Anda di halaman 1dari 14

ISOLASI DNA BAKTERI

LAPORAN PRAKTIKUM
disusun untuk memenuhi salah satu tugas mata kuliah Biologi Molekuler yang diampu oleh
Dr. Hj. Any Fitriani, M.Si.

disusun oleh :
Biologi C 2013
Kelompok 1
Fanny Azzahra (1307318)
Giri Endah Anggraeni (1304775)
Iqbal (1301913)
Riyan Septianingrum (1303466)
Shela Nurul Nadia (1300965)
Utami Lestari Budiawati (1307184)

PROGRAM STUDI BIOLOGI


DEPARTEMEN PENDIDIKAN BIOLOGI
FAKULTAS PENDIDIKAN MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
UNIVERSITAS PENDIDIKAN INDONESIA
2016
BAB I
PENDAHULUAN

A. Latar Belakang
Isolasi DNA bakteri merupakan pemisahan molekul DNA dari sel
bakteri. Isolasi yang dilakukan pada praktikum ini menggunakan metode
boiling. Pada metode bakteri dipanaskan pada suhu tinggi sehingga dinding
selnya lisis. Pengenalan isolasi DNA penting dipelajari untuk bidang biologi
molekuler. Beberapa bakteri telah berhasil diintroduksi ke dalam tanaman
seperti padi, kapas, dan kedelai. Pentingnya bioteknologi untuk
perkembangan keanekaragaman hayati dimasa mendatang memerlukan
sebuah keterampilan dan pemikiran yang kritis.
Polymerase Chain Reaction (PCR) merupakan alat yang dapat
menunjang proses isolasi DNA. PCR merupakan teknik untuk
mengamplifikasi DNA dalam jumlah kecil melalui proses enzimatik secara in
vitro (Harley. 2002). Penggandaan yang dilakukan PCR bertujuan untuk
memperbanyak jumlah DNA agar dalam isolasi dapat diperoleh DNA dalam
jumlah besar.
Elektroforesis dapat dilakukan dengan gel agarose dan gel
polyacrilamide (Alberts, et al. 2002). Namun, pada praktikum kali ini
menggunakan gel agarose. Elektroforesis ini dilakukan untuk pemisahan
pragmen DNA dari molekul terbesar ke molekul terkecil. Pemisahan ini
dilakukan dalam medan listrik dari kutub negatif ke positif, hal ini dilakukan
karena DNA bermuatan negatif.

B. Tujuan
Tujuan dari praktikum ini untuk mengisolasi DNA dari isolat bakteri
yang ada di Laboratorium Mikrobiologi, UPI.

Laporan Praktikum Isolasi DNA Bakteri/ Kelompok 1, 2016 1


BAB II
ISOLASI DNA

Isolasi DNA merupakan metode dasar yang digunakan dalam penelitian


biologi molekuler. Biomolekul ini diisolasi untuk dianalisis, proses penelitian
selanjutnya, atau untuk tujuan persediaan. Ada dua hal yang terlibat dalam
pemurnian DNA, yaitu isolasi DNA rekombinan seperti plasmid atau bakteriofag
dan isolasi DNA kromosom atau genom dari organisme prokariotik atau
eukariotik. Agar pemurnian asam nukleat ini berhasil ada empat langkah penting
yang harus diperhatikan, yaitu efektif dari gangguan sel atau jaringan; denaturasi
kompleks nukleoprotein; inaktivasi nuklease, misalnya RNAse untuk ekstraksi
RNA atau DNAse untuk ekstraksi DNA; bebas dari kontaminasi biologi dan
kimiawi. Asam nukleat yang akan diisolasi harus terbebas dari kontaminan
termasuk protein, karbohidrat, lipid atau misalnya asam nukleat lain, misalnya
DNA bebas dari RNA atau sebaliknya. Kualitas dan kemurnian dari isolasi asam
nukleat ini akan mempengaruhi keberhasilan penelitian ilmiah berikutnya (Tan &
Yiap, 2009).
Isolasi DNA pertama kali dilakukan oleh Frierich Miescher, Swiss pada
tahun 1869. Dia berkeinginan untuk memecahkan prinsip-prinsip dasar kehidupan
dengan menentukan komposisi kimia dari sel. Dia mencoba utntuk mengisolasi
sel dari kelenjar getah bening, namun tidak berhasil. Kemudian dia beralih ke
leukosit, dan menemukan bahwa protein merupakan komponen utama sel dalam
sitoplasma. Selama pengujiannya, ia melihat bahwa ada zat yang mengendap saat
ditambahkan asam dan larut lagi ketika ditambahkan alkali. Inilah kali pertama ia
menemukan DNA, ia kemudian mengembangkan protokol baru untuk mengisolasi
DNA tersebut dari selnya (Dahm, 2005).

