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Estratégias para purificação de uma proteína

Os assuntos abordados nessa aula são:

- Métodos de centrifugação e precipitação diferencial


- Dosagem de proteínas
- Métodos cromatográficos
- Análise de eficiência da purificação

Atenção ! Use o modo “apresentação de slides” para ativar as animações


Principais componentes moleculares da bactéria E. coli

Componentes Nº de moléculas diferentes % peso total


H2O 1 70
Proteínas 3.000 15
Ac. Nucléico 1 - DNA e 1000-RNA 7
Carbohidratos 50 3
Lipídeos 40 2
Outros Íons - 12 3
Mol. Monoméricas - 500

A tabela acima mostra a percentagem em peso dos principais tipos de


moléculas presentes em um célula simples, a bactéria Escherichia coli.
Observe que as proteínas compõem o grupo mais diverso de moléculas.
Como são as proteínas que executam a maior parte das funções vitais de
um organismo, uma grande parte das questões na Biologia envolve conhecer
em detalhes a estrutura 3D e o funcionamento de uma proteína.

Para se obter uma proteína em particular, é necessário separá-la de


todas as outras que estão presentes na mesma fonte biológica.
Métodos de Isolamento de Biomoléculas

O isolamento ou purificação de uma proteína é uma etapa que precede


os estudos de suas características físico-químicas, de sua estrutura 3D
e a compreensão de suas propriedades biológicas.

Inicialmente, a estratégia de purificação de uma proteína é empírica, ou


seja, baseada em tentativa-erro, e deve ser desenhada para cada proteína
individualmente. Não há como prever quais métodos serão os mais
eficientes para se purificar uma proteína pela primeira vez.

Métodos de 1 proteína
purificação isolada

Proteínas de uma célula


Métodos de Isolamento de Biomoléculas

Existe uma grande variedade de métodos visando a separação de biomoléculas.


Como na maioria das vezes o que se pretende purificar é uma proteína, o grupo
de moléculas com maior diversidade, as metodologias de separação de proteínas
tiveram um grande desenvolvimento, com muitas opções disponíveis.

Os métodos de separação de biomoléculas são agrupados em duas categorias:

Métodos baseados em características físico-químicas das biomoléculas:

1. Tamanho – Massa – Densidade (ex: centrifuação, diálise, gel-filtração)


2. Carga elétrica (ex: cromatografia de troca iônica, eletroforese)
3. Solubilidade ou hidrofobicidade (ex: cromatografia em papel, fase reversa)

Métodos baseados em afinidade biológica, que exploram a interação entre duas


moléculas:

4. Cromatografia de afinidade (pressupõe que uma das moléculas do par que


interage é um “reagente” de fácil obtenção, disponível comercialmente)
MATERIAL BIOLÓGICO DE PARTIDA: (100g)
O fluxograma ao lado representa a
Lisossomos
Lisossomos
“marcha” de purificação de uma proteína,
Mitocôndria
Mitocôndria
SOBRENADANTE ORGANELAS mostrando as etapas sucessivas, cada
Golgi
Golgi
Núcleo
Núcleo
uma consistindo de método, que levam ao
Precipitação com Sal/Solvente isolamento de uma proteína presente
numa mistura complexa.
Observe a quantidade de proteínas
F1 F2 F3 F4 (100g) presente no material inicial e
quanto da proteína purificada se obtém no
Precipitação com Sal/Solvente
final (0,001g). Esses números são típicos
para a purificação da maioria das
F 2 .1 F 2 .2 F 2 .3 proteínas, em especial enzimas.
Cromatografia Troca Iônica
Em cada etapa, a proteína de interesse é
F 2 .3.1 F 2 .3.2 . . . . . . F 2. 3.N
separada das demais com base em uma
Cromatografia Troca Iônica propriedade diferente. Consequente-
(pH ou resina diferente) mente, as proteínas ainda misturadas com
aquela que está sendo isolada são cada
F 2 .3.N.X
vez mais semelhantes em suas
Gel Filtração
características físico-químicas, exigindo
métodos cada mais sensíveis, capazes
de explorar pequenas diferenças, para se
1 Proteína apenas
chegar à proteína pura.
(0.001g) - 0.1 a 0.5% total
MATERIAL BIOLÓGICO DE PARTIDA: (100g)
Além dos métodos de purificação, análises
Lisossomos
Lisossomos
complementares devem ser feitas ao longo da
Mitocôndria
Mitocôndria
SOBRENADANTE ORGANELAS purificação, para verificar se o processo de
Golgi
Golgi
Núcleo
Núcleo
separação está sendo eficiente.
Precipitação com Sal/Solvente
A medida da atividade biológica da proteína
de interesse e do conteúdo de proteínas de
F1 F2 F3 F4 cada fração resultante do processo de
separação devem ser feitas a cada passo.
Precipitação com Sal/Solvente
Assim, apenas a fração que contém a
proteína de interesse, marcada com um
F 2 .1 F 2 .2 F 2 .3 círculo vermelho no fluxograma, é submetida
Cromatografia Troca Iônica à próxima etapa de purificação.

