ISOLASI DNA PLASMID

A. Tujuan
B. Dasar teori Plasmid merupakan DNA ekstrakromosom yang berbentuk sirkuler doub
le helix dengan ukuran relatif kecil ± antara 1 kb sampai lebih dari 200 kb terdapa
t di dalam sel prokariot, khususnya bakteri. Pada bakteri jumlah plasmid yang di
miliki bervariasi bahkan sampai ribuan ataupun tidak memiliki plasmid. Plasmid m
ampu bereplikasi secara otonom, tidak tergantung pada replikasi kromosom, tetapi
ada beberapa plasmid yang replikasinya mengikuti kromosom. Plasmid memberikan s
ifat istimewa yang dimiliki oleh bakteri tersebut misalnya resistensi terhadap a
ntibiotik. Berdasarkan fungsinya plasmid dapat dikelompokkan menjadi: 1. Fertili
ty-F-plasmids, merupakan plasmid yang dapat ditransfer dari satu sel ke sel akte
ri lain untuk proses konjugasi 2. Resistance-(R)plasmids, mengandung gen yang re
sisten terhadap antibiotik atau racun. 3. Col-plasmid, mengandung gen yang mengk
ode protein (bakterosin) yang dapat membunuh bakteri lain 4. Degradative plasmid
s, yang mampu mencerna subsansi yang tidak biasa, contoh toluen dan asam salisil
at. 5. Virulence plasmids, yang menjadikan bakteri tersebut patogen
Plasmid memiliki fungsi yang dapat dimanfaatkan keuntungannya, misalnya plasmid
dalam rekayasa genetika, plasmid digunakan sebagai vektor untuk kloning DNA. Sel
ain itu plasmid juga banyak digunakan untuk perbanyakan jumlah DNA tertentu sehi
ngga bisa mengekspresikan gen tertentu. Salah satu usaha untuk mendapatkan keunt
ungan dari plasmid tersebut adalah dengan cara mengisolasi DNA plasmid. Terdapat
beberapa cara yang
digunakan untuk mengisolasi plasmid tersebut. Plasmid yang diisolasi biasanya be
rasal dari bakteri. Proses ini dikenal sebagai proses mini preparation karena ju
mlahnya hanya sekitar 1-20µ g. Sedangkan untuk jumlah yang lebih besar (100-200µ g) di
gunakan midi preparation dan maxi preparation untuk jumlah yang lebih besar dari
200 µ g. Inti dari isolasi plasmid bakteri adalah menghancurkan membran sel sehing
ga semua organel sel dapat keluar. Sehingga didapatkan DNA kromosomal serta DNA
ekstrakromosmal (plasmid). Untuk memperoleh plasmid saja harus dilakukan pemurni
an dari debris membran sel, organel sel, dan pengotor lainnya. Metode yang digun
akan untuk isolasi plasmid, yaitu boiling lysis, lysis with detergent, mechanica
l lysis, alkaline lysis, dan enzimatic digestion. C. Alat dan bahan 1. Alat: a.
Tabung eppendorf 15 ml dan 1,5 b. Micropippette dan tip c. Microcentrifuge d. Vo
rtex e. Oven
2. Bahan: a. 10 ml Kultur bakteri. b. Larutan suspensi sel ( larutan A, 50 mM Tr
is-HCl, 10 EDTA) c. Larutan lisis ( Larutan B, 0,2 M NaOH, 1% SDS) d. Larutan ne
tralisasi ( Larutan C, 1,32 M Kalium Asetat pH 4,8) e. Phenol : chloroform : iso
amilakholhol = 25: 24 : 1 f. Sodium asetat 3 M g. Ethanol absolute
Menambahkan larutan C, dan 2 tabungbalik 3-4 di Vortex Menambahkan larutan A 2 m
l dan dibolak-balik cara kalipelet Menambahkan larutan B, dalam ml kali A di bol
ak yang berisi MengendapkanMelarutkan pellet dengan larutandengan dengan 3-4 350
0 rpm selama 5 menit Mengendapkan bakteri dengan microcentrifuge dengan kecepata
n 3500 rpm selama 15 menit bakteri dengan microcentrifuge kecepatan Memisahkan s
upernatant dandan pellet dengan cara membuang pelet Mengambil supernatant pellet
dengan cara membuang supernatan Memisahkan 10 ml hasil kultur bakteri dalam tab
ung eppendorf
h. Etanol 70% i. Aquadest steril
D. Cara kerja
Mengambil 3-4 ml supernatant dan menginkubasi selama semalam
E. Hasil dan pembahasan
F. Kesimpulan
G. Pustaka