Laporan Praktikum Isolasi DNA Bakteri/ Kelompok 1, 2016 2


BAB III
METODOLOGI PENELITIAN

A. Alat dan Bahan


1. Alat dan Bahan Praktikum Isolasi DNA
Tabel 3.A.1. Alat Penelitian Isolasi DNA

No. Alat Jumlah


1. Waterbath 1 unit
2. Tabung mikro 4 buah
3. Sentrifuge 1 unit
4. Vertex
5. Freezer 1 unit
6. Mikropipet 2 unit
7. Tips 8 buah
8. Jarum Ose 2 buah

Tabel 3.A.2. Bahan Penelitian Isolasi DNA

No. Bahan Jumlah


1. PBS
NaCl 8 g/L
KCl 0,2 g/L
Na2HPO4 1,15 g/L
KH2PO4 0,2 g/L
2. TE 1X
Tris-Cl 10 mM (pH 7,5)
EDTA 1 mM

2. Alat dan Bahan Praktikum Elektroforesis


Tabel 3.A.3. Alat Penelitian Elektroforesis

No. Alat Jumlah


1. Elektroforesis Unit 1 unit
2. Mikropipet 2 unit
3. Microwave 1unit
4. Parafilm 1 buah
5. Transilluminator UV 1 unit

Laporan Praktikum Isolasi DNA Bakteri/ Kelompok 1, 2016 3


Tabel 3.A.4. Bahan Penelitian Elektroforesis

No. Bahan Jumlah


1. Agarose 0,375 gr
2. Buffer TAE 1X 25 L
3. Loading Dye 1L
4. EtBr 500 ml
5. Aquadest Secukupnya

B. Langkah Kerja
1. Langkah Kerja Isolasi DNA

Sebanyak 1 loop bakteri


dari medium agar
Bakteri dikultur dalam Suspensi disentrifugasi
dimasukkan ke dalam
media padat LA selama selama 3 menit dengan
tabung mikro 1,5 ml yang
sekitar 16 jam. kecepatan 5000 rpm.
sudah terisi 1 ml PBS dan
dihomogenkan.

Tabung dipanaskan di atas Supernatan yang terbentuk


Lysat yang terbentuk
air mendidih selama 10 dibuang, sedangkan pelet
diambil sebanyak 100 l menit dan disentrifugasi ditambah buffer TE 1x
dan dipindahkan ke dalam selama 3 menit dengan sebanyak 100l dan
tabung 1,5 ml yang baru. kecepatan 5000 rpm. divortex.

Ditambahkan buffer TE Disiimpan dalam freezer


1x dingin sebanyak 500 l dengan suhu -20o C

Diagram Alir 1. Langkah Kerja Isolasi DNA Bakteri

Laporan Praktikum Isolasi DNA Bakteri/ Kelompok 1, 2016 4


2. Langkah Kerja Elektroforesis

0,375 gr agrosa
dimasukkan dalam Campuran
buffer TAE 1x sebanyak dihomogenkan
menggunakan Gel didinginkan
25 l, sehingga diperoleh microwave selama 45
konsentrasi agarose detik - 1,5 menit.
sebesar 1-2%.

