DAFTAR ISI

I. Ringkasan ................................................................................................................... 1
II. Pendahuluan .............................................................................................................. 1
III. Tinjauan Pustaka ........................................................................................................ 2
IV. Metodologi Riset ........................................................................................................ 4
V. Daftar Pustaka ............................................................................................................ 6
VI. Jadwal Pelaksanaan .................................................................................................... 7
VII. Usulan Dana ............................................................................................................... 8
VIII. Data Pribadi Pengusul (CV) ....................................................................................... 10
1. RINGKASAN
Studi ekologi molekul mikroalga laut terhalang oleh kurangnya penanda
taksonomi tertentu secara genetik. Salah satu contoh mikroalga yang melimpah di
Indonesia adalah Chlorella. Chlorella berpotensi sebagai pakan ternak, sumber
biopigmen, sumber bioaktif untuk keperluan farmasi dan kedokteran. Chlorella
mengandung berbagai nutrien seperti protein, asam lemak, vitamin, klorofil,
enzim, dan karbohidrat. Chlorella juga memiliki tingkat reproduksi sel yang
cukup tinggi. Kelebihan lain dari Chlorella adalah dapat hidup pada lingkungan
air tawar dan air laut.
Sama halnya dengan mikroalga lainnya, chrolerra juga memiliki ukuran yang
mikro. Hal ini menyebabkan sulitnya mengidentifikasi atau membedakan
chrolerra dari mikroalga lain yang masih berada dalam satu kelas dengannya,
yaitu mikroalga hijau. Kesulitan ini terjadi karena bentuk morfologinya yang
mirip dan sulit dibedakan ataupun karena perilaku hidupnya yang mirip.
Sementara penentuan atau identifikasi spesies mikroalga untuk ditumbuhkan
merupakan factor penting dalam pemilihan medium tumbuh mikroalga tersebut
sehingga dapat diperoleh hasil mikroalga yang maksimal.
Tujuan dari penelitian ini adalah untuk mengidentifikasi mikroalga chrolerra
dan mengklasifikasikannya berdasarkan urutan kode genetik. Hal ini dapat
dilakukan menggunakan metode yang sedang berkembang, yaitu barkode DNA.
Barkode DNA adalah suatu proses mengidentifikasi urutan basa penyusun suatu
makhluk hidup lalu mengurutkannya. Oleh karena urutan basa ini ditentukan oleh
gen maka setiap spesies akan memiliki DNA yang berbeda dan spesies yang
memiliki hubungan kekerabatan yang dekat akan memiliki urutan gen yang
identic.
Barkode DNA dapat dilakukan dengan mengekstrak DNA dari mikroalga lalu
melakukan pemurnian terhadap ekstrak tersebut. Dari hasil pemurnian, diperoleh
DNA yang murni dan dilakukan amplifikasi atau perpanjangan DNA
emnggunakan PCR. Hasil sekuensing dapat dianalisis menggunakan program
yang disebut BLAST.
2. PENDAHULUAN
2.1.Latar Belakang
Mikroalga merupakan salah satu hasil kekayaan laut Indonesia. Sama seperti
diberbagai Negara lainnya, di Indonesia pun, pemanfaat mikroalga untuk
kepentingan ilmiah dan komersial juga berkembang dalam beberapa tahun
terakhir ini. Selain karena jumlah mikroalga yang melimpah, hal ini juga
dikarenakan mikroalga memiliki manfaat yang cukup banyak. Diantara manfaat-
manfaat mikroalga yaitu sebagai pakan ternak, pupuk, berperan dalam pengolahan
air limbah, sumber biopigmen, dan yang paling mutakhir saat ini adalah bahan
baku untuk memproduksi biomassa 1.
Penelitian mikroalga yang sedang dikembangkan di Institut Teknologi
Bandung yaitu pemanfaatannya untuk produksi biodiesel, biopigmen, dan
antioksidan. Diantara mikroalga tersebut adalah Thalassiosira sp dan Chaetoceros
sp, Navicula sp, nannochloropsis, Niztschia, dan Chlorella sp. Banyaknya manfaat
mikroalga dan kelimpahannya di perairan Indonesia, membuat keanekaragaman
mikroalga penting untuk dipertahankan. Memahami keanekaragaman mikroalga
dapat dilakukan dengan mengklasifikasikannya.
2.2.Perumusan Masalah
Klasifikasi makhluk hidup berdasarkan morfologi adalah system klasifikasi
yang telah digunakan sejak lama. Akan tetapi, hal ini menjadi semakin sulit untuk
digunakan ketika jenis makhluk hidup yang akan diidentifikasi memiliki
kemiripan yang sangat identic dan sulit untuk melihat perbedaannya melalui
pengamatan saja. Oleh karena itu, dalam beberapa tahun terakhir, untuk
mengklasifikasikan makhluk hidup digunakan system klasifikasi yang lebih
efisien yang disebut sebagai barcode DNA (DNA barkode)2. Oleh karena
mikroalga merupakan organisme yang renik (mikro) maka identifikasi mikroalga
perlu dilakukan dengan metode yang lebih akurat. Jika identifikasi mikroalga
sebelum dilakukan penumbuhannya, maka medium pertumbuhan yang cocok
untuk menghasilkan hasil yang maksimal dapat dipertimbangkan dengan baik.
2.3.Tujuan Penelitian
Tujuan dari penelitian ini adalah menghasilkan informasi mengenai susunan
gen barkode pada mikroalga chlorella sp. sebagai penanda klasifikasi spesies
tersebut berdasarkan urutan gennya.

