ESCUELA SUPERIOR POLITÉCNICA DE CHIMBORAZO

FACULTAD: CIENCIAS
ESCUELA DE BIOQUÍMICA Y FARMACIA
CARRERA: BIOQUÍMICA Y FARMACIA

GUÍA DE LABORATORIO DE MICROBIOLOGÍA

INFORME DE LABORATORIO DE MICROBIOLOGÍA CLÍNICA

PRÁCTICA No. 5- Coprocultivo

1. DATOS GENERALES:

NOMBRE: estudiante(s) CODIGO(S): estudiante(s)

Miguel Ángel Rivera Ruiz 2860

Lesly Katherine Moyón Rivera 2857

GRUPO No.: 3

DOCENTE: Dra. Verónica Cando

NIVEL: Cuarto Nivel PARALELO: “B”

LUGAR DE REALIZACIÓN: Laboratorio de Microbiología

FECHA DE REALIZACIÓN: FECHA DE ENTREGA:

20/07/2016 27/07/2016

2. OBJETIVO(S):

2.1. GENERAL

 Conocer la técnica microbiológica empleada para realizar el coprocultivo

como método estándar para el diagnóstico de infección gastrointestinal.

2.2. ESPECÍFÍCOS

 Adiestrar al alumno en el procesamiento de cultivos bacterianos, que

incluyen: coloraciones, preparación de medios de cultivo y de pruebas
bioquímicas de identificación bacteriana, preparación de antibiogramas, etc.
  Distinguir entre las pruebas bioquímicas de identificación bacteriana para
microorganismos Gram positivos, Gram negativos o las que sirven para
ambos tipos bacterianos.

 Diferenciar la flora normal de la flora patógena y aprender el manejo

correcto de la toma de muestras de heces.

3. MARCO TEÓRICO:

ANALISIS MICROBIOLOGÍCO DE COPROCULTIVO

La porción inferior del intestino tiene una flora bacteriana normal excesivamente
amplia. Los microorganismos con mayor prevalencia son los anaerobios (Bacteroides,
bácilos gram positivos, Estreptococos), microorganismos entéricos gran negativos
y Enterococcus faecalis. Cualquier intento por aislar bacterias patógenas de las heces
implica la separación de las especies patógenas, usualmente a través del empleo de
medios selectivos diferenciales y de cultivos enriquecidos. Las principales causas de
trastornos gastrointestinales agudos incluyen a los virus, las toxinas (de:
Estafilococos, Vibriones, Escherichia coli), bacilos entéricos gran negativos invasores,
los fermentadores lentos de la lactosa, la Shigella, la Salmonella y
la Campilobacterias. La importancia relativa de estos grupos tiene grandes
discrepancias en las distintas partes del mundo.

Las heces y los raspados rectales son los especímenes de que se dispone con mayor
facilidad. Debe anotarse, en el examen macroscópico la presencia de sangre, moco o
helmintos en la inspección inicial. Se suspenden los especímenes en un caldo
selectivo como el Caldo de Tetrationato y se cultivan sobre medios ordinarios así como
en medios selectivos diferenciales, por ejemplo Agar EMB, Agar McConkey, Agar S-S,
para permitir la separación de los bacilos gran negativos que no fermentan la lactosa
de otras bacterias entéricas comunes.

Los frotis teñidos pueden revelar una prevalencia de leucocitos y de ciertos

microorganismos anormales como Cándida o estafilococos, pero no pueden utilizarse
para diferenciar las bacterias entéricas patógenas de las de la flora normal, por lo que
deben realizarse otro tipo de pruebas para discriminar los tipos de bacterias presentes
en la muestra como son las pruebas bioquímicas.

MUESTRAS PARA COPROCULTIVO

Para la recogida, transporte y manipulación de muestras podrán tenerse en cuenta los

protocolos establecidos por la Sociedad Española de Enfermedades Infecciosas y
Microbiología Clínica. La muestra de elección para cultivo de agentes bacterianos
productores de gastroenteritis es una porción de heces diarreicas, nunca heces
formes. A partir del cuarto día de hospitalización no debe realizarse coprocultivo para
determinación de gérmenes entero patógenos habituales salvo en situaciones
especiales.