Loading Dye Gel agarose dimasukkan


ditambahkan ke dalam Gel dibiarkan mengeras
ke dalam tray yang
selama 45 menit - 1 jam.
sampel sebanyak 1l. sudah disiapkan.

Sampel dimasukkan ke alat dipasangkan dan


Dihomogenkan dengan
dalam sumur yang disambungkan ke
cara pipetting.
terdapat dalam gel. sumber listrik.

Dilakukan pewarnaan Dielektroforesis pada


Direndam dalam aquades dengan cara ditambahkan daya 100 volt selam 30
selama 10-15 menit. EtBr sebanyak 500 ml. menit.

Divisualisasi
menggunakan sinar UV.

Diagram Alir 2. Langkah Kerja Elektroforesis

Laporan Praktikum Isolasi DNA Bakteri/ Kelompok 1, 2016 5


BAB IV
HASIL PENGAMATAN DAN PEMBAHASAN

A. Hasil Pengamatan
1. Hasil Pengamatan Spektrofotometer
Tabel 4.A.1. Hasil Pengamatan Spektrofotometer Isolat M dan Isolat O
Kelompok 1

Konsentrasi Kemurnian
No Isolat Pengulangan A260 A280
(A260 x e x 50) 𝑨 𝟐𝟔𝟎⁄
𝑨 𝟐𝟖𝟎
1 0.003 0.004
2 0.001 0.002 0.002 x 500 x 50 0.002 / 0.003 =
1. M
3 0.002 0.003 = 50 ng/ml 0.67
Rata-rata 0.002 0.003
1 0.002 0.003
2 0.002 0.003 0.002 x 500 x 50 0.002 / 0.003 =
2 O
3 0.002 0.004 = 50 ng/ml 0.67
Rata-rata 0.002 0.003

Tabel 4.A.2. Hasil Pengamatan Spektrofotometer Isolat M dan Isolat O Tiap


Kelompok
Nilai Rata- Nilai Rata-
Jenis Konsentrasi Kemurnian
Kelompok rata rata
Isolat (A260 x e x 50) 𝑨 𝟐𝟔𝟎⁄
A 260 A 280 𝑨 𝟐𝟖𝟎

Isolat M 0.002 0.003 50 0.67


1
Isolat O 0.002 0.003 50 0.67
Isolat M 0.009 0.006 225 1.5
2
Isolat O 0.010 0.008 250 1.25
Isolat M 0.086 0.075 2150 1.14
3
Isolat O 0.100 0.088 2500 1.13
4 Isolat M 0.017 0.009 432.5 1.86

Laporan Praktikum Isolasi DNA Bakteri/ Kelompok 1, 2016 6


Isolat O 0.087 0.079 2175 1.10
Isolat M 0.091 0.080 2275 1.13
5
Isolat O 0.111 0.093 2775 1.19
Isolat M 0.095 0.082 2375 1.16
6
Isolat O 0.111 0.095 2766.75 1.16

2. Hasil Pengamatan Elektroforesis


Tabel 4.A.3. Penambahan LD dan Konsentrasi Isolat M dan Isolat O
Konsentrasi
Kelompok Jenis Isolat Loading Dye (µL)
(nanogram/ml)
Isolat M 1 150
1
Isolat O 1 150
Isolat M 1 200
2
Isolat O 1 200
Isolat M 1 100
3
Isolat O 1 100
Isolat M 1 200
4
Isolat O 1 100
Isolat M 1 100
5
Isolat O 1 100
Isolat M 1 100
6
Isolat O 1 100

