célula em Biologia
Molecular
1
Microscopia
Microscopia electrónica
– É usado um feixe de electrões em vez de luz branca
– A resolução é muito maior que na microscopia óptica
devido ao menor comprimento de onda dos electrões
(~100.000x menor)
– São usadas “lentes” magnéticas em vez de lentes de
vidro (quartzo)
– A observação da amostra é feita no vácuo
– MET e MEV
2
Preparacão da amostra para MET
3
4
Microscopia electrônica
MET – feixe de electrões
emitido por um canhão
acelerador de partículas
atravessa a amostra
Resolução ~2.5nm
Ampliação 10.000 –
100.000x
Baixo contraste da
imagem
– Uso de “corantes” como sais
de metais pesados (Os, Pb)
5
Microscopia electrônica
Desvantagens:
– As amostras devem ser
muito finas (100nm)
devido fraca penetração
dos electrões
– As amostras devem ser
fixadas, desidratadas e
observadas em vácuo
– Encolhimento e
distorção das amostras
– Formação de artefactos
6
Microscopia electrônica
MEV – feixe de electrões
emitido por um canhão
acelerador de partículas
varre a amostra
Produção de electrões
primários e secundários
Resolução ~20nm
Ampliação 1.000 –
10.000x
7
Imagem de MET
8
Imagem de MEV
9
Semelhancas e diferencas entre
MET e MEV
10
Microscopia de verredura por sonda
mecânica
Nanotecnologia
Criada nos anos 80 e desenvolvida nos anos 90
Forma de funcionamento inteiramente original (ar,
líquidos, vácuo)
Resolução a escala atómica
Para além de imagem, permite a análise de outros
parâmetros como morfologia, condutividade
eléctrica, dureza e propriedades magnéticas
11
Microscópio de varredura por sonda
12
Princípio de funcionamento
A – sonda mecânica-
colocada na superfície
da amostra
F – amostra
B – scanner- garante a
movimentação lateral
da amostra em relação
a sonda
13
Princípio de funcionamento
C – mecanismo de
monitoração - detecta
a interacção entre a
sonda e a amostra e
passa a informação
E – computador-
controla o scanner e
processa a informação
D – mecanismo de
aproximação
14
Tipos de microscopia de
Varredura por sonda mecânica
Microscopia de varredura
por tunelamento
Microscopia de força
atómica
Microscopia de força
lateral
Microscopia de contraste
de fase
Microscopia de modulação
de força
15
Técnicas de centrifugação
16
Centrífuga
17
Centrifugação
Separação feita na base de:
– densidade
– forma
– tamanho
Tipos de centrifugação (finalidade)
– Finalidade
Preparativa - separação
Analitica – estudo de propriedades (sedimentação, estrutura,
etc.)
– Natureza
Diferencial ou fraccionada
Contra gradiente ou em gradiente de densidade
18
Tipos de centrifugacão (diferencial)
19
Tipos de centrifugacão (gradiente)
20
Formas de desintegracão de tecidos
21
Princípios básicos
22
Diferentes designs de rotores
23
Tipos de centrífugas
Ultracentrífugas
24
Centrífugas pequenas
– velocidade de 4000
à 6000 rpm
– RCF de 3000 à
6000g
– refrigeração usando
microtubos
velocidades até
13.000 rpm e RCF
de 10.000g
– 250mm3 à 1.5cm3
25
Centrífugas de alta capacidade
– Velocidades de
6000rpm e 6500g
– 100cm3 (100ml) por
tubo com um total
de 4 à 6 dm3
– Eixo rígido (0.25g)
26
Centrífugas de alta velocidade
– 25.000 rpm e
60.000g
– capacidade total vai
até 1.5dm3
– microorganismos,
fragmentos e
organelos celulares,
precipitados
protéicos, etc
27
Ultracentrífugas
– 80.000 rpm e RCF de
600.000g
– camara do rotor
refrigerada, selada e
vacumizada
– controlo de temperatura
sofisticado
bloqueio de rotor
paredes blindadas
– eixo de rotação flexível
(máximo 0.1g)
28
Electroforese
29
SDS-PAGE
30
Electroforese horizontal
31
Factores que afectam a corrida
electroforética
Campo eléctrico - voltagem, corrente e
resistência do meio
Amostra - carga, tamanho e forma
Tampão – composição, concentração e pH
Meio de suporte - absorção e peneiração
– Efeito de retardamento causado pelo atrito
– Efeito electroestático entre amostra e meio circundante
32
Tipos de electroforese
1. Electroforese de baixa voltagem em
camada fina
2. Electroforese em alta voltagem
3. Electroforese em gel
1. Agarose
2. Poliacrilamida
1. SDS-PAGE
3. Electroforese capilar
4. Electroforese de focagem isoeléctrica
33
Cromatografia
34
Conceitos gerais
Coeficiente de distribuicão
– Quociente entre a concentração do composto
na fase móvel e na fase estacionária
Coeficiente efectivo de distribuicão
– Quociente entre a quantidade total do composto
na fase móvel e na fase estacionária
Princípio de separacão
35
Princípio de separacão
36
Tipos de cromatografia
Permeação ou peneiração
– Baseada no tamanho e forma
Adsorção
– Adsorção sobre a fase estacionária
Partição ou distribuição
– Distribuição pelas duas fases
Gás-líquida
Troca iônica
37
HPLC
38
Colunas
39
40
Radioisótopos
(isótopos radioactivos)
41
Tipos de radiação ou
decomposição (desintegração)
radioactiva
Radiação alfa: fluxo de partículas
carregadas positivamente, compostas por 2
neutrões e 2 protões (núcleo de Hélio)
– São muito ionizantes porém pouco penetrantes
– Reagem com a matéria de duas formas
Excitação
Ionização
42
Tipos de radiação ou
decomposição (desintegração)
radioactiva
Radiação beta: fluxos de partículas
originárias do núcleo (por isso negatrões).
Quando um radioisótopo emite uma
partícula β, o valor de sua massa não muda,
e seu número atômico aumenta em 1
unidade
– mais penetrante porém menos ionizante que a
radiação alfa
43
Tipos de radiação ou
decomposição (desintegração)
radioactiva
Radiação gama: ondas electromagnéticas.
Não apresenta carga eléctrica e não é
afectada por campos eléctricos ou
magnéticos
– É o tipo mais penetrante de radiação
– É uma radiação muito perigosa para
organismos vivos
44
Marcação com Radioisótopos
45
46
Detecção de Radioisótopos
Contadores
– GEIGER-MULLER
– Cintilador
Radioautografia
47