PRACTICA No.

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Determinación de disolventes residuales en un fármaco por cromatografía de gases

OBJETIVOS

El alumno levara a cabo la cuantificación de acetona y acetato de etilo en un fármaco comercial.

Al final de la práctica el alumno tendrá los fundamentos teóricos para poder continuar su
aprendizaje en el desarrollo de metodologías analíticas cuantitativas empleando la técnica de
cromatografía de gases empleando la técnica de Headspace.

El alumno aprenderá la utilidad del uso de especificaciones para el desarrollo de metodologías

analítica así como los pasos básicos para la escritura de un método analítico.

INTRODUCCIÓN

Los disolventes residuales en productos farmacéuticos se definen como sustancias químicas

volátiles que se usan o se producen durante la manufactura de principios activos farmacéuticos o
de formas farmacéuticas. Estos disolventes no siempre se remueven completamente durante el
proceso de manufactura y la apropiada selección del disolvente para la síntesis del principio
activo puede ser determinante en el rendimiento del proceso o reacción, así como en las
características del producto, tales como, forma cristalina, pureza y/o solubilidad. Por estas
razones en muchos casos el disolvente puede ser crítico en el proceso de manufactura.

Considerando que los disolventes no tienen ninguna propiedad terapéutica y que pueden llegar a
ser tóxicos, éstos deben ser removidos en lo posible para cumplir la especificación del producto.
La mayoría de las agencias regulatorias requieren que el contenido de diversos disolventes se
controle a ciertos niveles y las guías ICH Q3C(R5) establece una clasificación para los
disolventes más comunes así como los niveles permitidos de cada uno de ellos de acuerdo a su
toxicidad.

Esta guía clasifica a los disolventes como Clase 1, muy tóxicos, Clase 2 menos tóxicos y Clase 3
los de más bajo nivel de toxicidad.

En el desarrollo de la práctica se seleccionará un fármaco, se analizará su ruta de síntesis, y se

determinará qué disolventes se emplean para ser controlados en el producto de acuerdo a los
límites establecidos por las guías ICH.

El método más comúnmente usado para disolventes residuales es la técnica de headspace

(muestreo por espacio de cabeza) acoplado con cromatografía de gases. Esta técnica de
muestreo es adecuada principalmente para analizar residuos volátiles, en este caso disolventes
en una matriz sólida y no volátil.

En esta técnica la muestra se mantienen sellada en un vial hermético (de 6, 10 o 20 mL) cerrado
mediante cápsula o tapón y una membrana adecuada, que generalmente es de silicona con una
lámina de PTFE. El vial y la muestra se mantienen en condiciones de temperatura controlada para
permitir que los compuestos volátiles pasen de la fase sólida a la fase gas del vial. La zona gas
del vial que no se llena del todo con la muestra, es lo que se denomina Espacio de Cabeza. Una vez
que una parte de la fracción volátil pasa a la fase gas, se transfiere una parte de la misma a la
columna cromatográfica donde es eluida la mezcla y analizada.

Existen una gran variedad de técnicas de inyección de muestra en Cromatografía de Gases, sin
embargo el Headspace es una de las más comunes y más útiles especialmente en el análisis de
compuestos volátiles como impurezas en productos sólidos como fármacos, muestras de suelos
para análisis ambiental, alimentos etc.

TRABAJO PREVIO

Investigar cual es el límite máximo permitido de acetona y acetato de etilo en fármacos de

acuerdo a la clasificación de las guas ICH.

Investigar que es la técnica de Headspace y su utilidad para análisis por cromatografía de gases.

Investigar cuales son los disolventes más comúnmente usados para cuantificar disolventes
residuales en fármacos.

MATERIAL Y REACTIVOS

1 Matraz volumétrico de 250 mL

1 Matraz volumétrico de 50 mL

3 Pipetas pasteur de vidrio con bulbo

4 Vasos de precipitado de 50 mL

1 Jeringa de 1000 µL para inyección por Headspace

1 Espátula

8 Viales para Headspace de 20 mL con tapa

Acetona RA

Acetato de Etilo RA.

Dimetil sulfoxido para Headspace

Sulfato de sodio anhidro

Cromatografo de Gases equipado con un detector de ionización de llama.

