INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL

ESCUELA NACIONAL DE CIENCIAS

BIOLÓGICAS

DEPARTAMENTO DE BIOQUÍMICA
“DR. GUILLERMO CARVAJAL SANDOVAL”

ACADEMIA DE METODOS DE ANÁLISIS

“SEPARACIÓN DE UNA MEZCLA DE AZUL DE

METILENO Y FLUORESCEINA USANDO
CROMATOGRAFÍA POR ADSORCIÓN”

PROFESOR: Q.F.I FRANCISCO CARMELO

FERNÁNDEZ LÓPEZ

ALUMNO: KERBER DÍAZ JENIFFER CHRIS

GRUPO: 5QM2 SECCIÓN: 2
INTRODUCCIÓN:

OBJETIVOS:

 Aplicar la técnica de cromatografía por adsorción para la separación de dos

colorantes
 Comprobar la separación con base en el perfil de elución
 PROCEDIMIENTO:
adicionar H2O des. enumerar y aforar
En un v. de pp. de 100ml hasta la marca de
pesar 10g de alúmina ácida a 3 ml 30 tubos
30 ml

introducir hasta el fondo de

la columna un disco de abrir y drenar hasta 1/4 del llenar la columna de vidrio hasta 3/4
lana de vidrio humeda con volumen con H2o dest.
ayuda de una varilla

adicionar lenta y ajustar elucion a

constantemente la dejar sedimentar la alúmina y
agregar fase móvil (3-4 ml) 35-40gotas/min
alumina ácida ( con
agitación)

dejar la fase movil

colocar .1ml de la mezcla a 3mm por encima
de colorantes en el centro de la alumina y
comenzar separacion colocando el del del menisco sin toccar
tubo 1 hasta que la muestra pentre a cerrar flujo
paredes
superficie de la alumina

llevar la fase obtener las fracciones

realizar 3 lavados con agua movil hasta hasta que salga por
destilada sin perturbar la la altura completo el primer
superficie inical colorante

separar hasta obtener el cambiar la fase

leer a 493nm y segundo colorante y eluatos movilo por regulador
668nm incoloros de fosfatos 0.1N
pH12
RESULTADOS:
Tabla 1 VALORES DE ABSORBANCIA OBTENIDOS PARA LA SEPARACIÓN DE FLUORESCEÍNA Y AZUL DE METILENO

Volumen de A493 A668

elución (mL)
3 -0.008 -0.012
6 0.022 -0.009
9 0.083 1.574
12 0.022 0.626
15 -0.003 0.197
18 -0.008 0.094
21 -0.009 0.049
24 -0.010 0.033
27 -0.010 0.016
30 -0.012 0.007
33 -0.009 0.004
36 -0.008 -0.001
39 0.001 -0.003
42 -0.006 -0.002
45 -0.010 -0.007
48 -0.009 -0.004
51 -0.004 0.001
54 -0.008 -0.008
57 -0.008 -0.008
60 0.008 -0.009
63 0.153 -0.010
66 1.308 -0.009
69 0.406 -0.005
72 0.134 -0.005
75 0.035 -0.007
78 0.012 -0.006
81 0.010 -0.002
84 -0.009 -0.003
87 0.053 0.021
 1.8 1.4

1.6
1.2
1.4
1
1.2

absorbancia a 493nm
absorbancia a 668nm

1 0.8

0.8
0.6 Azul de metileno
0.6 fluoresceina

0.4 0.4

0.2
0.2
0
0 20 40 60 80 100 0
-0.2

-0.4 -0.2
volumen de elución en mL

Figura 1 perfil de elución obtenido de los valores de absorbancia a 668nm y 493nm después de realizar una cromatografía de
adsorción para separar una mezcla de azul de metileno y fluoresceína.

DISCUSIÓN:

Figura 2 estructura química del azul de metileno Figura 3 estructura química de la fluoresceína
Figura 4 estructura química de la alúmina ácida

Como podemos observar en el perfil de elución obtuvimos 2 picos de absorción característicos de cada
colorante, el primer pico que se encontró fue a los 9ml cuando realizamos las lecturas a 668nm y
corresponde con el colorante azul de metileno ya que en base a la bibliografía su Absorbancia máx. se
encuentra ente 664-666 nm, además de que en la práctica observamos que efectivamente este
colorante fue el primer eluato que obtuvimos, en el perfil de elución podemos observar como a los 12 y
15 ml son las otras dos lecturas más altas que se obtuvieron a 668nm esto debido a que en esos tubos
aun conservábamos colorante aunque no tanto como a los 9 ml ; el azul de metileno fue el primer
colorante que obtuvimos debido a que, como fase estacionaria utilizamos alúmina ácida y cómo
podemos observar su estructura en la figura 4. Es más fácil que esta interactúe formando puentes de
hidrógeno con los grupo COOH y OH de la fluoresceína , esto nos lleva por tanto a utilizar una fase móvil
que pueda interactuar con el azul de metileno y como este posee gran cantidad de grupos metilo es fácil
que interactúe con el agua por lo que esta fue nuestra primera fase móvil, en las demás lecturas
obtenidas observamos valores muy pequeños que son en los cuales aún quedaba un poco de azul de
metileno el cual termino de separarse hasta los 33ml ya que a los 36ml observamos una lectura negativa
lo cual indica que no hay colorante , cuando observamos las lecturas que obtuvimos a 668nm de los
tubos en los que había fluoresceína estas salen negativas esto se puede deber a que como no es la
longitud necesaria en la que este colorante absorbe no se obtuvieron valores aunque estaba presente
un color visible. Sin embargo ahora al realizar las lecturas a 493nm obtuvimos un nuevo máximo de
absorbancia ahora a los 66 ml y revisando la bibliografía encontramos que la absorción máxima de la
fluoresceína se encuentra entre los 496-500nm por lo que decimos que este nuevo máximo se trata de
la fluoresceína; para poder obtener el eluato de este colorante utilizamos como fase móvil regulador de
fosfatos a un pH de 12 el cual vuelve al medio alcalino y por tanto también vuelve alcalina a la alúmina
dejando esta de interactuar con los grupos OH y COOH de la fluoresceína y de este modo puede eluir
este colorante.