Las muestras de heces se procesarán para cultivo dentro de las 4-6 horas siguientes a
su emisión. Si esto no es posible, es conveniente su conservación en un medio de
transporte adecuado manteniéndose en refrigerador hasta su siembra.. Los
escobillones rectales son aceptables sólo para cultivos de muestras de niño con
diarrea aguda. Los escobillones deben mostrar heces. No se recomienda el cultivo
sistemático de meconio o heces de recién nacido para diagnóstico de infección
neonatal.

FORMA DE RECOLECCIÓN DE LA MUESTRA

Instrucciones para la Toma de la Muestra

1. Obtenga la muestra antes de todo tratamiento con antibióticos. En caso que

esto no sea posible, informe al laboratorio el tratamiento que está recibiendo.
2. La muestra puede ser recogida en su casa o en el laboratorio. En caso de
hacer la recolección en su casa, debe pedir previamente al laboratorio el
material necesario, el cual consiste en un medio de transporte con un hisopo,
que va dentro del equipo. Guarde este material en un sitio fresco (nunca en
nevera), fuera del alcance de los niños.
3. Debe recoger las heces en la forma más estéril posible. Puede ser un plato, un
vaso de cama o un recipiente cualquiera. Lo más importante es que hayan sido
lavados con agua y jabón y luego con abundante agua hervida. En caso
necesario (como en niños), es preferible realizar un hisopado rectal, que debe
ser tomado por el personal entrenado.
4. Una vez recogidas las heces, impregne con las mismas el hisopo suministrado,
prefiriendo las partes que contengan moco, sangre y restos celulares.
Introduzca el hisopo hasta el fondo del tubo con el medio gelatinoso, dejándolo
dentro del tubo. Tápelo inmediatamente y manténgalo en ambiente fresco
(nunca en nevera) y llévelo lo más pronto posible al laboratorio.
5. Favor tener en cuenta las siguientes precauciones:
 No destapar el tubo, excepto para introducir la muestra; no tocar con los dedos
la parte interior de la tapa, ni del recipiente, ni el algodón del hisopo.
 Identifique la muestra, escribiendo claramente en la etiqueta su nombre
completo, edad, hora y fecha de la toma de muestra.
 No llene el tubo con heces: es suficiente con la cantidad que queda adherida al
hisopo.
 Cuando las heces son líquidas, asegúrese de impregnar bien el hisopo.
 Las personas que sufren de estreñimiento pueden utilizar un laxante salino (sal
de fruta) y recoger para el examen la segunda o tercera evacuación (nunca la
primera).
 En niños, pueden utilizarse supositorios de glicerina pediátricos.
 En lactantes, puede recoger la muestra directamente del pañal, pero
asegurándose que las heces hayan sido recién emitidas y que no hayan sido
absorbidas por el pañal.
 4. METODOLOGÍA

4.1. PREPARACIÓN DE MEDIOS DE CULTIVO

- Medio Sólido: AGAR SANGRE, AGAR MUELLER HINTON, AGAR EMB,

MACKONCKEY, UTI

•Pesar la cantidad de medio de cultivo óptima y rehidratarlo con agua destilada en un matraz de
erlenmeyer.
.

•Autoclavar el matraz de erlenmeyer con un tapón de gasa sin cerrarlo totalmente durante 30 minutos
a una presión de 103kPa y una temperatura de 121°C.
.

•Sacar del autoclave la preparación, esperar que adquiera la temperatura adecuada,

aproximadamente unos 40ºC.
.
•Distribuir el medio en las placas de Petri estériles dentro de una campana de flujo laminar o en las
proximidades del mechero, flameando bien la boca del matraz de erlenmeyer para evitar
. contaminaciones.

•Dejar que el medio solidifique.

.