Muestreador para Headspace HS600 o equivalente

Balanza Analítica

PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL

A) Preparar el diluyente pesando 125 mg de Etanol RA en un matraz volumétrico de 250 mL,

llevar a volumen con dimetilsulfoxido.
B) En un matraz volumétrico de 50 mL colocar un poco de diluyente y enseguida pesar 25 mg
de acetona y 25 mg de acetato de etilo, en el mismo matraz, llevar a volumen con
diluyente. Esta disolución se utilizara como solución estándar de trabajo.
Nota: realizar las pesadas lo más rápido posible y tapar el matraz para evitar la
evaporación de los disolventes.
C) Preparar 8 viales de 20 mL para Headspace, adicionándoles una punta de espátula de
Sulfato de sodio anhidro.
D) Colocar 0.5 mL de solución estándar de trabajo en 6 de los viales preparados en el paso
anterior, etiquetar como estándares de trabajo.
E) Pesar en un vial para headspace de 20 mL, 50 mg de muestra y adicionar 0.5 mL de
diluyente. Cerrar con tapa y etiquetar como muestra.
F) Colocar 0.5 mL de diluyente en un vial de headspace y etiquetar como blanco.
G) Programar las siguientes condiciones en el equipo de Headspace
H) Tiempo inicial 100 min, el tiempo empieza a decrecer.
I) Temperatura de equilibrio en muestreador de headspace 80 oC
J) Colocar a tiempo de 100 min el primer vial de blanco en el muestreador, esperar 12
minutos e introducir en el muestreador el vial del primer estándar, sucesivamente
introducir los demás estándares y la muestra cada 12 minutos
K) Preparar el equipo de cromatografía de gases con las siguientes condiciones: flujo de gas
de arrastre de N 2 2 mL/min, relación de Split de 1:18, temperatura de inyector y
detector 200 oC, Horno: rampa con temperatura inicial de 40 C por 2 min y subiendo
temperatura hasta 180 oC a una velocidad de 70 oC/min, el tiempo aproximado de una
corrida es de 12 minutos.
Nota: las condiciones anteriores se pueden variar ligeramente dependiendo del equipo.
Utilizar una columna polar de polietilenglicol de 30 m de longitud y 0.32 mm de diámetro.
 L) Inyectar al minuto 80, 0.5 mL del primer vial de headspace, esperar 12 minutos e inyectar
el siguiente vial y así sucesivamente cada 12 minutos hasta concluir con la muestra.

DISPOSICION DE RESIDUOS

Enjuagar los viales con metanol y colocar el residuo en un frasco etiquetado como residuos de
dimetilsulfoxido con metanol. Enviar a disposición.

PRACTICA No. 15

Determinación de cafeína y acido benzoico en bebidas por cromatografía de líquidos

OBJETIVOS

El alumno llevara a cabo la cuantificación de cafeína y acido benzoico en una bebida refrescante.

Al final de la práctica el alumno tendrá los fundamentos teóricos para poder continuar su
aprendizaje en el desarrollo de metodologías analíticas cuantitativas empleando la técnica de
cromatografía de líquidos

El alumno aprenderá la utilidad del uso de especificaciones para el desarrollo de metodologías

analítica así como los pasos básicos para la escritura de un método analítico empleando la técnica
de cromatografía de líquidos.

INTRODUCCIÓN

Existen técnicas analíticas especialmente importantes debido a su amplio uso en laboratorios de

control de calidad en diferentes industrias como la farmacéutica, petroquímica y de alimentos.
Adentro de estas técnicas analíticas esta la cromatografía de líquidos. Las firmas más
importantes que fabrican sistemas cromatograficos están ubicadas en el segundo y cuarto lugar
de la lista de las 25 firmas más importantes en instrumentación analítica publicada por la revista
Chemical and Engineering News. Esto indica que las técnicas cromatografías son de las más
utilizadas actualmente.

Sin duda la mayor aplicación de la cromatografía se encuentra en la caracterización de mezclas

complejas de compuestos orgánicos y muestras biológicas con fines tanto cualitativos como
cualitativos.
En la actualidad la cromatografía de líquidos se emplea ampliamente para llevar a cabo el control
de calidad de diversos productos como por ejemplo en la industria de los alimentos se usa para
realizar el control del contenido de aditivos y conservadores en diferentes productos.

Las bebidas energizantes cafeinadas se utilizan ampliamente por sus efectos estimulantes: los
fabricantes defienden que son seguras y muchos consumidores lo perciben así; sus componentes
y concentraciones están debidamente aprobados por la legislación. A pesar de esto hoy en día
hay preocupación por su uso indiscriminado y por los efectos en la salud que estas bebidas
pueden ocasionar.

Aunque no se conocen con exactitud los limites seguros del consumo de cafeína, hay reportes de
algunas fuentes que establecen que es no más de 400 mg por día. La cafeína es el ingrediente
más común de las bebidas energizantes debido a su capacidad de alterar el estado de
alerta/vigilia entre otros efectos.