F 2 .3.1 F 2 .3.2 . . . . . . F 2. 3.N


• Medida da atividade biológica
Cromatografia Troca Iônica - particular para cada proteína
(pH ou resina diferente) - deve ser quantitativa, para estimar quanto
da proteína de interesse há em cada fração.
F 2 .3.N.X

Gel Filtração
• Medidas do conteúdo proteico (diversos)
- absorbância de luz UV de 280 nm
1 Proteína apenas - métodos colorimétricos
(ex: Lowry, Bradford, BCA, etc)
(0.001g) - 0.1 a 0.5% total
Métodos para medida do conteúdo de proteína:

Absortividade molar, e

Comprimento de onda

O gráfico mostra o espectro de absorção de luz UV dos aminoácidos aromáticos Trp, Tyr ou Phe.

A absorbância de uma solução de proteínas a 280 nm é diretamente proporcional ao seu conteúdo


proteico, desde que essas contenham esses aminoácidos na sua composição, especialmente triptofano.

A vantagem desse método é que ele não é destrutivo para a proteína. Em geral, considera-se que uma
leitura de 1,0 A280 equivale a uma concentração de 1 mg/mL.
Métodos para medida do conteúdo de proteína:

Reagente de Biureto: sulfato de Cu2+ em tartarato


Cu2+ reage com as ligações peptídicas e produz um
complexo púrpura com absorção máxima em 540 nm

1. Cu2+ é chelado pela proteína Reagente Bradford


[Cu2+-proteina] = Coomassie
2. Reação redox Brilliant Blue G-250
Cu2+ + (ligações peptídicas) —> [Cu+ -proteína]
Método baseado em uma mudança espectral do
reagente, em que dá absorção máxinma a 595 nm (cor
Método de Lowry azul), quando interage com proteínas.
Ìons Cu2+ reduzidos a Cu+ em presença de Interação com proteínas se dá através de
proteínas e cadeias laterais de aminoácidos forças de Van der Waals e ligações iônicas,
aromáticos, Tyr e Trp, e de Cys, reduzem o especialmente com arginina, mas também com
reagente de Folin-Ciocalteu (ácido fosfo- resíduos de histidina, lisina, tirosina, triptofano e
mobidênio-tungstênio), dando um composto fenlialanina.
de cor azul.

BCA = ácido 2,2'-Bicinchonínico ou


4,4'-Dicarboxy-2,2'-biquinoline

Ìons Cu2+ reduzidos a Cu+ em presença de


proteínas reagem fortemente com o BCA
formando um composto azul,
Para iniciar a purificação, inicialmente é necessário extrair a proteína de interesse
para um meio líquido, exceto se ela já estiver naturalmente presente em um meio
líquido (sangue, suor, água do mar, meio de cultura, seiva de planta, etc).

Vários métodos são


por ultra-som com possíveis para transformar
Material na detergente células, órgãos, tecidos em
fonte um homogenado, ou extrato
bruto, como mostra a figura.
células
Homogeneização
(para romper tecidos e células)

tecidos

Homogenado
Material
ou
Extrato bruto de
por pressão liquefação partida
(prensa francesa) (Potter)
Sendo a proteína de interesse detergente micelas
uma proteína de membrana, é
necessário solubilizá-la. Para
esse fim são utilizados
detergentes, que dissolvem a
Dependendo da concentração
membrana plasmática e
formando complexos solúveis
com as proteínas.
Proteínas
Complexos
integrais da
Detergentes podem ser membrana
não micelares

iônicos e não iônicos

Detergentes iônicos
Detergentes
não iônicos

Triton X-100
(polyoxyethylene (9,5) p-t-octylphenol)
Cetab
Cetyltrimethylammonium
bromide

SDS
Octilglicosídeo
Dodecil sulfato de Deoxicolato de sódio (octyl-b-D-glucopyranoside)
sódio
A centrífuga
Amostra A centrifugação frequentemente é uma das primeiras
Câmara blindada sedimentando
etapas de purificação aplicado a um extrato bruto. Através
do movimento de rotação do rotor da centrífuga, uma força
centrífuga é aplicada à amostra, separando seus compo-
nentes através de suas massas e/ou densidade, conforme
a técnica.
rotor
ângulo Através de sucessivas etapas de centrifução com
fixo
velocidades (rotações por minuto, rpm) crescentes, pode-
se obter diferentes frações de um homogenado de células
ou tecidos.

refrigeração vácuo centrifugação diferencial


homogenado

células intactas mitocôndrias fração


pedaços de membrana lisossomos citoplasmática
núcleos ribossomos

sangue centrifugado: separação de plasma e células


Força centrífuga Existem centrífugas para diferentes tipos de aplicações,
dependendo da força centrífuga que são capazes de gerar.

Relação entre o raio do rotor, velocidade angular (rpm) e a força centrífuga (g)

Centrífuga Ultracentrífuga
(necessitam vácuo
Clínica para evitar atrito do ar,
além de refrigeração)

1,200g por 15 minutos


separa plasma de 200,000 g por 24
células sanguíneas horas para separar
R$ 3.000 US$ 70,000 organelas menores
ou complexos
proteicos
Preço aproximado
A centrifugação em um
meio com gradiente de Centrifugação em gradiente de densidade
densidade melhora a
eficiência da separação. As Solucões de sacarose com
partículas se deslocarão densidades diferentss são
através do gradiente até colocadas no tubo, uma
sobre a outra Amostra é colocada no
encontrarem uma região topo do gradiente
com densidade equivalente
a sua, quando param de se
5% sacarose
mover, formando “bandas”.