2.4.Ruang Lingkup Penelitian

DNA barkode mikroalga dilakukan melalui tahap-tahap berikut: ekstraksi
DNA, amplifikasi DNA menggunakan alat polymerase chain reaction (PCR), dan
terakhir sequence DNA3. Hasil barkode DNA merupakan suatu keunggulan dalam
dunia biomolekular modern. Barkode DNA ini berupa rangkaian garis-garis
(disebut kode batang) yang tidak lain merupakan label digital. Kode batang digital
ini adalah alat yang digunakan untuk mengenkripsi atau mengkode informasi
mengenai spesies tertentu secara spesifik4. Maksudnya, meskipun secara
morfologi tampak sama maka barkode DNA ini dapat mendeskripsikan suatu
spesies sebagai individu yang berbeda. Sehingg diperolej data untuk mengetahui
urutan gen pada mikroalga chlorella sp dalam bentuk barkode.

3. TINJAUAN PUSTAKA
Pada dasarnya, mikroalga dibedakan atas komposisi pigmen, struktur/bentuk,
dan siklus hidupnya. Berikut klasifikasi mikroalga kedalam kelompok yang
disebut sebagai filum, yaitu mikroalga hijau (Chlorophyta) contohnya chlorella
sp., diatom (Bacillariophyceae) contohnya Thalassiosira sp., Chaetoceros sp.,
Nitzschia closterium, mikroalga coklat keemasan (Chrysophyta) contohnya
navicula sp., mikroalga eustigmatophyte (Eustigmatophyceae) contohnya
Nannochloropsis, mikroalga merah (Rhodophyceae) contohnya porphyridium
cruentum dan mikroalga biru-hijau atau cyanobacteria (Cyanophyceae)5.
Alga hijau (Chlorophyta) merupakan mikroalga yang umum ditemukan di air
tawar. Kelompok ini mengandung klorofil a dan klorofil b dan beberapa
karotenoid. Spesies yang termasuk dalam alga hijau adalah Chlorella dan
Chlamydomonas. Secara umum, pertumbuhan mikroalga dipengaruhi oleh
beberapa factor seperti cahaya, ketersediaan karbon dioksida, nitrogen, fosfor, pH,
dan nutrisi, suhu, dan salinitas5. Karbon Dioksida dan Sumber karbon organik
digunakan untuk mensintesis senyawa organik seperti lipid. Nitrogen (N) adalah
nutrisi yang penting untuk produksi biomassa. Perubahan warna yang terjadi pada
sel mikroalga merupakan sinyal bahwa kandungan nitrogen dalam sel masih
kurang. Hal ini terjadi karena penurunan kandungan klorofil dan peningkatan
karotenoid. Nitrogen sebagian besar disediakan dalam bentuk nitrat namun
terdapat juga mikroorganisme yang memilih amonia sebagai sumber nitrogen.
Fosfor sangat penting untuk proses seluler seperti transfer energi dan pada proses
biosintesis asam nukleat. Nutrisi adalah senyawa organik atau anorganik (selain
karbon dioksida dan air), yang digunakan untuk pertumbuhan. Suhu dan salinitas
mempengaruhi tingkat pertumbuhan mikroalga. Senyawa makro lain yaitu sulfur,
kalium, natrium, besi, magnesium, kalsium dan unsur-unsur seperti boron,
tembaga, mangan, seng, molibdenum, kobalt, vanadium, dan selenium juga
penting dalam nutrisi mikroalga.
Biofuel atau biasa juga disebut agrofuel yang menandakan bahwa biofuel
adalah energy yang terbuat dari makhluk hidup (hasil pertanian dan kehutanan)
atau secara luas dapat didefinisikan sebagai bahan bakar apapun yang terbuat dari
bahan organik (alias biomassa). Biofuel yang paling umum adalah biodiesel dan
bio alkohol, termasuk bioetanol dan biobutanol (juga disebut biogasoline). Biofuel
generasi pertama diproduksi dari tanaman seperti gula, pati, dan tanaman minyak
(bahan pangan) menggunakan teknologi konvensional. Yang paling umum
pertama biofuel generasi yang biodiesel dan bioetanol. Akan tetapi hal ini
menimbulkan persaingan terhadap sumber pangan sehingga dicari alternative
berikutnya, yang disebut sebagai biofuel generasi kedua6.
Bahan baku biofuel generasi kedua berasal dari bahan baku non-pangan
termasuk minyak nabati, limbah, dan lemak. Sebagian besar, teknologi
pengolahan biofuel generasi kedua belum tersedia pada skala komersial sehingga
