BAB III

METODELOGI PENELITIAN

A. Tempat dan Waktu Penelitian

Studi peneilitian eksperimentral ini akan dilakukan di kamar operasi RSUD M
Yunus Bengkulu dan di Laboratorium Mikrobiologi Fakultas Kedokteran dan Ilmu
Kesehatan Universitas Bengkulu. Penelitian ini dilaksanakan selama 1 bulan (4
minggu), dimulai dari bulan Januari-Februari 2016.
B. Alat dan Bahan Penelitian
1. Alat-alat Penelitian
Peralatan yang digunakan pada penelitian ini adalah: 1) Kapas lidi steril; 2)
handscoon dan masker; 3) Lampu Bunsen; 4) Lampu spiritus; 5) Kotak pembawa
spesimen; 6) Kotak Pembawa Lidi Kapas Steril; 7) tabung reaksi; 8) rak tabung
reaksi; 9) Cawan Petri; 10) penjepit; 11) kertas label; 12) mikroskop; 13) kaca
objek; 14) rak pewarnaan; 15) Pipet tetes; 16) Vortek; 17) gelas ukur; 18) gelas
kimia; 19) plastik tebal; 20) spatula; 21) timbangan; 22) labu erlenmeyer; 23)
autoklaff; 24) Incubator; 25)tisu.
2. Bahan-bahan Penelitian
Bahan-bahan yang digunakan dalam penelitian ini , antara lain: 1) larutan
Ringer laktat steril; 2) Media agar NA; 3) larutan garam fisiologis; 4) safranin; 5)
etanol; 6) iodin; 7) aquades.
C. Desain Penelitian
Jenis penelitan ini adalah penelitian deskriptif dengan tindakan eksperimental
yaitu untuk melihat angka dan pola bakteri pada dinding, lantai dan meja operasi di
ruang operasi RSUD M Yunus Bengkulu.
D. Teknik Penyediaan Sampel Penelitian
Sampel penelitian ini diambil pada dinding, lantai dan meja operasi di ruang
operasi RSUD M Yunus Bengkulu dengan menggunakan lidi kapas steril yang
dibasahkan oleh larutan ringer laktat steril pada 5 titik di setiap dinding, lantai dan meja
operasi, dengan cara dua kali pengambilan sampel pada satu titik sehingga didapatkan
10 sampel pada dinding, 10 sampel pada lantai dan 10 sampel pada meja operasi dengan
total 30 sampel. Setiap sampel yang di ambil akan dilakukan pembiakan, pewarnaan
gram dan identifikasi biokimia di Laboratorium Mikrobiologi Fakultas Kedokteran dan
Ilmu Kesahatan Universitas Bengkulu.
E. Cara Kerja
1. Sterilisasi Alat dan Bahan
Sterilisasi adalah proses pembunuhan semua organisme dalam suatu
alat/bahan. Sterilisasi dapat dilakukan dengan cara mencuci alat dan bahan yang
akan digunakan sampai bersih. Setelah kering alat dan bahan yang akan disterilkan
dibungkus menggunakan kertas dan dibungkus oleh plastik tebal yang tahan panas,
hal ini bertujuan untuk mencegah alat dan bahan yang akan disterilkan
menggunakan autoklaff tidak terkena air. Cara mengguakan Autoklaf Otomatis
adalah: 1) Mengisi autoklaf dengan aquades sampai batas yang ditentukan.
Memeriksa juga tempat buangan air diluar autoklaf, jangan sampai isinya
berlebihan atau kurang; 2) Selanjutnya masukkan alat dan bahan yang telah
dibungkus kedalam autoklaff; 3) Menutup autoklaf rapat-rapat, memeriksa tombol
penutup agar benar pada posisi batas akhir ‘close’; 4) Menyalakan autoklaf,
mengatur suhu, tekanan dan waktu sterilisasi yang diinginkan. Sterilisasi yang
umum adalah 1000C. tekanan 15 lbs selama 15 menit; 5) Menekan tombol star,
membiarkan hingga tanda bunyi kedua yang menunjukan bahwa kondisi sterilisasi
telah tercapai dan tekanan uap dalam autoklaf telah kembali nol; 6) Membuka
autoklaf dan mengambil isinya yang telah steril dengan hati-hati (Muhiddin, 2007).

2. Pembuatan Media Agar NA dan agar miring NA

Komposisi : Peptone dari daging 5 g/L, Ekstrak daging 3 g/L, Agar-agar 12 g/L
Cara pembuatan:
a. Melarutkan 20 gr Nutrient agar dalam 1 L aquades
b. Mendidihkan menggunakan hot plate
c. Menghomogenkan menggunakan magnetic stirrer
d. Mensterilkan menggunakan autoclave pada suhu 1210C selama 15 menit

Untuk pembuatan agar miring NA, cukup masukkan agar NA ke dalam tabung
reaksi, tutup dengan kapas dan letakkan dalam keadaan miring dengan kemiringan
30-450

