Keberadaan gugus tert-butil pada C-2 unikonazol dan paclobutrazol dapat menjadi peran penting untuk

aktivitas penghambatan pada biosintesis GA. Struktur kimia paclobutrazol erat kaitannya dengan
uniconazole akan tetapi tidak memiliki ikatan rangkap. Substitusi gugus ters-butil dari senyawa-senyawa
ini dengan gugus fenil dapat menyebabkan hilangnya penghambatan pada pemanjangan batang padi
secara drastis, menyebabkan penghambatan Arabidopsis yang kuat dan pemanjangan sela hipokotil.
Keterbelakangan tersebut dapat diatasi dengan adanya aplikasi bersama pada BL kemudian taplikasi dari
GA tidak dapat digunakan. Dari pembelajaran ini dapat dijelaskan bahwa gugus fenil pada C-2 unikonazol
dan paclobutrazol sangat penting untuk selektivitas penghambatan biosintesis BR. Selain substitusi,
pengenalan dari gugus alkil atau aril pada C-2 paclobutrazol menyebabkan penghambatan biosintesis BR
yang lebih kuat dan mengurangi efek pada biosintesis GA. Akibatnya, perbedaan struktural antara
turunan paclobutrazole dan brassinazole hanya ada dalam keberadaan gugus alkil atau aril dan gugus
fenil yang terikat pada karbon karbinol. Sehingga kelompok ini secara dramatis mengubah karakter
turunan triazole inhibitor biosintesis GA menjadi inhibitor biosintesis BR.

Untuk menyelidiki langkah-langkah biosintesis yang dipengaruhi oleh brassinazole, kami menguji efek
intermediet biosintesis hilir dari cathasterone pada perpanjangan hypocotyl Arabidopsis yang diobati
dengan brassinazole [9]. Eksperimen makan menunjukkan bahwa target brassinazole dapat menjadi
konversi dua langkah dari 6-oxocampestanol menjadi teasteron melalui kataster, dikatalisis oleh DWF4
dan CPD, yang merupakan Arabidopsis sitokrom P450 yang diisolasi sebagai steroid 22 dan 23
hidroksilase, masing-masing. Selain itu, kami menganalisis BRs endogen pada sel roseus brassinazole
yang diobati dan tidak diobati [10]. Dalam sel tanaman yang diolah dengan brassinazolet, kadar
campestanol dan 6-oxo-campestanol meningkat, dan kadar intermediet BR dengan gugus hidroksi pada
rantai samping berkurang, menunjukkan bahwa perlakuan brassinazole mengurangi kadar BR dengan
menghambat hidroksilasi posisi 22. dikatalisis oleh DWF4. Dengan demikian, DWF4 diekspresikan dalam
Escherichia coli, dan hubungan pengikatan dengan brassinazole dan turunannya ke DWF4 rekombinan
dianalisis [11]. Di antara beberapa turunan triazol, brassinazole memiliki afinitas pengikatan tertinggi
terhadap DWF4 dan aktivitas penghambatan pertumbuhan tertinggi. Afiliasi yang mengikat dan aktivitas
untuk menghambat pertumbuhan hipokotil berkorelasi baik di antara turunannya. Di sisi lain,
brassinazole tidak berikatan dengan protein CPD rekombinan (Mizutani, komunikasi pribadi), yang
menyarankan bahwa CPD bukanlah situs target dari brassinazole. Dalam Arabidopsis yang diobati dengan
brassinazole, gen CPD diinduksi dalam 3 jam, kemungkinan besar karena aktivasi umpan balik yang
disebabkan oleh berkurangnya level BR aktif. Hasil ini menunjukkan bahwa brassinazole menghambat
hidroksilasi 22-posisi rantai samping di BRs dengan mengikat langsung ke DWF4 dan bahwa DWF4
mengkatalisasi reaksi hidroksilasi ini. Karena keterlibatan protein DWF4 dalam jalur biosintesis BR
disarankan hanya dengan membandingkan fenotipe mutan DWF4 dengan mutan defisiensi BR lainnya
dan pemberian intermediet biosintesis, kombinasi analisis kimia BR internal pada sel-sel tanaman yang
diobati dengan brassinazole dan pengikatan uji brassinazole ke DWF4 seharusnya menjadi cara alternatif
untuk menyelidiki peran DWF4 dalam jalur biosintesis BR.