biofuel terus dikembangkan agar bisa memasuki pasar dalam beberapa tahun
kedepan. Salah satu bahan baku untuk biofuel generasi kedua ini adalah biodiesel
dari mikroalga. Biodiesel adalah minyak yang berasal tumbuhan atau hewan
sebagai sumber energy6.
Saat ini, penelitian mengenai produksi biodiesel dari mikroalga sangat banyak
dilakukan. Mikroalga adalah mikroorganisme yang mengkonversi CO2 di
atmosfer (melalui fotosintesis) menjadi bahan-bahan kimia termasuk metana,
hidrogen, polisakarida dan minyak. Produksi minyak mikroalga yang lebih efisien
dibandingkan dengan tanaman minyak konvensional, menyediakan hasil minyak
yang lebih tinggi (sampai berat kering 75%) dengan pemanfaatan lahan yang lebih
rendah6.
Secara umum, budidaya mikroorganisme tersebut tidak tergantung pada
musim atau iklim. Mikroalga tersebut juga dapat dengan mudah tumbuh di
berbagai substrat yang murah termasuk residu limbah dari pertanian dan industri
yang menyediakan nutrisi bagi pertumbuhannya. Biodiesel generasi kedua
memiliki sifat yang sangat mirip dengan biodiesel generasi pertama, tanpa
perbedaan yang signifikan antara biodiesel yang bersumber dari bahan pangan dan
bahan non pangan. Sehingga mikroalga merupakan alternative terbaik saat ini
untuk memproduksi biodiesel pengganti biodiesel dari bahan pangan.
 Pengoptimalan mikroalga hijau dalam memproduksi biomassa telah banyak
dilakukan. Diantaranya, dengan aerasi berkelanjutan dengan 15% CO27, konversi
termokimia dari mikroalga rendah lipid8, Ekstraksi minyak dengan aktivasi H2O2
berbasis partikel amino melalui proses panen basah mikroalga9, produk oksidasi
NO(NO3-) dalam gas buangan digunakan sebagai sumber nitrogen untuk
meningkatkan produksi biomassa mikroalga dan fiksasi CO210, dan Pemisahan
magnetophoretic dari mikroalga: peran pengikat nanopartikel dan polimer dalam
proses panen biofuel 11. Fakta-fakta tersebut membuktikan bahwa minat terhadap
mikroalga (dalam hal ini chlorella sp.) cukup tinggi sehingga perlu adanya upaya
konservasi terhadap jenis mikroalga ini yang dihasilkan dari perairan Indonesia.
Barkode DNA merupakan suatu urutan basa DNA yang sangat spesifik antara
spesies yang satu dengan spesies yang lainnya. Hal tersebut dimanfaatkan sebagai
penanada/pembeda suatu spesies. Tahap-tahap barkode DNA dilakukan sebagai
berikut ekstraksi DNA, amplifikasi DNA menggunakan alat polymerase chain
reaction (PCR), dan terakhir sequence DNA.
Polymerase Chain Reaction (PCR) atau reaksi rantai polimerase adalah teknik
yang digunakan untuk memperbanyak sekuens DNA spesifik secara eksponensial
melalui in vitro melalui tiga tahap yang dapat dilakukan dalam beberapa siklus.
Ekstraksi dan amplifikasi DNA dapat dilakukan dengan menggunakan alat PCR.
Pertama, template DNA untai ganda didenaturasi pada suhu tinggi. Kemudian,
penempelan urutan primer tertentu pada urutan DNA target tertentu, lalu diikuti
dengan penambahan enzim DNA polimerase termostabil, seperti Taq DNA
polimerase agar siklus polimerisasi optimal. Produk baru kemudian menjadi
template tambahan untuk siklus amplifikasi berikutnya. Ketiga langkah biasanya
berulang dalam siklus selama 20 sampai 30 kali, mengakibatkan peningkatan
konsentrasi DNA target 105-109 kali jumlah aslinya. Penggunaan PCR untuk
mendapatkan sejumlah besar produk yang diinginkan dapat memiliki kelemahan
dan kelebihan. Jika amplifikasi tidak berhasil, maka dapat menyebabkan produk
yang tidak diinginkan yang mengarah bahkan dengan mengesampingkan produk
target.
Hasil amplifikasi PCR dideteksi dengan alat elektroforesis gel agarosa.
Elektroforesis gel agarosa adalah teknik pemisahan molekul-molekul berdasarkan
berat molekulnya dalam sebuah medan listrik dalam medium padat.