Gradientes podem ser 20% sacarose


utilizados para separar
diferentes tipos de células,
organelas, ácidos Baixa densidade

nucléicos, complexos Média densidade


proteicos, etc.
Alta densidade
centrifugação
Gradiente separação de:

Ficoll-Hypaque leucócitos
Sacarose mitocôndrias
Cloreto de césio ácidos nucléicos
As mais potentes ultracentrífugas atuais ainda não são capazes de sedimentar proteínas.

Processos que diminuem a solubilidade e provocam a precipitação fracionada de proteínas


são utilizados como etapas preliminares de purificação. Uma das vantagens desses métodos
é o baixo custo e capacidade de processar grandes volumes/massas.

A precipitação de proteínas pode ser induzida por: O gráfico ao lado ilustra o efeito de
- adição de sais (Precipitação salina) diferentes sais sobre a solubilidade
- adição de solventes da hemoglobina.
- variação de pH (Precipitação isoelétrica)
Em baixa concentração salina, a
solubilidade das proteínas aumenta,
Salting-in X Salting-out
NaCl pois os íons do sal ajudam a reforçar
a camada de solvatação.
Solubilidade da hemoglobina (S/S’)

KCl
Em alta concentração salina, a
solubilidade das proteínas diminue
MgSO4 pois os íons do sal competem pelas
moléculas de água disponíveis para
formar a sua própria camada de
(NH4)2SO4 solvatação.

K2SO4 Sais com ânions divalentes são mais


eficientes do que os monovalentes
na precipitação de proteínas.
Concentração do Sal,, Molar
Sais se dissociam em solucão aquosa e competem com as proteínas pela água de solvatação.

Considere uma solução com fibrinogênio,


Hemoglobina
albumina, hemoglobina, pseudoglobulina e
mioglobina e observe o gráfico.
Albumina Mioglobina

Usando o sal sulfato de amônio (NH4)2SO4,


pode-se purificar completamente o
Solubilidade, log

fibrinogênio a partir de uma mistura das 5


proteínas, pois este precipita totalmente em
Fibrinogênio
Pseudoglobulina uma saturação de 2,8 M do sal.

Neste ponto, centrifuga-se a solução e o


fibrinogênio é coletado como um precipitado.
Concentração do Sal (NH4)2SO4,, Molar

Numa próxima etapa, adicionando-se mais


Proteínas apresentam diferente sensibilidade sal à solução até uma saturação de 7 M,
para a precipitação salina. pode-se obter um novo precipitado contendo
albumina, hemoglobina e pseudoglobulina.
- precipitam primeiro:
proteínas maiores E teremos também purificada a mioglobina,
proteínas mais hidrofóbicas ainda em solúvel na presença de 7M do sal,
e que ficou sozinha no sobrenadante.
possuem camadas de solvatação maiores
ou menos organizadas, mais fáceis de pertubar.
Proteínas também podem ser precipitadas com adição de solventes ao meio ou
quando colocadas em meio com pH próximo ao seu ponto isoelétrico.

Proteína P.I.
Proteínas colocadas em meio com pH igual ao seu PI
Pepsina <1,0 tendem a precipitar, pois tendo carga neutra, apresentam
Ovalbumina galinha 4,6 a camada de solvatação menos organizada.
Albumina sérica humana 4,9
Tropomiosina 5,1
Insulina bovina 5,4
Fibrinogênio humano 5,8
Constante Momento
Gama-globulina 6,6
Solvente
Dielétrica Dipolar
Colágeno 6,6 Água 78.5 1.85
Mioglobina equina 7,0 Dimetilformamida 48.9 3.96
Hemoglobina humana 7,1
Metanol 32.6 1.66
Etanol 24.3 1.68
Ribonuclease A bovina 7,8
Acetona 20.7 2.72
Citocromo C equino 10,6
Clorofórmio 4.8 1.15
Histona bovina 10,8 Benzeno 2.3 0.00
Lisozima, galinha 11,0
Salmina, salmão 12,1
Solventes miscíveis com a água diminuem a constante
Ponto Isoelétrico de algumas Proteínas dielétrica do meio e desorganizam a camada de solvatação
das proteínas.

Os mais utilizados são etanol e acetona.


Para obter as proteínas precipitadas em solução novamente, é
necessário reverter as condições que levaram à precipitação.

Aos precipitados obtidos com sal ou


Membrana
de celofane solvente, adiciona-se água.

solvente
Ao precipitado obtido com variação
de pH, retornar ao pH original.
solução a
ser dialisada

início final
Dt
Para remover o excesso de sal ou do solvente no precipitado, utiliza-se a diálise.