Para el AGAR SANGRE:

•Obtener de manera aséptica la cantidad precisa de sangre en un tubo completamente

estéril (esto quiere decir la concentración exacta de 5% para el volumen de agar
. preparado).

•Mezclar con cuidado el agar con la concentración exacta de sangre evitando que se
formen grumos.
.
•Distribuir el medio en las placas de Petri estériles dentro de una campana de flujo laminar
o en las proximidades del mechero, flameando bien la boca del matraz de erlenmeyer
. para contaminaciones.

•Dejar que el medio solidifique.

.

NOTA: Si preparó los medios con anterioridad guardarlos en una nevera a 4ºC.
4.2. PREPARACIÓN DE MEDIOS DE CULTIVO, EMPLEADOS EN LAS
DIFERENTES PRUEBAS BIOQUÍMICAS DE IDENTIFICACIÓN BACTERIANA

Seguir las indicaciones expuestas en cada frasco de medios de cultivo para pruebas
bioquímicas y disponer en tubos de ensayo estériles la cantidad requerida para cada
prueba, cubrir los tubos con un tapón estéril e inclinarlos de modo que se obtenga la
forma de pico de flauta en la superficie del tubo (medio Urea, Citrato, Kigler), para el
agar MIO no es necesario obtener la disposición de pico de flauta.

Dejar en posición inclinada los medios que requieran la disposición de pico de

flauta hasta que solidifiquen.

Las pruebas bioquímicas a emplearse en la práctica incluyen métodos que permitan

dar indicios sobre qué tipo de bacteria se ha desarrollado en nuestro cultivo, que
incluyen: Prueba de la catalasa, oxidasa, identificación de hemólisis, sensibilidad a
diferentes antimicrobianos, fermentación y crecimiento en agar manitol salado,
producción de gas, etc.

4.3. INCUBACIÓN: de las pruebas bioquímicas y del Antibiograma de acuerdo a las

indicaciones expuestas a una temperatura de 35 a 37ºC durante 24 horas.

4.4. TINCIÓN

Preparar el frotis de la muestra directa, secar y fijar al calor.

Proceder a la coloración de Gram con las condiciones e

indicaciones expuestas y aprendidas en prácticas anteriores.

4.5. OBSERVACIÓN DE LAS TINCIONES

 Las bacterias Gram-positivas presentarán una coloración violeta mientras que

las Gram-negativas la presentarán roja o rosa. La identificación de las bacterias
Gram-positivas puede ser problemática, solamente cuando las bacterias Gram-
positivas se encuentran en crecimiento exponencial (cultivos jóvenes) la
reacción es clara; en fase estacionaria (cultivos viejos).
 4.6. REALIZACIÓN DE PRUEBAS BIOQUÍMICAS BÁSICAS

 Una vez visualizadas las coloraciones de GRAM de las bacterias problema y

observadas las características generales de las colonias desarrolladas,
proceder a realizar de acuerdo a sus particularidades, las diferentes pruebas
bioquímicas que nos ayudarán en la identificación presuntiva y definitiva de los
microorganismos, para luego anotar en sus resultados, la familia, género y
especie bacteriana.

4.7. REALIZACIÓN DEL ANTIBIOGRAMA

Al día siguiente se
Una vez
medirán con una
reconocidas la o las Para la regla los halos de
bacterias, proceder colocación de los Incluir en su
inhibición por la
a realizar el discos de antibiograma, los
parte trasera de la
respectivo sensibilidad se discos de Posteriormente placa y se realizará
antibiograma, sensibilidad con
usarán pinzas se llevarán las la respectiva
incluyendo discos concentraciones
estériles y la placas a incubar interpretación con
de antibióticos que adecuadas que
distancia entre por 24 horas. ayuda de las tablas,
se emplean en permitan
disco y disco no donde se
especies diferenciar tipos
deberá ser determina si existe
bacterianas Gram bacterianos.
Sensibilidad (S) o
positivas y Gram menor a 1,5 cm. Resistencia (R) al
negativas.
antibiótico.