4. METODOLOGI RISET
Kultivasi mikroalga
Sampel yang akan ditumbuhkan adalah mikroalga jenis chlorella sp. Medium
untuk pertumbuhan mikroalga yaitu K2HPO4 250mg, MgSO4.7H2O 20mg,
Na2CO2 25mg, NaSiO3.9H2O per liter. Medium pertumbuhan (dalam petri)
mengandung 1,5% b/b agar. Media diperkaya dengan Na2SiO3.9H2O w/v 1% pada
pH 7. Lalu koloni diinkubasi selama 2 sampai 3 pekan dan melakukan
homogenisasi dan pemurnian koloni terisolasi melalui inokulasi koloni.
Melakukan pengamatan mikroskopis di 100X perbesaran dengan minyak imersi
dan melakukan pengenceran berkala (delution series) untuk mendapatkan
unialgal.
Ekstraksi dan amplifikasi DNA mikroalga
Larutan buffer PCR yang mengandung 10 – 50mM Tris-HCl pH 8,3-8,8 (suhu
20oC); 50 mM KCl; 0,1% gelatin atau BSA (Bovine Serum Albumin); Tween 20
sebanyak 0,01% atau dapat diganti dengan Triton X-100 sebanyak 0,1%
disamping itu perlu ditambahkan 1,5 mM MgCl2.
Gel agarosa elektroforesis
Menentukan Kualitas DNA (produk PCR) dengan menggunakan 0,8% gel
agarosa pada larutan penyangga Tris-asetat-EDTA (TAE). Menambahkan Etidium
bromida ke campuran gel dengan konsentrasi akhir 0,2 mg/ml, dan mencampur
sampel dengan penyangga (0,25% b/v bromofenol biru dan 40% b/v sukrosa).
Lalu menjalankan elektroforesis menggunakan 105 watt selama 45 menit. Lalu
memvisualisasikan pita dengan lampu UV pada panjang gelombang 312 nm.
Sekuens hasil PCR pada kedua sisi dengan sekuenser otomatis. Data sekuens
dapat diakses melalui analisis BLAST.
5. DAFTAR PUSTAKA