Laporan Praktikum Isolasi DNA Bakteri/ Kelompok 1, 2016 7


Tabel 4.A.4. Hasil Pengamatan Elektroforesis Isolat M dan Isolat O
Gambar Hasil Spektrofotometer Keterangan
15 14 13 12 11 10 9 8 7 6 5 4 3 2 1 1 : Kontrol 1
2 : Isolat M Kelompok 1
3 : Isolat O Kelompok 1
4 : Isolat M Kelompok 2
5 : Isolat O Kelompok 2
6 : Isolat M Kelompok 3
7 : Isolat O Kelompok 3
8 : Isolat M Kelompok 4
9 : Isolat O Kelompok 4
10 : Isolat M Kelompok 5
11: Isolat O Kelompok 5
12 : Isolat M Kelompok 6
13 : Isolat O Kelompok 6
14 : Kontrol 2
15 : Kontrol 3
(Dok. Kelompok 2, 2016)
Hasil Spektrofotometer 6
kelompok isolat M dan
isolat O. Hanya terlihat
pita pada isolat M sumur
ketiga.

(Dok. Kelompok 2, 2016)


Laporan Praktikum Isolasi DNA Bakteri/ Kelompok 1, 2016 1
B. Pembahasan
Tujuan isolasi DNA yang dilakukan dalam praktikum kali ini
bertujuan untuk memisahkan molekul DNA dari dua Isolat yang berbeda
yakni, Isolat M dan Isolat O dari molekul lain selain DNA. Hasil Isolasi DNA
tersebut perlu diuji kualitas maupun kuantitasnya. Kualitas DNA yang
diisolasi tersebut diuji secara kualitatif dan kuantitatif. Pengujian kuantitas
isolasi DNA dilakukan dengan menggunakan spektrofotometer. Sedangkan,
pengujian kualitas isolasi DNA dilakukasn dengan menggunakan
elektroforesis gel agarosa.
Isolasi DNA pada praktikum kali ini menggunakan metode Boiling
dengan prinsip pemanasan dengan menggunakan air pada suhu 90-100oC.
Metode Boiling merupakan metode yang sederhana dalam pemisahan DNA
karena hanya mengandalkan prinsip pemanasan oleh air. Pemanasan pada
suhu 90-100oC akan membantu dalam melisiskan molekul-molekul selain
DNA. Penggunaan metode ini juga dibantu oleh beberapa bahan kimia seperti
PBS dan TE. PBS merupakan bahan kimia yang berfungsi untuk melisiskan
membran sel karena di dalam PBS tergantung senyawa yang serupa dengan
detergen yang memiliki fungsi yang sama. TE (Tris EDTA) merupakan bahan
kimia yang memiliki fungsi sebagai larutan buffer.
Berdasarkan hasil pengamatan dari kelompok 1-6 didapatkan hasil
spektrofotometer DNA yang beraneka ragam. Keanekaragaman ini
dipengaruhi oleh beberapa faktor dan human error. Berdasarkan hasil
tersebut diperoleh nilai absorban dari panjang gelombang cahaya 260 dan 280.
Nilai absorbansi dengan panjang gelombang 260 merupakan nilai absorbansi
cahaya yang dapat diterima oleh molekul DNA. Sedangkan nilai absorbansi
dengan panjang gelombang 280 merupakan nilai absorbansi cahaya yang
dapat diterima oleh molekul lain selain DNA. Perbandingan antara nilai
absorban 260 dengan nilai absorban 280 akan menunjukkan kemurnian
molekul DNA dengan molekul selain DNA dari proses isolasi DNA yang
telah kami lakukan.

