ELEKTROFORESIS

A. DIFINISI ELEKTROFORESIS
Elektroforesis adalah suatu cara analisis kimiawi yang didasarkan pada pergerakan
molekul-molekul protein bermuatan di dalam medan listrik (titik isoelektrik). Pergerakan molekul
dalam medan listrik dipengaruhi oleh bentuk, ukuran, besar muatan dan sifat kimia dari molekul
(TITRAWANI 1996). Pemisahan dilakukan berdasarkan perbedaan ukuran berat molekul dan
muatan listrik yang dikandung oleh makro-molekul tersebut. Bila arus listrik dialirkan pada suatu
medium penyangga yang telah berisi protein plasma maka komponen- komponen protein tersebut
akan mulai bermigrasi (RICARDSON dkk. 1986). Menurut STENESH dalam TITRAWANI
(1996) teknik elektroforesis dapat dibedakan menjadi dua cara, yaitu : elektroforesis larutan
(moving boundary electrophoresis) dan elektroforesis daerah (zone electrophoresis). Pada teknik
elektroforesis larutan, larutan penyangga yang mengandung makro molekul ditempatkan dalam
suatu kamar tertutup dan dialiri arus listrik. Kecepatan migrasi dari makro- molekul diukur dengan
jalan melihat terjadinya pemisahan dari molekul (terlihat seperti pita) di dalam pelarut. Sedangkan
teknik elektroforesis daerah adalah menggunakan suatu bahan padat yang berfungsi sebagai media
penunjang yang berisi (diberi) larutan penyangga. Media penunjang yang biasa dipakai adalah gel
agarose, gel pati, gel poliakrilamida dan kertas sellulose poliasetat. Adapaun menurut SARGENT
& GEORGE (1975) elektroforesis daerah disebut sebagai elektroforesis gel dengan dua buah
model yaitu horizontal dan vertikal. Metode yang biasa digunakan adalah model horizontal, karena
mempunyai beberapa keuntungan yaitu peralatan yang digunakan sangat sederhana, relatif murah
dan pemisahan untuk enzim tertentu dapat menghasilkan pemisahan yang lebih baik.

B. KEGUNAAN METODE ELEKTROFORESIS

Telah disebutkan di atas bahwa pola protein tertentu dari satu spesies hewan berbeda,
secara elektroforesis akan memperlihatkan pola protein yang berbeda pula pada hewan lainnya.
Faktor tersebutlah yang menyebabkan pola protein dapat digunakan untuk membedakan spesies
hewan. Perbedaan pola protein inilah yang seringkali digunakan sebab untuk membedakan
populasi secara tepat kadangkala tidak dapat dilakukan apabila hanya menggunakan pengamatan
melalui morfologis saja. Fenomena ini pula yang menyebabkan metode elektroforesis banyak
dilakukan untuk pengamatan taksonomi, sistematik dan genetic serta untuk mengindentifikasi
spesies hewan maupun tumbuhan (bio-sistematik). Dapat pula digunakan untuk melihat
phylogenetic recon- struction (rekonstruksi secara Filogenetik) dari suatu jenis hewan atau
tumbuhan. (PASTEUR, N, G. PASTEUR., F. BONHOMME., J. CATALAN., J. BRITTON. Dan
DAVIDIAN., 1988)
 Elektroforesis
Sebelum dilakukan percobaan sebaiknya disiapkan dahulu alat dan bahan kimia
yang akan digunakan. Alat yang biasa digunakan adalah tabung Eppendorf, mikropipet,
tip, mortat, tabung Erlenmeyer, gelas ukur, penangas air (dengan suhu 80°C), magnetic
stir- rer, magnectic bar, sentrifuga, pinset, timbangan,