-amostra é colocada dentro de um saco feito com uma membrana de celofane com poros
tratados, que permite a passagem de moléculas até 10,000 d.
- o saco contendo a amostra é imerso em um recipiente contendo o solvente que se deseja
- excesso de sal ou de solvente se difunde para o solvente
- após várias trocas de solvente, todo o excesso de sal/solvente terá sido retirado.
MATERIAL BIOLÓGICO DE PARTIDA: (100g) Até o momento, exploramos as
etapas iniciais de purificação de
Lisossomos proteínas, como a centrifugação
Mitocôndria diferencial e precipitação
SOBRENADANTE ORGANELAS Golgi fracionada.
Núcleo
Precipitação com Sal/Solvente Esses métodos, apesar de terem
baixo poder de resolução (exploram
diferenças grosseiras entre as
F1 F2 F3 F4 proteínas), permitem processar
Precipitação com Sal/Solvente grandes volumes ou massas, típicos
das etapas iniciais de isolamento.
F 2 .1 F 2 .2 F 2 .3
Quando já houve redução significa-
Cromatografia Troca Iônica
tiva dos montantes de proteínas a
serem processados, iniciam-se as
F 2 .3.1 F 2 .3.2 . . . . . . F 2. 3.N cromatografias, que irão explorar as
Cromatografia Troca Iônica diferenças mais sutis entre as
(pH ou resina diferente)
moléculas.
F 2 .3.N.X
Não esquecer que todas as frações
Gel Filtração obtidas devem ter o conteúdo de
proteínas e de atividade biológica
1 Proteína apenas medidos, para se decidir qual/quais
deverão passar para o passo
(0.001g) - 0.1 a 0.5% total
seguinte da purificação.
Funcionamento Básico de uma Coluna Cromatográfica
Uma coluna é um tubo cilindríco aberto nas duas extremidades e preenchido com a resina ou
matriz ou gel cromatográfico. A coluna é constantemente alimentada com líquido (tampão),
banhando a resina e forçando o contacto desta e as moléculas que estão sendo analisadas.
Abaixo está representado o esquema geral de uma cromatografia:
Tempo zero Tempo 1 Tempo 2 Tempo n
Amostra com
diferentes Líquido
componentes Componentes da que sae
Mais tampão é
amostra se da coluna
colocado na
Resina separam e saem é
coluna,
embebida da coluna com recolhido
forçando os
em diferentes em tubos
componentes
tampão volumes de de um
da amostra a
tampão coletor de
interagirem
frações
com a resina

Os componentes da mistura são


separados por interação diferenciada
com a resina, com base em
propriedades moleculares como: Coletor de
frações

Concentração
• massa molecular
• carga elétrica Um cromatograma, como o
• solubilidade gráfico ao lado, é a maneira
• afinidade usual de se representar o
resultado de uma
cromatografia. Tempo ou volume
Que características devem ter as resina cromatográficas para possibilitar
separações de moléculas baseadas em diferentes propriedades ?

Cromatografia de permeação em gel ou gel-filtração:


separação de moléculas pela massa molecular
géis são porosos, funcionando como peneiras ou filtros

Cromatografia de troca iônica:


separação de moléculas pela carga elétrica
géis apresentam grupos carregados positiva- ou negativamente

Cromatografia de partição (fase reversa ou hidrofóbica):


separação de moléculas pela solubilidade relativa em meio aquoso
géis possuem carácter hidrofóbico

Cromatografia de afinidade:
separação de moléculas pela capacidade de interagir com um ligante
géis possuem ligante específico ligado covalente à resina
Cromatografia de gel filtração ou peneira molecular
Moléculas com massas diferentes
proteína grande

proteína pequena
Fluxo do tampão
Tampão
“empurra”
moléculas
através da
resina

grão da resina poroso grãos (beads) da


tubos resina com poros

Na gel-filtração, as proteínas que penetram nos poros da resina precisam diferentes


volumes de tampão para saírem da coluna, conforme suas massas moleculares, percorrendo os
canais internos dos grãos. Quanto maior o número de grãos que cada molécula entrar durante o
percurso através da coluna, maior o volume necessário para sua saída.
Proteínas maiores que o diâmetro dos poros não são separadas e saem da coluna com
pouco tampão, correspondente apenas ao volume da coluna externo aos grãos, também chamado de
volume morto (Vo).
Proteínas menores que o diâmetro dos poros não são separadas e saem da coluna com um
volume de tampão correspondente ao volume interno (Vi, volume total menos o volume do próprio gel).
A cromatografia de gel-filtração possibilita estimar a massa molecular de
uma proteína em seu estado nativo
Além de purificar, por ser realizada em condições de pH, força iônica
e temperatura que preservam a atividade biológica da proteína, a
Curva de calibração
gel-filtração fornece a Mr do seu estado nativo.
Observa Para isso, é necessário “calibrar” a coluna com proteínas de massa
ra
escala molecular conhecida, construindo-se uma curva de calibração.
log
O volume de saída (eluição) de uma proteína numa coluna de gel-
Massa molecular (kD)

filtração é proporcional ao logaritmo de sua massa molecular.


traçado da medida de atividade
biológica nas frações
Moléculas Moléculas

Medida da ativ. biológica


maiores menores

Ler a massa
Absorbância a 280 nm
correspondente

20 40 60 80 100 120 mL
Medir o volume de eluição volume
25 50 75 100 125 mL da fração mais ativa.
volumeKav
de eluição Transportar para a curva de
calibraçao.
Existem diferentes tipos de resinas para gel-filtração, conforme o tipo
de moléculas ou partículas a serem separadas

indica quais os tamanhos das


Resinas para Gel-Filtração partículas que podem entrar
nos poros da resina e serem
fracionados. Acima ou abaixo
NOME TIPO FAIXA DE RESOLUÇÃO
da faixa, não há separação.
(kD)

Sephadex G-10 Dextrana 0.05 - 0.70 Moléculas pequenas


Sephadex G-25 Dextrana 1-5
Sephadex G-50 Dextrana 1 - 30
Sephadex G-100 Dextrana 4 - 150 Proteínas
Sephadex G-200 Dextrana 5 - 600

Bio-Gel P- 2 Policrilamida 0.1 - 1.8 Moléculas pequenas


Bio-Gel P- 6 Policrilamida 1-6
Bio-Gel P- 10 Policrilamida 1.5 - 20
Bio-Gel P- 30 Policrilamida 2.4 - 40
Bio-Gel P-100 Policrilamida 5 - 100 Proteínas
Bio-Gel P-300 Policrilamida 60 - 400

Sepharose 6B Agarose 10 - 4.000


Sepharose 4B Agarose 60 - 20.000 Células, partículas sub-celulares
Sepharose 2B Agarose 70 - 40.000

*Sephadex e Sepharose: Amersham Pharmacia Biotech; Bio -Gel: Bio -Rad Laboratories
Esta é uma outra forma de representar a calibração de uma coluna de
gel-filtração.