Laporan Praktikum Isolasi DNA Bakteri/ Kelompok 1, 2016 1


Nilai kemurnian untuk DNA genom yang normal berada diantara
kisarana 1.80 - 2.00. Setelah melakukan isolasi DNA oleh beberapa
kelompok, hasil menunjukkan bahwa hanya terdapat satu kelompok yang
dapat mencapai kemurnian normal, yakni pada kelompok 4 isolat M dengan
kemurnian 1.86. Kemurnian DNA yang berada di bawah rentang 1.80 – 2.00
dapat dipengaruhi oleh beberapa hal diantaranya adanya kontaminasi dari
mikroorganisme lain atau dapat pula disebabkan jumlah sampel yang
digunakan sangat sedikit sehingga hasilnya menunjukkan nilai yang kecil.
Sedangkan, kemurnian DNA yang berada di atas normal menunjukkan
adanya debris atau sel-sel mati yang ikut terhitung saat proses
spektrofotometer berlangsung.
Setelah melakukan uji kuantitas menggunakan spektrofotometer,
selanjutnya melakukan uji kualitas dengan menggunakan elektroforesis.
Prinsip elektroforesis sendiri adalah DNA yang bermuatan negatif akan
bergerak menuju kutub positif melalui bantuan tegangan arus listrik.
Tegangan yang digunakan dalam praktikum kali ini adalah 100volt dalam
waktu 30menit. Dari hasil elektroforesis ini hanya ditemukan 1 garis pita
DNA saja yang terdapat pada isolat M kelompok 2 yang memiliki kemurnian
isolasi DNA 1.5purity. Sedangkan, pada isolat M kelompok 4 dengan nilai
kemurnian yang normal yakni 1.86purity tidak ditemukan adanya garis pita
DNA.
Dari hasil praktikum di atas tentunya ditemukan kejanggalan pada
isolat M kelompok 4 yang memiliki nilai kemurnian 1.86 namun tidak
ditemukan garis pita DNA saat elektroforesis. Berdasarkan hasil diskusi, hal
tersebut dikarenakan adanya kesalahan saat pengkalibrasian dari alat
spektrofotometer pada saat pengukuran kuantitas DNA. Nilai blanko yang
berisi aquabidest (ddH2O) tidak menunjukkan nilai 0.00 namun hasil kalibrasi
blanko menunjukkan nilai yang lebih besar yakni 0.082. Hal ini tentu menjadi
alasan, bahwa praktikum isolasi DNA kali ini dirasa kurang valid karena
kesalahan kalibrasi spektrofotometer yang berakibat perubahan nilai kuantitas
dari konsentrasi dan kemurnian DNA pada setiap kelompok.

Laporan Praktikum Isolasi DNA Bakteri/ Kelompok 1, 2016 2


Hasil elektroforesis menunjukkan adanya garis pita yang panjang dan
garis pita yang pendek. Semakin panjang jarak garis pita yang terbentuk pada
gel agarosa dengan sumur, maka panjang DNA pada genom tersebut semakin
pendek. Sedangkan, semakin pendek jarak garis pita yang terbentuk pada gel
agarosa dengan sumur, maka panjang DNA pada genom semakin panjang.
Hal ini dikarenakan fungsi agarosa sebagai benteng pengambat gerakan DNA
ketika dialiri oleh tegangan listrik. Dari hasil pengamatan, isolat M yang
memiliki jarak garis pada gel agarosa dengan sumur tergolong berjarak
pendek, maka panjang DNA pada genom relatif panjang.
Pada kelompok 1 diperoleh hasil spektrofotometer yang paling kecil
dengan nilai kemurnian 0.67 pada isolat M dan isolat O. Menurut hasil
diskusi yang kami lakukan, nilai yang sangat kecil yang diperoleh oleh
kelompok 1 dikarenakan kesalahan saat mengambil sampel isolat M dan
isolat O. Jumlah pengambilan sampel tidak sampai satu loop penuh. Jumlah
sampel yang sangat sedikit dapat mengindikasikan jumlah DNA yang
diperoleh pun sangat sedikit. Penyebab lain yang dapat menyebabkan nilai
spektrofotometer pada kelompok 1 sangat kecil adalah adanya kontaminasi.
Kedua hal ini tentu akan menurunkan nilai spektrofotometer.
Pada pengamatan elektroforesis kelompok 1, tidak ditemukan adanya
garis pita DNA pada gel agarosa. Hal ini tentu berkaitan dengan konsentrasi
DNA (nanogram/ml) yang dihitung melalui rumus A260 x besar pengenceran
(500) x 50, yang menunjukkan nilai 50 nanogram/ml baik pada isolat M dan
isolat O. Hal ini, tentu memengaruhi hasil elektroforesis yang dampaknya
tidak menghasilkan garis pita DNA pada gel agarosa.