Observamos que la velocidad de elución al utilizar el regulador de fosfatos disminuyo esto puede
deberse a la densidad del regulador haciendo más lenta la elución al igual que en las lecturas a 668nm
las demás lecturas que observamos son negativas excepto en los tubos en los que se encontraban
pequeñas cantidades de fluoresceína y nuevamente a los 9 y 12 ml que como recordamos son los tubos
en los que encontramos al azul de metileno, no nos dan lecturas muy altas sin embargo encontramos un
pequeño pico lo cual puede ser indicador que el azul de metileno también puede absorber a 493nm
aunque no tanto como a los 668nm .

Algunas pequeñas variaciones como las lecturas obtenidas a los 87 ml en donde se supone deberían dar
valores negativos o valores igual al blanco ya que ya no había nada de colorante y sin embargo dan
lecturas de 0.021 a los 668nm y de 0.053 a los 493 nm esto posiblemente se daba al acarreamiento de
muestra ya que utilizamos 14 celdas para realizar todas las lecturas y a pesar de ya no ocupar las celdas
en las que los colorantes estaban más concentrados pudimos haber acarrado pequeñas gotas de otros
tubos que aunque no estaban tan concentrados afectaron estas últimas lecturas .

CONCLUSIÓN:

Se pudo separar la mezcla de los colorantes azul de metileno y fluoresceína mediante una
cromatografía por adsorción.

Se comprobó dicha separación mediante el perfil de elución.

CUESTIONARIO:

1. Especifique y defina los elementos del sistema cromatografíco para esta separación.
Fase estacionaria: fase que se encuentra fija en el interior de la columna en la práctica nuestra
fase estacionaria fue la alúmina ácida.
Fase móvil: el disolvente que desciende a través de la columna puede ser un líquido o un gas,
en la práctica utilizamos 2 fases móviles la primera fue el agua destilada y la segunda el
regulador de fosfatos.
Análito: muestra que se quiere analizar, en la práctica el Análito fue la mezcla de colorantes
(azul de metileno y fluoresceína).
Soporte: es aquel que contiene el sistema cromatográfico en este caso el soporte es la columna
2. Defina el término adsorción y, empleando fórmulas esquematice que fuerzas
intermoleculares participan en el proceso de separación de los solutos.
Adsorción: los átomos o moléculas de una sustancia que se encuentra en determinada fase,
son retenidas en la superficie de otra sustancia, que se encuentra en otra fase.

O O
OH

Al HO
HO OH

Figura 5 interacción entre la alúmina ácida y la fluoresceína

 H
H O
H
O
H
H O
N H
H3 C CH3
N + N
S
H H3C CH3
H
O O
H H

Figura 6 interacción entre el agua y el azul de metileno

3. Considerando las propiedades de solubilidad de los colorantes, indique qué modificaciones

haría para invertir el orden de la elución.

Se puede colocar alúmina básica en lugar de alúmina ácida, por lo que está al tener cargas negativas
interactuaría con los protones de los grupos metilo y la carga positiva de S del azul de metileno y no
con la fluoresceína, la primera fase móvil seguiría siendo el agua pero esta vez interactuaría con el
grupo hidroxilo y con el protón del ácido carboxílico siendo así el primer eluato la fluoresceína, se
seguiría usando un regulador de fosfatos solo que esta vez con pH ácido en lugar de básico para volver a
cambiar la carga de la alúmina volviéndola ácida y dejando así de interactuar con el azul de metileno por
lo que este sería el segundo eluato que obtendríamos.

Bibliografía:

Daniel C.Harris, 2007. Análisis químico cuantitativo.3a ed. Editorial reverte S.A., Barcelona-España,
554pp.

Adsorción | La Guía de Química http://quimica.laguia2000.com/conceptos-

basicos/adsorcion#ixzz40lE9YiIZ revisado 20/20/2016

http://www.cimpaltda.com/modulo/quimicos/azul%20de%20metileno.pdf

http://www.cicarelli.com/productos/colorantes_e_indicadores.php