O gel nessa coluna é o


Sephadex G-200, cuja
faixa de resolução de
proteínas é de 5.000 a
600.000 d.
Observe como proteínas
nos extremos da faixa
de resolução tendem a
“sair” da parte linear da
curva.

Para comparar calibrações com a mesma resina cromatográfica em colunas de


dimensões diferentes utiliza-se o Kav, que é proporcional ao log de Mr.

Ve – volume de eluição de uma certa proteína


Kav = Ve-Vo onde: Vt – volume total da coluna
Vt-Vo Vo – volume morto da coluna, em que saem moléculas com
massa acima da resolução da resina
Cromatografia de troca iônica

A resina para cromatografia de troca iônica apresenta carga elétrica, positiva ou


negativa, em uma ampla faixa de pH.

DEAE CM

Trocadora de ânions Trocadora de cátions

Existem dois tipos básicos: resinas trocadoras de ânions (possuem carga positiva),
como o dietilaminoetil (DEAE)-celulose e resinas trocadoras de cátions (possuem
carga negativa), como o carboxi-metil (CM)-celulose
Cromatografia de troca iônica

---
-

-
-

O gráfico mostra que essas resinas mantém suas cargas em uma ampla
faixa de pH. Assim, o DEAE-celulose pode ser utilizado em pH abaixo de
10, enquanto que o CM-celulose é utilizado em pH acima de 4, condições
em que pelo menos 50% dos grupos dessas resinas estão carregados.
Como funciona a Cromatografia de Troca Iônica

Adsorção
No exemplo ao lado, como funciona uma resina catiônica ou +
trocadora de ânions, como o DEAE-celulose): +
+ +
+
+
+ + +
A cromatografia de troca iônica compreende duas etapas: ++
1) adsorção das proteínas com carga contrária à
resina, e saída da coluna das proteínas com a Moléculas com a mesma carga,
mesma carga; ou sem carga, não interagem com a resina,
2) eluição das proteínas adsorvidas. sendo as primeiras a sair da coluna

Eluição
Para a eluição, as condições de adsorção da coluna
+
(pH ou força iônica) são alteradas para neutralizar a +
interação entre as proteínas e a resina. +
+
+
Mais frequentemente utiliza-se um aumento da Na+Cl- + +
++
concentração do sal no tampão, pois alterações
de pH podem desnaturar proteínas, levando-as a
precipitar dentro da coluna.
Adição de sal ao tampão resulta em
competição entre os íons em solução
e as moléculas adsorvidas na resina.
Como funciona a Cromatografia de Troca Iônica

O processo da cromatografia de troca iônica depende da diferença de ponto isoelétrico


das proteínas na amostra e das condições escolhidas de pH e de força iônica.
Proteínas apresentam carga positiva quando em meio
Ponto Isoelétrico de algumas Proteínas ácido em relação ao seu PI, e carga negativa, quando em
meio alcalino em relação ao seu pI.
Proteína P.I. Nesse caso, a referência para se dizer que o meio é ácido
Pepsina <1,0 ou básico é o PI da proteína, e não o pH do meio.
Ovalbumina galinha 4,6
H+
Albumina sérica humana 4,9 -
PI básico
-COOH -COO
Tropomiosina 5,1 ácido
Insulina bovina 5,4
+ neutro - +
Fibrinogênio humano 5,8 -NH3 -NH2
Gama-globulina 6,6 H+
Colágeno 6,6
Mioglobina equina 7,0 A carga das proteínas varia em função do pH do meio, pois o
Hemoglobina humana 7,1
pH influencia o estado de dissociação das cadeias laterais dos
aminoácidos ácidos e básicos.
Ribonuclease A bovina 7,8
Citocromo C equino 10,6
Histona bovina 10,8 Responda: em pH 7,0, qual será a carga
Lisozima, galinha 11,0 elétrica da albumina, da mioglobina e do
Salmina, salmão 12,1
citocromo C ?
Duas Modalidades de Cromatografia de Troca Iônica

Gradientes de sal podem fracionar as proteínas adsorvidas na resina de acordo


com a intensidade de suas cargas, que é dada pela diferença entre seus PIs e o pH do
tampão de eluição.
As proteínas não retidas (com a mesma carga da resina) não são separadas,
sendo simplesmente “arrastadas” pelo tampão (ou seja, não são repelidas pela resina).