pompa vacum, cetakan gel 20 x 16 x 1 cm 3 , timer, meja pendingin, pembungkus

plastik, freezer, kawat halus untuk memotong gel, inkubator, power supply, pisau,
penggaris, spidol, kantong plastik tebal untuk menyimpan gel setelah pewarnaan,
nampan plastik, spons dan alat-alat tulis. Sedangkan untuk bahan kimia yang digunakan,
tergantung dari hewan atau tumbuhan enzim apa yang akan diuji. Seperti misalnya
larutan pengekstra yang digunakan untuk jenis udang-udangan berdasarkan DICKSON
dkk, (1983) adalah menggunakan sistem enzim Esterase (EST), dan Malat
dehidrogenase (MDH). WIKNESWARI (1995) menggunakan Malik Enzim (ME), serta
CHELIAK & PITEL (1984) menggunakan Phosphat glukosa isomerase (PGI) dan lain
sebagainya. Untuk menentukan sistem enzim tersebut sebelumnya dilakukan uji
optimalisasi terlebih dahulu terhadap hewan yang akan diujikan. Cara kerja terdiri dari
beberapa tahap yaitu: 1. ekstraksi enzim, 2. pembuatan gel pati,3. penempatan sampel,
4. proses elektroforesis, 5. visualisasi sistem enzim, 6. observasi gel dan 7. Metode
analisis

 Prinsip kerja Elektrofoesis

Prinsip kerja dari elektroforesis adalah adanya pergerakan komponen bermuatan
positif (+) pada kutub negatif (-) serta komponen bermuatan negatif (-) pada kutub
positif (+). Pegerakan yang terjadi disebut "elektrokinetik" . Hasil yang didapatkan dari
elektroforesis adalaha elektroforegram yang memberikan informasi mengenai seberapa
cepat perpindahan komponen (tm) atau biasa disebut kecepatan migrasi. Besaran yang
digunakan sama dengan pada proses kromatografi. (BRUCE, A., D. BRAY., J. LEWIS,
M. RAFF.,ROBERTS dan J.D. WATSON 1994 )
 Skema Elektroforesis
Dari gambar diatas dapat dilihat bahwa komponen yang bermuatan positif akan
bergerak searah dengan medan listrik menuju kutub negatif. Apabila dalam
campuran terdapat dua jenis komponen, yakni (1) komponen negatif (-), dan (2)
komponen netral (N), maka komponen negatif akan bergerak menuju kutub positif
(+) sedangkan komponen netral (N) akan tetap diam. Skema alat elektroforesis
secara sederhana dapat dilihat pada gambar di bawah ini. Pada gambar tersebut
dapat dilihat komponen yang bermuatan positif akan mengalir ke arah kutub
negatif, sedangkan komponen bermuatan negatif akan mengalir ke arah kutub
positif.

C. MACAM ELEKTROFORESIS

1. Elektroforesis kertasElektroforesis kertas adalah jenis elektroforesis yang

terdiri dari kertas sebagai fase diam dan partikel bermuatan yang terlarut sebagai fase
gerak, terutama ialah ion-ion kompleks. Pemisahan ini terjadi akibat adanya gradasi
konsentrasi sepanjang sistem pemisahan. Pergerakan partikel dalam kertas tergantung
pada muatan atau valensi zat terlarut, luas penampang, tegangan yang digunakan,
konsentrasi elektrolit, kekuatan ion, pH, viskositas, dan adsorpsivitas zat terlarut.
 Sesuai dengan perkembangan ilmu bahan, elektroforesis kertas menjadi fasa pertama
dari perkembangan elektroforesis zona. Dengan menggunakan medium kertas,
pemisahan dan analisis terhadap asam amino, peptida, nukleotida, dan ion-ion logam
yang kecil dapat dilakukan.

Kelemahan penggunaan kertas selulosa asetat adalah: adanya gangguan yang

disebabkan oleh adanya gugus OH- yang terdapat pada selulosa yang dapat berinteraksi
dengan molekul polar sehingga daya migrasi molekul tersebut terganggu dan menjadi
lebih rendah (Harjadi 1993). Kelemahan ini dapat diatasi dengan cara asetilasi gugus
hidroksil dengan menggunakan kertas selulosa asetat yang tidak polar. Hal ini
menyebabkan migrasi molekul polar tidak terganggu, resolusi lebih baik, dan proses
pemisahan berlangsung lebih cepat.
Keuntungan penggunaan kertas selulosa asetat adalah:
 proses migrasi lebih cepat
 pemisahan spot menjadi lebih kecil
 mudah memisahkan sampel dengan spektrofotometri
 mudah dilarutkan dalam pelarut dalam jumlah sedikit.
Pada elektroforesis kertas selulosa asetat, kertas selulosa asetat harus dibersihkan
dengan cara kering dalam percobaan ini. Cara kering lebih baik resolusinya dan
spotnya lebih kecil daripada cara basah. Oleh karena itu, percobaan ini
menggunakan medium selulosa asetat.