4.8. OBSERVACIÓN DE LOS RESULTADOS

 En primer lugar, observar a simple vista diversas características como el color,

tamaño y el borde de las colonias desarrolladas en los diferentes agares así
como el olor y la turbidez del medio, ya que en algunos casos suelen ser
distintivos de un determinado tipo de microorganismo y pueden servir de ayuda
a la hora de su identificación.

 Transcurrido el tiempo necesario (24 horas) para la lectura de las diferentes

pruebas bioquímicas, interpretar los resultados de acuerdo a:

- Crecimiento bacteriano
- Cambio de pH y color
- Presencia de movilidad
- Presencia de fermentación
- Producción de gas
- Presencia de actividad enzimática
- Producción de ácido sulfhídrico, etc.

 De acuerdo a sus conocimientos en cuanto a las pruebas de identificación

bacteriana (presuntivas y definitivas), para microorganismo Gram positivos y
Gram negativos y mediante la utilización de tablas de identificación bacteriana
propuestas, determinar la familia, género y de ser posible la especie bacteriana
a la cual pertenece el microorganismo problema.
 5. EQUIPOS Y MATERIALES:

 Mechero bunsen o similar.

 Asas calibradas de siembra (0,001).
 Placas de Petri con Agar sangre, agar Macconkey, UTI, agar Mueller Hinton.
 Portaobjetos.
 Cubetas de tinción o similar.
 Colorantes para tinción Gram.
 Microscopio.
 Hisopos estériles.
 Aceite de inmersión.
 Discos de sensibilidad antimicrobiana.
 Material de bioseguridad: mandil, guantes, mascarilla, gorro.
 Peróxido de Hidrógeno.
 Medios de cultivo para crecimiento bacteriano y para pruebas bioquímicas.
 Tubos de ensayo con solución salina estéril.
 Escala Mac Farland.
 Bombigrafo

6. RESULTADOS Y DISCUSIÓN:

OBSERVACIONES DESCRIPCION

EXAMEN EN FRESCO

Para el examen en fresco se utilizó lugol

que nos permite dar un cierto color y una
mejor diferenciación.
Se pudo observar entoameba coli, fibras,
grasas y almidón.

TINCION GRAM

Se pudo evidenciar en la tinción gram de

muestra directa de heces Bacilos Gram
negativos abundantes, la presencia de
fibras.
Esto fue tanto en la muestra 11 como la
15

TINCION GRAM DESPUÉS DEL

CULTIVO.

Se pudo observar claramente Bacilos

gram negativos en toda la muestra muy
PRUEBA DE CATALASA
La prueba catalasa nos dio positiva tanto
para la muestra 11 y 15 evidenciándose
entorobacterias. En este caso
Escherichia coli.
PRUEBA OXIDASA
Esta prueba nos dio negativa para las
dos muestras.

MUESTRA 11
AGAR SANGRE
Se pudo observar el crecimiento colonias
medianas blanquecinas y redondeadas,
algunas de estas cepas produciéndose
una beta hemolisis.

AGAR MACCONKEY
Se observa cepas de color rosado y el
ligero cambio de color.

UTI
Se pudo observar colonias de color fucsia
perteneciente a Escherichia coli y
colonias de color celeste perteneciente a
Enterococcus fecalis
MUESTRA DESPUES DE CALDO
BISMUTO
AGAR SANGRE
Se pudo observar el crecimiento colonias
medianas blanquecinas y redondeadas,
algunas de estas cepas produciéndose
una beta hemolisis.

AGAR MACCONKEY
Se observa cepas de color rosado y el
cambio de color a fucsia no se dio.