Eluição NaCl Eluição NaCl


_
+ 0. 10 M 0. 10 M
(+)
(-)
++ 0. 15 M = 0. 15 M
(+)
CM (-)
+
+ +
0. 20 M DEAE _
(+) =
0. 20 M
(-)

_ (+)
(-) =
+
_ = Não retidas +
Não retidas
+

Carboximetil~celulose Dietilaminoetil~celulose
(trocadora de cátions) (trocadora de ânions)
Tipos de Resina de troca Iônica
NOME TIPO GRUPO IONIZÁVEL OBSERVAÇÕES
Dowex 1
Tipos de
Fortemente básica
Resina de troca
Ø - CH N (CH )
Iônica
+ Troca aniônica
2 3 3
resina de polistireno
Dowex 50 Fortemente básica Ø - SO 3-H Troca Catiônica
resina de polistireno
DEAE -celulose Básica Dietilaminoetil Fracionamento de proteínas
- CH 2CH 2N+(C2H 5)2 ácidas e neutras
CM-celulose Ácida Carboximetil Fracionamento de proteínas
- CH2COOH básicas e neutras
DEAE -Sephadex Gel de dextrano Dietilaminoetil Combinação de gel filtração
básico - CH 2CH 2N+(C2H 5)2 e troca iônica de proteínas
ácidas e neutras
CM - Sephadex Gel de dextrano Carboximetil Combinação de gel filtração
ácido - CH 2COOH e troca iônica de proteínas
básicas e neutras

* Dowex: Dow Chemical Co.; Sephadex: Amersham Pharmacia Biotech; Bio


- Gel: Bio Rad Laboratories

Existem vários tipos de resinas de troca iônica disponíveis no mercado.


Cromatografia de afinidade:
Ex: cromatografia de imunoafinidade
Um dos métodos mais
eficientes para a
Adsorção
purificação de proteínas, Mistura de proteínas
possibilitando um alto Eluição
rendimento com número Partículas de Lavagem pH 2,0 ou sal
gel recobertas
reduzido de etapas. de anticorpos
anti-A
A separação de
moléculas tem como
base a interação
específica do analito Complexo
Anti-A
(molécula-alvo) com um Coluna interage Ag-AC é
desfeito
ligante imobilizado na empacotada apenas
com ess gel com a
matriz. Forças proteína A
envolvidas nessa
interação podem ser não Desprezar
proteínas não Antígeno A
covalentes retidas puro -
(eletrostáticas,
hidrofóbica, pontes de H) Eluição: condições que interferem na ligação da proteína ao
ou covalentes (p.e., ligante, como mudanças no pH e/ou força iônica, ou
ponte dissulfeto). por competição com o ligante livre
Tipo de ligantes em cromatografia de afinidade

1. Mono-específicos - ligação específica da molécula-alvo


- análogos de substratos ou inibidores de enzimas
- agonistas ou antagonistas de receptores
- haptenos ou determinantes antigênicos de anticorpos
- ligantes com “tag” ou “marcação”
- glutationa-S-transferase 8-AEA-cAMP
- poli-Histidina
8-(2-aminoethyl)aminoadenosine-3',5'-cyclic
monophosphate
2. Grupo-específico: ligantes para separação de grupos: (ligante para proteínas com afinidade por cAMP
ou cGMP)
Ligante Especificidade
grupo-específico
Proteína A Região Fc de IgG
Proteína G Região Fc de IgG
Concanavalina A Grupos glicosil- ou manosil-
Cibacron Blue Várias enzimas, albumina
lisina Plasminogênio, RNA ribossomal
arginina proteinases tipo tripsina
benzamidina proteinases tipo tripsina
calmodulina Proteínas reguladas por calmodulina Sítios de ligação das proteínas
heparina Fatores de coagulação, lipases, A, G e L à imunoglobulina, que
hormônios, receptores estoróides, etc permitem a purificação de
anticorpos por cromatografia
Metais de transição Proteínas e peptídeos com resíduos
de His expostos de afinidade
Preparo da resina de afinidade: Estratégias para acoplamento de ligantes à resina
Reagente Alvo no ligante
Passo 1. Ativação da resina

Passo 2. Acoplar
o ligante

Para ligantes pequenos (Mr < 1.000) há o risco de impedimento


estérico entre a matriz e a molécula-alvo, que causa dificuldade
ou impede sua ligação à resina.

A introdução de um braço espaçador diminue esse risco.

Braço espaçador covalente entre


a resina e o ligante

Molécula-alvo (analito)
ligante

Ligação reversível não covalente


Cromatografia de Partição

Princípio: Explora diferenças de solubilidade dos compostos em solventes com grau de hidrofobicidade
diferentes, um polar e outro apolar.

Aplicável especialmente á moléculas pequenas, como compostos orgânicos, aminoácidos, peptídeos,


açúcares, lipídeos, etc.

Apresenta limitações para uso com proteínas acima de 20-30kda, que são desnaturadas em presença
de solvente orgânico.

Consiste de 2 sistemas: Fase estacionária Fase móvel


(suporte sólido) X (líquido ou gás)

Duas Possibilidades
- Amostra se deslocará (é mais solúvel) acompanhando a Fase Móvel
- Amostra não se deslocará (é mais solúvel) na Fase Estacionária
AMOSTRAS

Dois tipos de montagem:

CROMATOGRAFIA DE PARTIÇÃO CROMATOGRAFIA DE FASE REVERSA


Suporte: PAPEL Suporte: GEL DE SÍLICA (camada delgada ou TLC)
Fase Estacionária: Aquosa (H20 na celulose) Fase Estacionária: sílica (mineral apolar)
Fase Móvel: Solvente orgânico (hidrofóbico) Fase Móvel: Solvente aquoso ou água
Cromatografia de Partição

tempo 0 t1 t2 tn

Papel direção do
ou placa fluxo do
de sílica solvente distância de migração da substância
Rf =
Amostra Compostos distância de migração do solvente
na origem separados

Cuba com solvente (fluxo por capilaridade)

Para um dado sistema de solvente e tipo de suporte, cada substância apresenta um


valor de Rf característico.