2. Elektroforesis gel

Elektroforesis gel ialah elektroforesis yang menggunakan gel sebagai fase diam
untuk memisahkan molekul-molekul. Awalnya elektoforesis gel dilakukan dengan
medium gel kanji (sebagai fase diam) untuk memisahkan biomolekul yang lebih besar
seperti protein-protein. Kemudian elektroforesis gel berkembang dengan menjadikan
agarosa dan poliakrilamida sebagai gel media.
Dalam elektroforesis gel terdapat dua material dasar yang disebut fase diam dan
fase bergerak (eluen). Fase diam berfungsi "menyaring" objek yang akan dipisah,
sementara fase bergerak berfungsi membawa objek yang akan dipisah. Sering kali
ditambahkan larutan penyangga pada fase bergerak untuk menjaga kestabilan objek
elektroforesis gel. Elektroda positif dan negatif diletakkan pada masing-masing ujung
aparat elektroforesis gel. (NEI, M. 1977. F-Statistic and Analysis )
Zat yang akan dielektroforesis dimuat pada kolom (disebut well) pada sisi elektroda
negatif. Apabila aliran listrik diberikan, terjadi aliran elektron dan zat objek akan
bergerak dari elektroda negatif ke arah sisi elektroda positif. Kecepatan pergerakan ini
berbeda-beda, tergantung dari muatan dan berat molekul DNA. Kisi-kisi gel berfungsi
sebagai pemisah. Objek yang berberat molekul lebih besar akan lebih lambat
berpindah.

Gambar Prosedur Kerja Elektroforesis Gel

3. Elektroforesis kapiler
Elektroforesis kapiler adalah metode elektroforesis yang digunakan untuk
memisahkan asam amino, protein, lipid, karbohidrat, dan nukleotida dengan
resolusi tinggi yang dilakukan pada pipa kapiler berisi buffer. Metode ini mulai
digunakan secara luas pada akhir tahun 1940 untuk aplikasi dalam berbagai bidang
seperti bioteknologi, kimia, lingkungan, dan analisis farmasi. Elektroforesis kapiler
menggunakan listrik bertegangan tinggi yang menyebabkan semua komponen ion
 atau molekul netral bergerak ke katoda. Deteksi dapat dilakukan dengan teknik
pendeteksian spektrometri atau elektrokimia. Teknik pemisahan ini dipengaruhi
oleh tegangan listrik, koefisien difusi, panjang, dan diameter pipa kapiler, serta

konsentrasi sampel. Metode ini memiliki efisiensi dan selektivitas yang baik namun
boros listrik karena menggunakan tegangan tinggi dan alatnya juga mahal.
Elektroforesis kapiler (CE), juga dikenal sebagai zona elektroforesis kapiler, dapat
digunakan untuk memisahkan spesies ion oleh muatan mereka dan gesekan
kekuatan dan radius hidrodinamika. Elektroforesis , bermuatan listrik bergerak
analit dalam konduktif cairan menengah bawah pengaruh suatu medan listrik .
Diperkenalkan pada tahun 1960-an, teknik elektroforesis kapiler (CE) dirancang
untuk spesies terpisah berdasarkan ukuran mereka untuk mengisi rasio dalam
interior sebuah kapiler kecil penuh dengan elektrolit.