UTI
Se pudo observar colonias de color
celeste perteneciente a Enterococcus
fecalis y a Shigella
PRUEBAS BIOQUIMICAS

KLIGER. Crecimiento -
Gas sulfhídrico +
Ácido sulfhídrico –
Lactosa, glucosa +
CITRATO. Negativo
Sin crecimiento -
MIO.
Indol +
Ornitina -
Motilidad +/- Variable
Urea. Negativo
sin crecimiento
 ANTIBIOGRAMA
Nos permite ver la sensibilidad i
resistencia a algunos medicamentos.
CIP sensible
CN intermedia
SIT resistente
AM sensible

7. CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES:

7.1. CONCLUSIONES

 Para el examen se emplean heces que no tengan más de media hora de

obtenidas, o muestras tomadas directamente del recto con un hisopo de
algodón. Cuando las siembras no se pueden efectuar de inmediato o la
muestra demora en llegar al laboratorio, se aconseja emulsionar.
 Se pudo evidenciar en la muestra de heces bacilos Gram negativos
presentarán una coloración rosada rojiza, una vez observado la tinción gram se
observara las características generales de las colonias desarrolladas, proceder
a realizar de acuerdo a sus particularidades, las diferentes pruebas
bioquímicas que nos ayudarán en la identificación, así en el caso de citrato nos
dio negativo, la prueba de MIO nos dio positivo para movilidad e indol, la
Prueba de Kliger nos dio negativo y la prueba de Urea nos dio positivo.
 Se concluye que los microorganismos aislado en la muestra de heces y por las
diferentes pruebas de identificación es Escherichia coli y Enterococcus Fecalis.

8. BIBLIOGRAFÍA:

Becton Dickinson, 2013, BD XLD Agar (Xylose-Lysine-Desoxycholate Agar), Revista

BD, 55(2). Recuperado en: https://www.bd.com/resource.aspx?IDX=8783

Becton Dickinson, 2013, BD Salmonella Shigella Agar, Revista BD, 47(6). Recuperado
en: http://www.bd.com/resource.aspx?idx=8779

(2010), Su aliado en medios de cultivo, Revista Chromid, Recuperado en:

http://www.biomerieux.es/upload/CATALOGO_MEDIOS_DE_CULTIVO_2010_
ES.pdf
 9. ANEXOS

Cuestionario de evaluación

 Esquematice gráficamente el protocolo de rutina que se empleó para la

realización de coprocultivo.

1. Preparar un inoculo:
. Si son heces líquidas se procesan directamente.
. Si son heces sólidas se realiza una suspensión densa, tomando
una porción de heces del tamaño de un guisante y agitando hasta
su homogeneización.

Se realiza un examen macroscopico y un microscopico

2. Incubar tanto las placas sembradas como el hisopo en caldo

bismuto, a 37ºC durante 24 horas.
El caldo de bismuto permite la detección de los patógenos
entéricos cuando están presentes en bajo número, ya que retrasa
el desarrollo de la microbiota normal y favorece la de los
patógenos entéricos.

5. Una vez pasado el tiempo de incubación, se observa

el crecimiento en este caso en agar UTI MCCONKEY y
SANGRE. Realiza tincion gram

Pruebas bioquimicas
UREA, MIO, CITRATO, KLIGER
  Consulte el fundamento científico, composición y utilidad de los
diferentes medios de cultivo empleadas en su práctica y adicione a su
estudio dos agares específicos para siembras de heces.

AGAR MACCONKEY
BD MacConkey II Agar es un medio de diferenciación selectivo para el aislamiento y la
diferenciación de Enterobacteriaceae y diversos otros bacilos gram negativos
FUNDAMENTO
El agar MacConkey es sólo ligeramente selectivo, dado que la concentración de sales
biliares, que inhiben los microorganismos gram positivos, es baja en comparación con
otros medios en placa entéricos. Las peptonas proporcionan los nutrientes.
Cristal violeta inhibe las bacterias gram positivas, en especial los enterococos y
estafilococos. La diferenciación de los microorganismos entéricos se logra mediante la
combinación de lactosa y el indicador de pH rojo neutro. Se producen colonias
incoloras o de color de rosa a rojo según la capacidad del aislado para fermentar
carbohidratos.