Assim, além de um método de purificação, as cromatografias de partição permitem


identificar e quantificar (pela intensidade das manchas obtidas após a separação)
diferentes compostos.

Pode-se ainda recortar a mancha de interesse do papel ou da sílica e recuperar o


composto isolado.
HPLC: high performance (pressure) liquid chromatography
Inicialmente desenvolvida para cromatografia de fase reversa em coluna, hoje em dia
abrange aplicações para todos os tipos de cromatografias.

Característica diferencial da cromatografia convencional:


• partículas de resina com diâmetro muito pequeno (poucos microns)
• aumento da eficiência da separação em função do número maior de grãos
de resina em um mesmo volume da coluna
• fase móvel - necessita bomba de alta pressão para ter fluxo através da coluna

Desenho básico de um HPLC

Detector
Controle e
análise dos Duas bombas permitem eluição em gradiente
dados

Detector: índice de refração, absorbância UV


ou Vis, fluorescência, etc.

Coluna pode ser aquecida para melhorar a


Coletor de
eluição diferencial na fase reversa
frações
Coluna e
bombas Injetor de
forno
amostra
Fase reversa: resinas de sílica derivatizadas com hidrocarbonetos de 2 C a 18 C

Moléculas

Absorbância a 214 nm
Moléculas 100
não retidas retidas

% de acetonitrila
Tempo ou volume de retenção

Cromatograma de uma coluna de fase reversa, com eluição por um gradiente de acetonitrila

Fase estacionária Função


Condição de equilíbrio: em meio ácido
C18 –Si (CH3)2 C18 H37
C8 –Si (CH3)2 C8 H17
(0.1% de ácido trifluoroacético) para
tC2 –Si C2 H5 aumentar hidrofobicidade (protonar as
Aminopropyl –Si (CH2)3 NH2 carboxilas)
Cyanopropyl –Si (CH3)2 (CH2)3CN
Diol –Si (CH2)3 OCH2CH(OH)CH2OH Eluição com gradiente crescente de solvente
CN Fenil NH2 C4 C8 C18 orgânico miscível com água
- acetonitrila, metanol, propanol
Retenção na coluna: aumenta com o tamanho da cadeia
Cromatografia de interação hidrofóbica

É um processo de partição que explora a interação entre aminoácidos


apolares de uma proteína e uma matriz de carácter hidrofóbico.

Proteínas em solução salina concentrada matriz


H
“perdem” parte da camada de solvatação para hidrofóbica

os sais, expondo na superfície regiões ricas em


aminoácidos apolares, que interagem com uma Proteína
matriz hidrofóbica altamente P
hidrofílica

Três estratégias para eluição:


Proteína
1. diminuir a concentração de sal menos P
2. diminuir a polaridade da fase móvel hidrofílica

3. adicionar detergente
camada de
H2O

[Proteína]
solvatação
Força da interação hidrofóbica aumenta com o [sal]
tamanho da cadeia de C na resina:
Fenil (C6-OH) > Butil (C4) > Octil (C8) volume

Eficiência dos sais em provocar “salting-out” varia com a série de Hofmeister:


Ânions: PO4-2> SO4-3>CH3COO->Cl->Br->NO3->ClO4->I->SCN-
Cátions:NH4+>Rb+>K+>Na+>Cs+>Li+>Mg+>Ca+>Ba+
Como se avalia se o processo de purificação de uma proteína foi eficiente ?

Três parâmetros permitem avaliar a eficiência do processo de purificação de uma proteína:

- Atividade específica (AE): é a razão entre a quantidade da proteína de interesse, medida


através de sua atividade biológica, e a quantidade total de proteínas presentes
em cada etapa de purificação. Esse índice aumenta ao longo da purificação.

- Índice de purificação: indica quantas vezes em relação ao material de partida a proteína


de interesse foi “concentrada”. Calcula-se como a razão entre as atividades
específicas inicial (material de partida) e final (proteína pura).

- Rendimento: indica quanto (em %) da proteína de interesse ativa presente no material de


partida foi recuperado ao final da purificação. Um certo grau de perda é
inerente do processo de purificação (em cada etapa só devem ser proces-
sadas as frações mais ricas em atividade biológica, desprezando-se aquelas
que apresentam pouca atividade).
Também podem ocorrer perdas por desnaturação das proteínas devido às
diferentes condições (pH, sais, etc) a que são submetidas nas diferentes
etapas de purificação. Espera-se recuperar o máximo possível da proteína de
interesse.
Purificação da Glicoquinase hepática de Rato
Etapa Atividade Específicab Rendimentoc Índiceb
( U.mg
U . -1-) a (%) Purificação
Marcha A: somente cromatografias convencionais
1. Sobrenadante de pâncreas 0.17 100 1
2. (NH4)2 SO4, precipitado 25 -55% 2.0 85 12
3. troca iônica, coluna DEAE-Sephadex , pH 7.0, eluição KCl 23 45 140
4. troca iônica, coluna CM-cellulose, pH 5.5, eluição NaCl 44 33 260
6. interação hidrofóbica, coluna Butyl~Sepharose 80 15 480
7. gel-filtração, coluna Sephacryl S-300 130 15 780
Marcha B: com cromatografia de afinidade
1. Sobrenadante de pâncreas 0.09 100 1
2. troca iônica, coluna DEAE- Sephadex, pH 7.0, eluição KCl 18 84 195
3. Afinidade cromatográfica (benzamidina~agarose) 420 83 4.500
a U nidade de enzima (1 unidade de atividade enzimática é definida como a quantidade de enzima que cataliza
a transformação de 1 micromol de substrato em produto, em condições pre-estabelecidas
b Atividade específica: medida da atividade biológica (em U) expressa por miligramas de proteína

