BAB III

METODE KERJA
III.1 Alat dan Bahan
III.1.1 Alat
Adapun alat yang digunakan pada praktium ini yaitu aluminium foil,
aerator, batang pengaduk, cawan porselin, corong pisah, cawan petri,
chamber, corong, gelas arloji, gelas ukur, gelas beaker, gelas ukur, jangka
sorong,kapas, kawat besi, kertas saring, klem, kolom, labu ukur, lampu,
mikropipet, ose,paper disk, pipet tetes, statif, sendok taduk besi,spoit,
spektrofotometer UV-Vis, statif, tissu, tabung reaksi dan vial 10 mL.
III.1.2 Bahan
Adapun bahan yang digunakan pada praktikum ini yaitu air laut,
aquades, asam askorbat, bakteri uji Escherichia coli, etanol P.A, etil asetat,
ekstrak Polyscias scutellaria, kloroform, larutan DPPH 0,4 mMol, larva
Artemia salina Leach, n-heksan, NaCl 0,9 %, nutrient agar, pipa kapiler,
paper disk, plat KLT silika gel GF 254, plat KLTP, ragi, silika gel GF 254,
silika gel 60 untuk kromatorafi kolom dan tetrasiklin .
III.2.1 Kromatografi Kolom
1. Disiapkan alat dan bahan
2. Ditimbang ekstrak sebanyak 3 gram menggunakan cawan porselin
3. Disumbat bagian bawah kolom dengan menggunakan kapas
4. Dicampurkan silica gel 60 dengan n-heksan dalam beaker glass, aduk
sampai berbentuk suspensi atau bubur adsorben
5. Dimasukkan suspensi kedalam kolom, ketuk dinding kolom secara
perlahan-lahan, lalu buka kran kolom dan biarkan fase gerak mengalir
keluar sampai tinggi cairan fase gerak diatas suspensi kurang dari 2 cm
6. Ditambahkan silika kedalam ekstrak kemudian campur sampai kering,
kemudian dimasukkan kedalam kolom lalu tutup dengan kertas saring
7. Dibuat perbandingan eluen n-heksan:etil asetat (9:1,8:2, 7:3, 6:4, 5:5,4:6,
3:7, 2:8, 1:9)
8. Dimasukkan eluen kedalam kolom yang dimulai dari perbandingan 9:1
kemudian dilanjutkan dengan 8:2, 7:3, 6:4, 5:5,4:6, 3:7, 2:8, 1:9) dimana
dialirkan fase gerak dengan cara membuka kran dibagian bawah kolom
dan cairan yang keluar mulai ditampung menggunakan vial yang sudah
ditarer 5 ml sampai pada batas yang telah ditandai
III.2.2 Kromatografi lapis tipis
1. Dibuat perbandingan pelarut n-heksan:etil (8:2)
2. Dimasukkan kedalam chamber
3. Diaktifkan lempeng pada oven dengan suhu 114ºC
4. Ditotol lempeng kedalam chamber hingga noda terelusi sampai batas
atas
5. Diambil lempeng lalu dikeringkan, kemudian diamati dibawah sinar uv
6. Dihitung nilai Rfnya
III.2.3 Pengujian Brine Shrimp Lethality Test (BSLT)
1. Dimasukkan larva Artemia salina Leach sebanyak 1 gram kedalam
wadah kaca berisi air laut dengan pH 7-8 sebanyak 2 liter dilengkapi
aerator serta lampu
2. Diletakkan dibawah lampu neon lalu ditutup menggunakan kain hitam
3. Diinkubasi selama 48 jam
4. Ditimbang ekstrak sebanyak 3 mg
5. Dilarutkan dengan air laut sebanyak 50 ml
6. Dibuat 5 seri konsentrasi pada vial, kemudian dicukupkan 5 ml
7. Dibuat larutan kontrol dalam 5 vial
8. Dimasukkan larva yang sudah menetas kedalam vial yang berisi ekstrak
dan vial yang berisi larutan control masing-masing sebanyak 10 ekor
9. Ditambahkan 3 tetes ragi tiap vial yang berisi ekstrak dan larutan control
10. Lalu diitutup vial menggunakan aluminium foil, lalu dibuat rongga udara
pada aluminium foil
11. Disimpan selama 24 jam
12. Dihitung % mortalitas
13. Dihitung LC50
III.2.4 Pengujian Aktivitas Antioksidan
1. Ditimbang larutan DPPH 0,4 mMol sebanyak 0,0157 gram, lalu dilarutkan
sampai 100 ml dengan etanol absolute dalam labu ukur
2. Dipipet 1,0 mL DPPH 0,4 mM dan dicukupkan volumenya dengan etanol
absolut hingga 5,0 mL lalu dihomogenkan
3. Dibiarkan selama 30 menit kemudian diukur panjang gelombang
maksimum pada spektrofotometer UV-Vis
4. Ditimbang 10 mg vitamin C sebagai larutan stok 100 ppm, lalu dilarutkan
dengan aquades hingga 100 mL
5. Dipipet larutan stok masing-masing 100µL, 200 µL, 300 µL, 400 µL, 500
µL kedalam labu ukur kemudian ditambahkan 1,0 mL DPPH
6. Dicukupkan volumenya dengan etanol absolute samapi 5,0 mL hingga
diperoleh konsentrasi 2 ppm, 4 ppm, 6 ppm, 8 ppm dan 10 ppm
7. Dihomogenkan campuran dan diinkubasi selama 30 menit
8. Diukur absorbansinya pada panjang gelombang 516 nm
9. Ditimbang 50 mg ekstrak dan dilarutkan dengan etanol absolut hingga
50,0 mL
10. Dibuat 5 seri konsentrasi dengan dipipet larutan stok sesuai konsentrasi
11. Ditambahkan 1,0 mL DPPH dan cukupkan volumenya hingga 5,0 mL
dengan etanol absolut
12. Dihomogenkan campuran dan diinkubasi selama 30 menit, selanjutnya
diukur absorbansinya pada panjang gelombang 516 nm
13. Dihitung nilai IC50
III.2.5 Pengujian Aktivitas Antibakteri
 Pembuatan Medium NA (Nutrient Agar)