3. Pengambilan Sampel
Pengambilan sampel dilakukan pada dinding, lantai dan meja operasi di ruang
operasi RSUD M Yunus Bengkulu dengan cara sebagai berikut: 1) tentukan letak 5
 titik yang akan digunakan sebagi tempat pengambilan sampel (penentuan titik
dilakukan sesuai dengan tempat); 2) Gunakan handscoon dan masker; 3) nyalakan
spiritus di antara tempat yang akan diambil sampelnya; 4) persiapkan lidi kapas
steril (buka plastik lidi kapas dengan hati-hati dan teteskan sedikit larutan ringer
laktat steril pada kapas); 5) lakukan swab pada titik yan akan dilakukan
pengambilan sampel dengan cara swab satu arah sekali dan balikkan sisi lidi kapas
sesudahnya lakukan swab lagi dengan cara yang sama; 6) masukkan kembali lidi
kapas kedalam plastik pembawanya dan tutup kembali dengan rapat; 7) simpan lidi
kapas pada tempat pembawa lidi kapas yang telah disediakan (susun sesuai dengan
letak sampel diambil), lakukan sekali lagi pengambilan sampel pada titik yang sama
menggunakan lidi kapas baru; 8) lakukan hal yang sama untuk mengambil sampel
pada setiap titik yang dibutuhkan.
4. Pembiakan sampel
a. Siapkan media agar NA yang telah dibuat sebelumnya sebanyak 30 buah,
masing-masing diberi contoh uji, label nama sampel, tanggal pengujian, dan
volume contoh uji (tingkat pengenceran).
b. Sampel pada lidi kapas di buka kembali dan dimasukkan kedalam tabung reaksi
yang telah berisi larutan garam fisiologis (NaCl) sebanyak 3 ml, dikocok
memutar menggunakan vortek. Selanjutnya diambil 1 ml dan diinokulasikan ke
dalam 2 cawan petri steril masing-masing 1ml dilakukan secara aseptis
(pengenceran 10º).
c. Tuangkan medium agar (NA) ke dalam 2 cawan petri sebanyak 15-20 ml berisi
contoh uji dari usap dinding dan lantai dan 1 cawan petri sebagai control,
goyangkan memutar sehingga contoh uji dan medium akan bercampur merata.
d. Diamkan cawan petri yang berisi contoh uji dan control pada suhu ruangan
sehingga medium membeku kemudian diinkubasikan ke dalam incubator pada
suhu 35°C selama 1x24 jam dengan posisi cawan petri terbalik.
e. Amati dan catat pertumbuhan coloni serta hitung angka bakteri.
5. Cara penghitungan angka bakteri melalui jumlah koloni
Dak ado bukunyo amb bntu cri sumbernyo yoo
6. Pewarnaan gram
a. Membersihkan gelas alas denagn kertas saring dan melewatkannya di api untuk
menghilangkan kotoran dan lemak.
 b. Membuat lingkaran kira-kira berdiameter 2-3 cm di bagian bawah gelas alas
menggunakan pensil gelas dan beri label.
c. Membuat sediaan pada gelas alas, yaitu suspensi bakteri disebarkan di atas gelas
sehingga merupakan lapisan tipis, keringkan, lalu sediaan ini direkatkan di aats
nyala api dua atau tiga kali.
d. menuangkan crystal violet dan dibiarkan selama 1 menit.
e. mencuci dengan air mengalir secara perlahan.
f. menuang cairan Gram’s iodine (lugol), dibiarkan selama 1 menit.
g. mencuci dengan air mengalir secara perlahan.
h. mencelupkan ke dalam etil alkohol 95% beberpaa detik sehingga tidak ada lagi
zat ungu yang mengalir dari sediaan.
i. mencuci dengan air
j. mewarnai dengan safranin selama 45 detik, mencuci dengan air dan keringkan
di udara
k. meneteskan satu tetes minyak emersi lalu lihat di bawah mikroskop dengan
perbesaran 10x100
7. Identifikasi bakteri menggunakan teknik biokimia
F. Identifikasi Variabel

1. Variabel terikat : angka dan pola bakteri,

2. Variable bebas : dinding, lantai dan meja operasi di ruang operasi RSUD
M Yunus Bengkulu.
3. Variabel terganggu:
a. Terkendali:
 Cara kerja penelitian
 Teknik pemeriksaan
b. Tak terkendali
 Cara desinfeksi pada dinding dan lantai.
G. Analisis Data
Data yang diperoleh dari hasil pembiakan adalah angka bakteri, dan data dari
pewarnaan gram merupakan bakteri gram manakah dari sampel yang diambil, dan hasil
identifikasi bakteri menentukan jenis bakteri apakah yang didapat pada setiap sampel.
Data-data ini dimasukkan kedalam tabel untuk diurutkan dari jumlah persentase bakteri
terbanyak.
H. Bagan Cara
Dinding, lantai dan meja
operasi di Kamar operasi
RSUD M Yunus provinsi
Bengkulu

Ambil sampel menggunakan lidi

kapas steril dibasahkan
menggunakan ringer laktat steril

Larutan NaCl

Tidak ada
bakteri Media Agar NA

Tidak ada Inkubasi pada suhu 35°C

pertumbuhan selama 1x24 jam
bakteri
Media Agar NA miring

Cek kontrol Ada pertumbuhan

agar bakteri (koloni) Pewarnaan Gram

Gram positif (+)

Hitung koloni Identifikasi biokimia

Gram negatif (-)

Angka Bakteri Jenis Bakteri