D. MEDIUM PENDUKUNG
Elektroforesis untuk makromolekul memerlukan medium pendukung untuk
mencegah terjadinya difusi karena timbulnya panas dari arus listrik yang digunakan. Gel
poliakrilamid dan agarosa merupakan medium pendukung yang banyak dipakai untuk
separasi protein dan asam nukleat. Efek penguapan juga dapat diturunkan minimal jika
elektroforesis dilakukan di medium pendukung yang dicelupkan dengan larutan buffer.
Pemisahan sempurna suatu campuran dapat terjadi efektif dalam zona tertentu.
Meskipun medium pendukung relatif stabil (inert), komposisinya mungkin akan
menyebabkan penyerapan, migrasi elektron (elektro osmosis) atau penyaringan
berdasarkan ukuran molekulnya, yang kesemuanya mempengaruhi kecepatan gerak
senyawa.
1. Cellulose asetat
2. Larutan Buffer
Larutan buffer (penyangga) ini menstabilkan pH medium pendukung. Buffer juga
dapat mempengaruhi kecepatan gerak senyawa karena beberapa hal, yaitu :
a. Komposisi
Buffer harus tidak mengikat senyawa yang dipisahkan karena akan mempengaruhi
kecepatan gerak. Buffer borat dipakai untuk memisahkan karbohidrat, karena dapat
membentuk gabungan yang bermuatan listrik dengan karbohidrat.
 b. Konsentrasi
Dengan naiknya kekuatan ion buffer, jumlah arus listrik yang terbawa meningkat
dan bagian aliran yang dibawa sampel menurun, sehingga memperlambat
geraknya. Kekuatan ion tinggi dalam buffer akan meningkatkan arus keseluruhan
sehingga panas juga meningkat, biasanya dipilih 0,05 -0,10M.
c. pH
Tingkat ionisasi asam-asam organik akan bertambah apabila pH bertambah,
sebaliknya untuk basa-basa organik,oleh sebab itu tingkat kecepatan geraknya juga
terpengaruh oleh pH. Kedua pengaruh dapat terjadi pada senyawa seperti asam
aminoyang memiliki sifat asam dan basa.
3. Medan elektrik
Apabila voltase diberikan diantara dua elektroda, arus ditentukan oleh tahanan dalam
medium.
a. Voltase
Apabila jarak antara dua elektroda adalah 1 meter dan perbedaan potensial antara
keduanya adalah V volt sehingga gradient potensialnya adalah V/1m. Kenaikan
gradient potensial akan menyebabkan kecepatan gerak ion.
b. Aliran listrik
Arus aliran listrik dalam larutan antara dua elektroda disebabkan umumnya oleh
ion buffer dan sedikit oleh ion dalam sampel. Kenaikan voltase akan meningkatkan
jumlah muatan yang dipindahkan setiap detik kearah elektroda. Jarak yang
ditempuh ion akan sebanding dengan waktunya.
c. Tahanan
Medium elektroforesa menimbulkan pada aliran ion sebanding dengan jenis
medium, jenis buffer dan konsentrasinya. Tahanan akan meningkat dengan
bertambahnya jarak antara elektroda, namun berkurang dengan bertambahnya luas
permukaan elektroda dan konsentrasi ion dalam buffer.

E. KOMPONEN UTAMA ALAT

1. Larutan elektrolit: larutan pembawa komponen umumnya buffer dengan pH tertentu.
2. Zat pendukung: tempat pemisahan terjadi. Biasanya berupa kertas(selulosa asetat,
selulosa nitrat), gel kanji, gel polikrilamid, busa poliuretan, agar-agar.
3. Elektroda: dengan anoda dan katoda yang dihubungkan arus listrik.
 Rangkaian Alat Elektroforesis

Berdasarkan bentuk alat, elektroforesis dibagi menjadi dua:

1. Elektroforesis Planar
2. Elektroforesis Kolom
Pemisahan pada elektroforesis, selain disebabkan oleh fenomena elektrokinetik,
juga dapat disebabkan karena adanya filtrasi, yakni interaksi dengan fasa diam.
Pemisahan yang disebabkan karena interaksi tersebut tidak disebut elektroforesis,
melainkan "elektrokromatografi". Arus yang digunakan pada elektroforesis adalah arus
DC dengan nilai tegangan kurang dari 1000 volt. Apabila digunakan lebih dari 1000
volt maka akan terjadi efek pemanasan pada media gel. Efek pemanasan tersebut
disebut "efek Joule" yang disebabkan karena adanya tumbukan partikel elektron. Efek
pemanasan dapat dihilangkan dengan dua cara, yakni:
1. Pendinginan
2. Efek Konveksi. Efek konveksi adalah suatu cara untuk membebaskan panas dengan
mengganti bentuk planar menjadi bentuk kolom atau kapiler. Kapiler yang
digunakan dibuat dari silika yang bermuatan netral atau negatif. Bagian luar kapiler
dilapisi dengan polimer agar bersifat lentur.