COMPOSICION

UTILIDAD
Se recomienda el uso de este medio en muestras clínicas con posible flora microbiana
mixta, tal como procedentes de la orina, del sistema respiratorio, de heridas y otras,
porque permite la agrupación preliminar de bacterias entéricas y otras bacterias gram
negativas en organismos fermentadores y no fermentadores de lactosa. También se
utiliza en el examen microbiológico de alimentos

UTI
El CHROMagar peptonas seleccionadas especialmente suministran los nutrientes. La
mezcla de cromógenos está formada por sustratos artificiales (cromógenos) que
liberan compuestos de colores diferentes al ser degradados por enzimas microbianas
específicas, por lo que se asegura la diferenciación directa de determinadas especies
o la detección de ciertos grupos de organismos, con sólo un mínimo de pruebas de
confirmación.

COMPOSICION

UTILIDAD
Se utiliza para el aislamiento de bacterias comúnmente presentes en infecciones de
las vías urinarias, para el aislamiento, la identificación o la diferenciación de patógenos
urinarios, o para el aislamiento de bacterias gram positivas.
 AGAR SANGRE

FUNDAMENTO
Las propiedades superiores del BD Columbia Agar with 5% Sheep Blood para
propiciar el crecimiento se derivan de la combinación de dos peptonas y del extracto
de levadura como fuente de vitaminas del complejo B. Se incluye almidón de maíz
para absorber los derivados tóxicos contenidos en la muestra y sirve como fuente de
energía para los microorganismos que poseen alfa-amilasas.
La sangre de carnero permite detectar las reacciones hemolíticas y aporta el factor X
(hemo) necesario para el crecimiento de numerosas especies patogénicas.

COMPOSICION

UTILIDAD

Se ha convertido en el medio de aislamiento primario más frecuentemente utilizado

para las muestras clínicas.

AGAR SS
Es un medio selectivo y de diferenciación para el aislamiento de bacilos entéricos
patógenos, en especial los pertenecientes al género Salmonella.
FUNDAMENTO
En BD Salmonella Shigella Agar, la diferenciación de los organismos entéricos se
logra mediante la incorporación de lactosa en el medio. Los organismos que fermentan
lactosa producen ácido que, en presencia del indicador rojo neutro, propicia la
formación de colonias de color rojo. Los organismos no fermentadores de lactosa
forman colonias incoloras. Este último grupo incluye la mayoría de los patógenos
intestinales, incluidos Salmonella y Shigella. El tiosulfato sódico y el citrato férrico
permiten la detección de producción de ácido sulfhídrico, como lo demuestran las
colonias con centros de color negro

COMPOSICION

UTILIDAD
Un medio moderadamente selectivo según el nivel de inhibición de los
microorganismos gram positivos y Enterobacteriaceae diferentes de Salmonella y
Shigella, que inhibe por contenido de sales biliares, verde brillante y citratos.
 AGAR XLD
Agar de xilosa, lisina, desoxicolato) es un medio moderadamente selectivo y de
diferenciación para el aislamiento y la diferenciación de patógenos entéricos gram
negativos.

FUNDAMENTO
Contiene extracto de levadura como fuente de nutrientes y vitaminas. Utiliza el
desoxicolato de sodio como agente selectivo y, por consiguiente, inhibe los
microorganismos gram positivos. La xilosa se incorpora en el medio dado que la
fermentan prácticamente todos los entéricos, excepto Shigella, y esta propiedad hace
posible la diferenciación de dicha especie. La lisina se incluye para permitir la
diferenciación del grupo Salmonella de los organismos no patógenos, dado que, sin
lisina, Salmonella fermentaría rápidamente la xilosa y no se distinguiría de las
especies no patógenas. Cuando la Salmonella agota el suministro de xilosa, la lisina
es atacada por la enzima lisina descarboxilasa, lo que genera un cambio a un pH
alcalino que imita la reacción de Shigella. Para evitar el cambio similar en los
organismos coliformes positivos a la lisina, se añaden lactosa y sacarosa para producir
ácido en exceso.

COMPOSICION

UTILIDAD
Tiene una gran eficacia relativamente alta de XLD Agar en el aislamiento primario de
Shigella y Salmonella. XLD Agar es uno de los medios utilizados en las pruebas de
límites microbianos en USP y EP.