c Rendimento: percentual da atividade biológica inicial (100%) recuperada em cada etapa de purificação

d Índice de Purificação : razão entre a atividade específica inicial e aquela determinada em cada etapa.

Uma tabela como a vista acima é a maneira usual de se descrever o resultado de uma
purificação. No exemplo acima, a mesma proteína foi isolada por duas “marchas” diferentes de
purificação (A e B). Observe os parâmetros de purificação.

Se você fosse que repetir essa purificação, qual esquema de purificação escolheria ?

EU TERIA ESCOLHIDO A MARCHA B.


Como se avalia se o processo de purificação de uma proteína foi eficiente ?

A eletroforese em gel de poliacrilamida (PAGE) permite visualizar a composição de


proteínas de uma amostra. É um método complementar para a purificação de proteínas.
Fornece informações sobre a massa molecular e composição
de subunidades da proteína em meio desnaturante e redutor.

A poliacrilamida é um polímero que um


gel de malha porosa. +
A poliacrilamida funciona como uma acrilamida N,N´-metilenobisacrilamidaacrilamida
peneira, deixando passar atravéd de
seus poros as moléculas pequenas e Catalisador
(persulfato de amônio)
retendo as grandes

• É formado a partir da reação de acrilamida e


bisacrilamida.
• concentração de acrilamida variando de 7-
20% determina o diâmetro dos poros
• uso de gradiente de acrilamida aumenta o
poder de resolução
• o gel é polimerizado com tampão pH 8.9, na
poliacrilamida
presença do detergente Na+ dodecil sulfato (SDS)
Desnaturação de proteínas por SDS

H3C-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2- Sódio dodecil sulfato

A porção hidrocarboneto do
detergente interage com as
regiões hidrofóbicas da proteína,
dispondo o grupo sulfato
carregado na superfície, em
contacto com o meio aquoso. A
repulsão entre os grupos fosfato
desestabiliza os laços não
covalentes que mantém a
estrutura 3D da proteína,
desnaturando-a. Efeito do SDS

• desnaturação uniformiza a forma das proteínas, que poderia influenciar na migração através
dos poros da poliacrilamida;
• mascara a carga natural das proteínas no pH da corrida, fazendo com que todas moléculas
migrem para o anôdo;
• facilita o efeito de redutores, rompendo pontes dissulfeto intra- e inter-cadeias
Eletroforese em Gel de Poliacrilamida (PAGE)

O desenho ao lado mostra o tipo mais comum


de cuba para PAGE.
Na cuba, o gel é polimerizado entre duas
placas de vidro ou plástico, afastadas 1 mm
amostra uma da outra.
Poços para
catodo as amostras 1 mm
Antes da polimerização, um pente é colocado
tampão na parte superior do gel para formar os poços
onde serão colocados de 5 a 20 microlitros
Placas de cada amostra, misturadas com azul de
de vidro bromofenol, um indicador da corrida.

gel As partes superior e inferior do gel fazem


contacto com recipientes de tampão, onde
anodo estão os eletrodos que estabelecerão o
campo elétrico (~100V) durante a corrida
tampão (1 a 2h).

Terminada a corrida, as placas são retiradas


da cuba, e o gel entre elas é cuidadosamente
cuba vertical para mini-gel (10 X 8 cm) retirado e corado para revelar as bandas de
proteína. Como corantes utiliza-se Coomassie
Blue ou nitrato de prata.
SDS-PAGE das proteínas da bactéria Eletroforese em Meio Redutor
Salmonella tiphymurium
Adição do redutor 2-mercaptoetanol rompe
pontes dissulfeto nas proteínas, possibilitando a
determinação do número de cadeias e tipo de
Direção ligação entre cadeias de proteínas oligoméricas
da
migração

Padrões

A
ss
B
AB
2 - Mercaptoetanol
A A
SH SH
B B

Sem Com

Cada linha (banda) corada no gel 2 - Mercaptoetanol


representa uma proteína
SDS-PAGE permite determinar a massa molecular de proteínas

A migração eletroforética, expressa como mobilidade relativa, é


proporcional ao logaritmo da massa molecular. Utiliza-se proteínas
padrões com Mr conhecida para se fazer uma curva de calibração
do gel em cada corrida. Interpolando-se a mobilidade relativa de
uma proteína desconhecida na curva pode-se estimar a sua
Massa molecular (kD)

massa molecular. Mr

(-) 97.4
Mobilidade relativa =
87.0
distância percorrida pela banda X
distância percorrida pelo marcador da corrida

45.0

29.0

21.0
12.5
Mobilidade relativa (+) 6.5
Curva de calibração de SDS-PAGE
Proteínas padrões em um SDS-PAGE
Uma boa semana de estudos!!

BIOTECNOLOGIA II

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