Laporan Praktikum Isolasi DNA Bakteri/ Kelompok 1, 2016 3


BAB V
PENUTUP

A. Kesimpulan
Berdasarkan hasil praktikum yang dilakukan, didapat beberapa kesimpulan:
1. Setelah melakukan isolasi DNA oleh beberapa kelompok, hasil
menunjukkan bahwa hanya terdapat satu kelompok yang dapat mencapai
kemurnian normal, yakni pada kelompok 4 isolat M dengan kemurnian
1.86. Sedangkan nilai kemurnian untuk DNA genom yang normal berada
diantara kisaran 1.80-2.00purity.
2. Kemurnian DNA yang berada di bawah rentang 1.80-2.00purity dapat
dipengaruhi oleh beberapa hal diantaranya adanya kontaminasi dari
mikroorganisme lain atau dapat pula disebabkan jumlah sampel yang
digunakan sangat sedikit sehingga hasilnya menunjukkan nilai yang kecil.
3. Dari hasil elektroforesis yang dilakukan oleh beberapa kelompok, hanya
ditemukan 1 garis pita DNA saja yang terdapat pada isolat M kelompok 2
yang memiliki kemurnian isolasi DNA 1.5purity. Sedangkan, pada isolat
M kelompok 4 dengan nilai kemurnian yang normal yakni 1.86purity
tidak ditemukan adanya garis pita DNA.
4. Ditemukannya kejanggalan pada isolat M kelompok 4 yang memiliki
nilai kemurnian 1.86purity namun tidak ditemukan garis pita DNA saat
elektroforesis, dapat disebabkan adanya kesalahan saat pengkalibrasian
dari alat spektrofotometer pada saat pengukuran kuantitas DNA. Nilai
blanko yang berisi aquabidest (ddH2O) tidak menunjukkan nilai 0.00
namun hasil kalibrasi blanko menunjukkan nilai yang lebih besar yakni
0.082.
5. Pada kelompok 1 diperoleh hasil spektrofotometer yang paling kecil
dengan nilai kemurnian 0.67purity pada isolat M dan isolat O. Nilai yang
sangat kecil yang diperoleh dapat disebabkan adanya kesalahan saat
mengambil sampel isolat M dan isolat O. Jumlah pengambilan sampel
sangat sedikti (tidak sampai satu loop penuh), atau adanya kontaminasi.

Laporan Praktikum Isolasi DNA Bakteri/ Kelompok 1, 2016 4


DAFTAR PUSTAKA

Alberts, B. et al. (2002). Molecular Biology of the Cell. Edisi ke-4. New York:
Garland Science.
Dahm, Ralf. (2005). “Friedrich Miescher and the discovery of DNA”.
Developmental Biology. 278, (2), 274-288.
Dewi, Noviana Chandra. dkk. (2012). Pengaruh Penambahan PEG (Polyethylene
glicol) Terhadap Profil Protein Tembakau (Nicotiana tabacum L. var
Prancak 95) pada Media In vitro. Institut Teknologi Sepuluh November: 1-
12
Harley dan Presscot. (2002). Laboratory Exercise in Microbiology. USA:
McGraw-Hill Publisher.
Noer, A.Saefudin. dkk.(1997). PCR Tanpa Isolasi DNA dari Sel Epitel Rongga
Mulut. JMS Vol. 2 No. 1: 35 - 45
Tan, S.C. & Beow Chian Yiap. (2009). “DNA, RNA, and Protein Extraction: The
Past and The Present”. Journal of Biomedicine and Biotechnology. 2009, 1-10.

Laporan Praktikum Isolasi DNA Bakteri/ Kelompok 1, 2016 5