1. Dilarutkan Na (Nutrient agar) sebanyak 1,3 g dan agar sebanyak 2 g
dalam air suling, campuran dipanaskan di waterbath hingga larut
sempurna
2. Dicukupkan volume dengan air hingga 100ml, kemudian disterilkan di
autoklaf pada suhu 121 oC selama 15 menit
 Penyiapan Bakteri Uji
1) Peremajaan kultur murni bakteri uji
a. Diambil medium NA sebanyak 5ml, masukan dalam tabung reaksi steril
b. Ditutup dengan kapas dan aluminium foil
c. Didiamkan pada suhu kamar selama ± 30 menit hingga memadat pada
kemiringan 30 oC
d. Diambil bakteri Eschericia coli dan Staphylococcus aureus dengan
menggunakan ose steril
e. Diinokulasi secara aseptis dengan menggoreskan dalam medium NA
miring dalam tabung reaksi
f. Diinkubasi pada suhu 37 oC selama 24 jam
2) Pembuatan suspensi bakteri uji
1. Diambil menggunakan jarum ose (hasil peremajaan E. Coli dan S.
Aureus) tanpa mengenai bagian agarnya
2. Disuspensikan dengan larutan garam fisiologis NaCl 0,9%, kemudian
homogenkan
3. Diinkubasi suspense pada suhu 37 oC selama 24 jam, kemudian ukur
serapannya dengan spektrofotometri pada panjang gelombang 580 nm,
diperoleh transmitan 25%
 Penyiapan bahan ekstrak
1) Dibuat larutan ekstrak sesuai konsentrasi yang akan diuji (dengan cara
melarutkan ekstrak dengan aquadest steril atau pelarut yang cocok).
2) Diberi larutan ekstrak pada paper disk sebanyak 20µl
3) Diteteskan pada paper disk (atau dengan cara merendam paper disk
dalam larutan ekstrak ± 1 menit)
 Pengujian aktivitas antibakteri
1. Dicairkan medium NA steril pada suhu 45-70 oC, lalu dituang secara
aseptis ke dalam botol pengencer steril sebanyak 15ml
2. Ditambahkan susupensi bakteri uji sebnayak ± 20µl, homogenkan
3. Dituang larutan ke cawan petri secara aseptis lalu diratakan dan
dibiarkan memadat
4. Diletakkan paper disk yang berisi ekstrak secara aseptis diatas medium
secara simetri menggunakan pipet steril dengan jarak 20mm dari tepi
cawan petri
5. Diletakkan paper disk pada cawan petri yang berisi control pembanding
6. Diinkubasi cawan petri selama 24 jam pada suhu 37 oC. Setelah
diinkubasi, zona hambat yang terbentuk diamati, diukur menggunakan
jangka sorong dan difoto
III.2.6 Pengujian Kromatografi Lapis Tipis Preparatif
1. Disiapkan alat dan bahan
2. Diaktifkan lempeng KLT dan dan lempeng KLTP pada suhu 1140 c
selama 45 menit
3. Dibuat perbandingan eluen n-heksan:etil (8:2) sebanyak 20 mL, lalu
masukkan kedalam chamber dan dijenuhkan menggunakan kertas saring
4. Ditotolkan fraksi pada lempeng KLTP dalam bentuk pita
5. Dimasukkan lempeng kedalam chamber hingga noda terelusi sampai
batas atas
6. Diamati lempeng pada sinar UV 254 dan 366
7. Dibuat garis pada noda yang tampak
8. Dikerok pada bagian noda yang telah diberi tanda, kemudian dimasukkan
hasil kerokan kedalam tabung sentrifugasi lalu tambahkan etanol 96 %,
kemudian disentrifugasi selama 15 menit.
9. Diambil bagian supernatanya, kemudian ditotolkan pada lempeng KLT
10. Dimasukkan lempeng kedalam chamber yang berisi eluen n-heksan:etil
(8:2) dan diamkan hingga noda terelusi sampai batas
11. Diamati lempeng pada sinar UV 254 dan 366
12. Ditandai noda yang tampak
13. Dihitung nilai Rf-nya
III.2.7 PENGUJIAN KROMATOGRAFI LAPIS TIPIS 2 DIMENSI
1. Dsiapkan alat dan bahan
2. Disiapkan lempeng KLT berukuran 10 X 10
3. Diambil filrat dari hasil KLTP, selanjutnya diuji kemurniannya denga cara
ditototolkan pada ujung lempeng yang telah diberi tanda batas atas dan
bawah
4. Dimasukkan lempeng kedalam chamber yang berisi eluen n-heksan:etil
(8:2) dan diamkan hingga noda terelusi sampai batas atas
5. Diamati lempeng pada sinar UV 254 dan 366
6. Dielusi lempeng kembali dengan cara memutar 900 arah berlawanan
dengan jarum jam dengan menggunakan eluen yang sama
7. Diamati kembali lempeng pada sinar UV 254 dan 366
8. Ditandai apabila noda yang tampak tetap tunggal maka dapat
disimpulkan bahwa isolat telah murni, apabila isolat belum murni maka
dapat dilakukan proses pemisahan kembali.