El ácido benzoico es un derivado del benceno también usado en la forma de benzoato de sodio.
Además de su uso como aditivo alimentario se utiliza en la producción de sabores artificiales,
fragancias y como regulador del pH.2 La principal función de este compuesto es la de conservar
ya que inhibe el crecimiento de hongos y bacterias, en general este compuesto se considera
seguro, sin embargo su contenido en alimentos está controlado a un valor límite. Este compuesto
también se encuentra en diversos alimentos de manera natural como bayas, arándanos, miel y
yogur.

En esta práctica se llevara a cabo el análisis de cafeína y acido benzoico en una bebida
energizante común. Para esto se revisara una norma oficial mexicana la cual establece límites
permisibles de estos compuestos en las bebidas comerciales.3

La cafeína y el ácido benzoico son compuestos orgánicos que absorben en la región UV del
espectro electromagnético, y el método se basa en la preparación de un estándar que contenga
ambos compuestos en las concentraciones establecidas en la norma y su posterior inyección en el
sistema cromatografico, empleando un detector de UV de onda variable acoplado a un
cromatografo de líquidos de alto desempeño. Se pretende determinar si la bebida cumple con los
límites máximos permitidos en la norma oficial mexicana.

REFERENCIAS

1. Clara Inés Manrique, Claudia Lucia Arroyave, David Galvis-Pareja. Bebidas cafeinadas
energizantes: Efectos neurológicos y cardiovasculares. IATREIA Vol. 31 (1) 65-75 enero-
marzo 2018
2. https://www.benceno.net/acido-benzoico-usos/
 3. NORMA Oficial Mexicana NOM-218-SSA1-2011

TRABAJO PREVIO

Investigar cual es el límite máximo permitido de cafeína y acido benzoico en bebidas de acuerdo
a la norma NOM-218-SSA1-2011.

Investigar en la farmacopea mexicana que es una adecuación de sistema para cromatografía.

Investigar los principales métodos de calibración que se emplean en métodos de cromatografía

de líquidos.

MATERIAL Y REACTIVOS

1 Matraz volumétrico de 250 mL

1 Matraz volumétrico de 50 mL

3 Pipetas pasteur de vidrio con bulbo

4 Vasos de precipitado de 50 mL

1 Jeringa de 1000 µL para inyección por Headspace

1 Espátula

8 Viales para Headspace de 20 mL con tapa

Acetona RA

Acetato de Etilo RA.

Dimetil sulfoxido para Headspace

Sulfato de sodio anhidro

Cromatografo de Gases equipado con un detector de ionización de llama.

Muestreador para Headspace HS600 o equivalente

Balanza Analítica

PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL

A) Preparar fase móvil para el sistema cromatografico, para esto preparar una disolución de
ácido acético al 1% en agua y filtrar en una membrana de 0.45 µm y degasificar.
B) Filtrar metanol grado HPLC, en una membrana de 0.45 µm.
C) Realizar una mezcla de ambas soluciones preparadas en proporción 45 % de metanol y 55%
de fase acuosa con ácido acético.
D) Preparar diluyente mezclando metanol y agua en proporción 1:1
E) Preparar equipo de cromatografía con los siguientes parámetros:
Modo de elución isocratico, emplear fase móvil preparada en inciso C
Flujo de fase móvil 1 mL/min
Longitud de onda del detector 250 nm
Columna: Generica C-18 de 4.6 x 150 mm con tamaño de particula de 5 µm
F) Preparar una disolución estándar pesando 75 mg de ácido benzoico y 25 mg de cafeína,
colocar ambos compuestos en un matraz volumétrico de 25 mL y adicionar diluyente hasta
solubilizar y finalmente llevar a volumen con diluyente.
G) Tomar 1.0 mL del estándar preparado en inciso E y colocarlo en un matraz volumétrico de
25 mL. Llevar a volumen con diluyente. Utilizar esta disolución como estándar de trabajo.
H) Preparar muestra tomando 5 mL de bebida y colocarlos en un matraz volumétrico de 25
mL, llevar a volumen con diluyente.
I) Inyectar 20 µL de diluyente en el cromatografo y registrar cromatograma, Realizar 6
inyecciones del estándar de trabajo y una inyección de la disolución de muestra diluida.
J) Una vez terminadas las inyecciones, procesar los cromatogramas integrando las áreas de
los picos para cafeína y ácido salicílico.

REPORTE DE RESULTADOS

Realizar el cálculo del promedio de las áreas para las seis inyecciones del estándar y calcular
el coeficiente de variación (CV%) de los datos y reportar este valor.

Realizar el cálculo de la concentración de cafeína y acido benzoico contenidos en la muestra y

reportar el valor en ppm (m/v). Comparar los resultados obtenidos con los límites
especificados en la norma oficial mexicana, indicando si el producto cumple con la norma.

Revisar los parámetros de adecuación de sistema recomendados en la Farmacopea mexicana e

indicar si el sistema cromatografico cumplió con dichos parámetros.