Electro Osmotic Flow (EOF)

 Jika kapiler pada elektroforesis diberi tegangan, maka akan terjadi perpindahan muatan
ke arah kutub negatif (-). Perpindahan yang terjadi disebut "electroosmotic flow (EOF)".
Pergerakan elektrolit yang tidak dipengaruhi oleh EOF disebut "elektroforetik". Prinsip
kerja EOF dapat dilihat pada gambar berikut.

Dari gambar diatas dapat dilihat bahwa terjadi pemisahan anatara muatan positif
dengan muatan negatif akibat adanya lapis rangkap listrik. Lapis rangkap listrik terjadi
akibat pemberian tegangan yang sangat tinggi pada dinding pipa kapiler. Sebelum
diberi tegangan, permukaan kapiler akan bermuatan netral, setelah diberi tegangan,
maka ion negatif akan menempel pada permukaan sebagai lapis pertama. Ion positif
akan mengikuti ion negatif membentuk lapisan pada permukaan, dalam hal ini ion
positif akan membentuk lapisan kedua. Sistem ini disebut lapis rangkap listrik.
Kecepatan migrasi elektroforesis dipengaruhi oleh ukuran, bentuk, serta muatan
dari masing-masing komponen. Kecepatan migrasi yang tinggi akan terjadi jika
komponen memiliki muatan tinggi dan ukuran rendah, dengan kata lain memiliki
densitas muatan yang tinggi. Densitas muatan sendiri adalah perbandingan anatara
muatan dengan ukuran yang dimiliki oleh suatu komponen.

F. MANFAAT
Elektroforesis gel secara luas digunakan untuk memperkirakan ukuran fragmen
DNA , misalnya dalam pemetaan pembatasan DNA kloning. Metode ini juga digunakan
dalam diagnosis genetika molekuler atau sidik jari genetik melalui analisis PCR.
Elektroforesis gel agarosa juga digunakan untuk menyelesaikan DNA melingkar dengan
perbedaan superkoil topologi, dan untuk menyelesaikan fragmen yang berbeda karena
sintesis DNA. Selain menyediakan media yang tepat untuk analisis ukuran fragmen, gel
memungkinkan pemurnian fragmen DNA.
 DAFTAR PUSTAKA

BROWN, A.H.D dan B.S. WEIR 1983. Measur- ing Variability in Plant Population. In : S.D.
TANKSLEY and T. J. ORTON (eds.), Isozymes in plant Genetics and Breed-
ing. Part A. Elsevier Science Publisers, Amsterdam: 219 pp.

BRUCE, A., D. BRAY., J. LEWIS, M. RAFF.,ROBERTS dan J.D. WATSON 1994. Biologi
Molekuler Sel Mengenai Sel. Edisi kedua PT. Gramedia Pustaka Utama, Jakarta: 346 hal.

CHELIAK, W. M dan J. A. PITEL 1984. Tech- niques for Starch Gel Electrophoresis of
Enzymes from Forest Tree Species. In- formation Report PI - X - Y2. Petawawa National
Forestry Institute. Canadian Forestry Service Agriculture Canada : 127 pp.

DICKSON, R, SIEGMUND., S. SCHNEIDER, H. J. LINZEN, B. GIELENS, C. PREAUX., G.

LONTIE., R. KELLER- MANN dan J. F. LOTTSPEICH 1983. Complete Amino Acid
sequence of a Functional Unit from a Molluscan Hemocyanin (Helix pomatia). Biol. Chem.
Hoppe-Seyler 368 : 617 pp.

NEI, M. 1977. F-Statistic and Analysis of Gen Diversity in Subdivided Populations. Ann. Hum.
Genet, 41:255.

PASTEUR, N, G. PASTEUR., F. BONHOMME., J. CATALAN., J. BRITTON. Dan

DAVIDIAN., 1988. Practical Isozyme Genetics. Laboratory of Ecological Ge- netics,
University of Montpellier 2. France: 54 pp.