 minutos a 37°C con agitación ocasional.
5. El con cristal violeta se mezcla un minuto en vortex para romper las células
y permitir que el colorante llegue a los núcleos celulares.
6. Se agregan 20 [µL] de la mezcla anterior en un hemocitómetro y bajo un
microscopio se cuentan los núcleos de dos cuadrantes.
7. Y se calcula la concentración de células:
Dilución
N °céluas = contadas ´ ´ 10.000
2
8. En el tubo con Tripsina, pasados los 30 minutos con micropipeta de 200
[µL] se resuspende el pellet eliminando las acumulaciones celulares.
9. Las células se centrifugan 7 minutos a 1.000 RPM (Centrífuga Boeco C-28,
rotor 1619).
10. Se elimina el sobrenadante y el pellet se resuspende en 1 [µL] de medio
suplementado al 10%FBS.
11. Se cuentan en hemocitometro y se realizan los mismos cálculos que en el
protocolo de cálculo de concentración celular y viabilidad para células
creciendo adheridas.
1. Mediante una pipeta estéril se extrae una muestra del cultivo agitado de 2
[mL], y se divide en dos tubos Eppendorf de 1,5 [mL], depositando 1 [mL] en
cada uno.
2. Se dejan decantar los microcarriers, se extrae el máximo posible de
sobrenadante.
3. Los sobrenadantes se guardan en otros tubos para futuras cuantificaciones
de metabolitos; y en un tubo se agrega 1 [mL] de cristal violeta y con este
se procede de la misma manera que para cuantificación de células
creciendo en suspensión.
4. El otro se lava con 1 [mL] de PBS, se deja sedimentar nuevamente y se
remueve el sobrenadante.
5. Se agrega 1 [mL] de solución de tripsina 1:50 y se incuba por 30 minutos a
37°C con agitación ocasional.
6. Los microcarriers decantan y el sobrenadante se transfiere a otro tubo
eppendorf de 1,5 [mL].
7. Los microcarriers se lavan con 2 [mL] de medio suplementado al 10% FBS
y el sobrenadante se junta con el sobrenadante del punto anterior.
8. Las células que se encuentran en los sobrenadantes se centrifugan 5
minutos a 500 RPM (Centrífuga Boeco C-28, rotor 1619).
9. Se elimina el sobrenadante y el pellet se resuspende en 200 [µL] de medio
+ 200 [µL] de Trypan-Blue.
10. Se cuentan en hemocitometro y se realizan los mismos cálculos que en el
protocolo de cálculo de concentración celular y viabilidad para células
creciendo adheridas.
Abs.muestra
Glu cos a[mg / dL] = ´ cocentración _ de _ estándar
Abs.estándar
Abs.muestra
Lactato[mg / dL] = ´ cocentración _ de _ estándar
Abs.estándar
Se realiza la tinción con MTT para visualizar las células adheridas a los
microcarriers. Los pasos a seguir son:
1. Utilizando una pipeta estéril se extrae 1 [mL] de muestra del cultivo agitado
en un tubo Eppendorf de1,5 [mL].
2. Se deja decantar.
3. Se descarta el sobrenadante y se lavan los microcarriers con 1 [mL] de
PBS.
4. Sedimentan los microcarriers nuevamente y se remueve el sobrenadante,
hasta dejar 400 [µL] de pellet.
5. Se mezcla con 400 [µL] de solución MTT, esta mezcla se incuba a 37 ºC
con agitación ocasional entre 5 a 10 minutos (en este tiempo es posible
detectar los microcarriers como pequeños puntos azules a simple vista.)
6. A continuación se observan las células viables sobre los microcarriers
esparciendo una gota de esta solución sobre un porta-objeto en el
microscopio de contraste de fase utilizando un objetivo 20X.
Fixative Stain
Crystal violet 0.5% in Ethanol 40% and PBS 60%
Materials:
1. 500 mL media bottle, non-sterile
2. Crystal Violet powder
3. Absolute Ethanol (95% in water) Note: may substitute methanol
4. 1X PBS
5. 1 pair gloves
Procedure:
1. Combine the following:
a. 40 mL ethanol
b. 60 mL PBS
c. 0.5 g crystal violet (in 100 mL ethanol/PBS solution)