1 Eland LE, Davenport R, Mota CR. Evaluation of DNA extraction methods

for freshwater eukaryotic microalgae. Water Res. 2012;46(16):5355-5364.
doi:10.1016/j.watres.2012.07.023.

2 Mann, D Avid G and Evans KM. A proposed protocol for nomenclaturally

effective DNA barcoding of microalgae. Phycologia. 2009;48(January):70-
74. doi:10.2216/08-70.1.A.

3 Hebert PDN. Biological identifications through DNA barcodes. R Soc.

2003;(September 2002):313-321. doi:10.1098/rspb.2002.2218.

4 Blaxter ML. The promise of a DNA taxonomy. R Soc. 2004:1-11.

doi:10.1098/rstb.2003.1447.

5 Lee RE. Basic Characteristics of the Algae.; 2008.

http://books.google.com/books?hl=en&lr=&id=gfoIAFHgusgC&oi=fnd&p
g=PA31&dq=Phycology&ots=UEpslAr5zJ&sig=Krt8cMzc8XFJTXaXkhH
dmoTe6Yc.

6 Luque R, Herrero-davila L, Campelo JM, et al. Biofuels : a technological

perspective. Energy Env Sci. 2008;1(5):513-596. doi:10.1039/b807094f.

7 Cheng J, Huang Y, Lu H, Huang R, Zhou J, Cen K. Simultaneous

enhancement of microalgae biomass growth and lipid accumulation under
continuous aeration with 15% CO2. RSC Adv. 2014;4(3):42147-42154.
doi:10.1039/C4RA05491A.

8 Chen Y, Wu Y, Hua D, Li C, Harold M, Yang M. Thermochemical

conversion of low-lipid microalgae for the production of liquid fuels:
challenges and opportunities. RSC Adv. 2015. doi:10.1039/C4RA13359E.

9 Lee YC, Huh YS, Farooq W, Han J-I, Ohd Y-K, Park J-Y. Oil extraction
by aminoparticle-based H2O2 activation via wet microalgae harvesting.
2013:12802-12809. doi:10.1039/c3ra23266b.

10 Huang Y, Cheng J, Lu H, Huang R, Zhou J, Cen K. The oxidation product

(NO3 ) of NO pollutant in flue gas used as a nitrogen source to improve
microalgal biomass production and CO2 fixation. RSC Adv. 2015;5:50851-
50858. doi:10.1039/C5RA08401F.

11 Toh PY, Ng W, Chong H, et al. Magnetophoretic separation of microalgae :

the role of nanoparticles and polymer binder in harvesting biofuel.
2014:4114-4121. doi:10.1039/c3ra46298f.
6. JADWAL PELAKSANAAN
Jadwal Pelaksanaan (Januari 2015 – Desember 2015)
Kegiatan Jan Feb Mar Apr Mei Jun Jul Agu Sep Okt Nov Des

Studi literatur √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √

Penyiapan alat dan

√
bahan
Identifikasi
mikroalga
√ √
berdasarkan
morfologi
Pengambilan 1 sel
mikroalga untuk √ √
kultivasi
Kultivasi
√ √ √ √ √ √
mikroalga
Isolasi dan
ekstraksi DNA √ √ √ √ √
mikroalga
Pemurnian DNA
√ √ √ √ √
mikroalga
PCR dan
Sequencing DNA √ √ √
mikroalga
Karakterisasi
√ √ √
mikroalga

Penulisan Laporan √ √ √ √
7. USUSLAN DANA
No. Nama Alat Spesifikasi Harga (Rp)
1. Cawan Petri Pyrex, USA 32.000
2. Labu Erlenmeyer Pyrex, USA 63.000
3. Gelas Ukur 83.000
4. Gelas Kimia 85.000
5. Batang pengaduk 7.000
6. Pipet Tetes 100.000
7. Botol Reagen 35.000
8. Labu Buchner Pyrex, USA 40.000
9. Corong Penyaring 55.000
10. Alat Filtrassi Eppendorf, Germany 1.000.000
membran
11. pipet mikro 1.000.000
12. Tip pipet mikro 125.000
13. pompa Franklin mod.1104191400 9.000.000
Electric Type N
14. timbangan digital Explorer Ohaus, Ohaus 5.000.000
model 682B Corp.USA
15. Autoclave model Electric Pressure Steam 3.400.000
no.25X Sterilizer, USA ; Sturdy,
Taiwan
16. Inkubator model 503 USA, Incubig JP, 1.400.000
Fisher Isotemp Selecta S.A 04381111
Incubator
18. Freezer -200C Forma Scientific, Inc., 2.000.000
USA
19. refrigerator Daewoo, Japan 2.000.000
20. mikrosentrifuga Eppemdorf 5415C 125.000
21. alat PCR model BioRad 25.000.000
Gene Cycler
22. elektroforesis tipe Apparatus Corp, USA 5.000.000
EC250-9 EC
23. BioRad Power PAC BioRad 1.000.000
300
24. Chamber BioRad BioRad 2.000.000
25. lampu ultraviolet Cole Parmer Instrument, 1.000.000
France
Total Alat 104.585.000
No. Nama Bahan Spesifikasi Harga (Rp)
1. Mikroalga Chrollera sp. 500.000
2. K2HPO4 Merck, Germany 25.000
3. Na2CO2 Merck, Germany 50.000
4. MgSO4.7H2O Merck, Germany 50.000
5. NaSiO3.9H2O Merck, Germany 50.000
6. Na2SiO3.9H2O Merck, Germany 50.000
7. SDS Merck, Germany 50.000
8. Tris-HCl Merck, Germany 50.000
9. KCl Merck, Germany 50.000
10. gelatin Merck, Germany 50.000
11. BSA (Bovine Serum Merck, Germany 100.000
Albumin)
12. Triton X-100 Merck, Germany 100.000
13. EDTA Merck, Germany 50.000
agarosa Sigma Chemicals 200.000
Co.,USA
14. etidium bromide Merck, Germany 100.000
15. bromophenol blue Pharmacia LKB 100.000
Biotechnology Inc.,
Piscataway, NJ
16. akrilamid Bio Basic 200.000
17. buffer PCR 10x Fermentas 100.000
18. MgCl2 Fermentas 50.000
19. campuran dNTP Amersham Pharmacia 100.000
2mM Biotech. Inc., USA
20. Primer BF-GC, BR 100.000
Total Bahan 2.225.000

No. Total Alat dan Bahan Harga (Rp)

1. Total Alat 104.585.000
2. Total Bahan 2.225.000

Total 106.700.000