Asignatura de Biotecnología

Práctica N° 6
Título de práctica:
Metabolitos secundarios
 METABOLITOS SECUNDARIOS
I. INTRODUCCIÓN
La interacción de las especies microbianas en su medio ambiente, se caracteriza por muchos
factores, incluyendo la habilidad de los microorganismos que generan sustancias las cuales inhiben
el desarrollo de otras especies. Los metabolitos juegan un papel importante en la adaptación de las
especies, formación y funcionamiento de las colonias bacterianas.1

Los metabolitos secundarios no son necesarios para la biosíntesis celular, no tienen por tanto un
papel directo en el metabolismo energético y su formación depende de las condiciones ambientales
donde se encuentren. Algunos de estos compuestos, principalmente los antibióticos son útiles para
el organismo puesto que pueden inhibir a otros microorganismos de su entorno.2

Según Demian (1998) et al, los metabolitos secundarios poseen las siguientes características:

- Son productos naturales elaborados por grupos microbianos pertenecientes a ciertas especies.

- Generalmente sintetizados como compuestos químicos con biodiversidad estructural por

ejemplo: alcaloides, flavonoides, benzoquinonas, glucósidos, tetraciclinas, cumarinas,
aminoazúcares, macrólidos y salicilatos.

- Parece que no se encuentran relacionados con los procesos de las vías biosintéticas de las
macromoléculas como proteínas, ácidos nucleicos y polímeros.

- En su mayoría son excretados al exterior, lo que puede estar relacionado con la eliminación de
material tóxico.

- Producción de elementos que contribuyen a la colonización de espacio y nutrientes (antibióticos y

toxinas).3

II. OBJETIVOS
• Observar el crecimiento bacteriano de Staphylococcus aureus, Bacillus cereus, Pseudomonas
aeruginosa, Pseudomonas aeruginosa frente a un control positivo (gentamicina), blanco (caldo
MRS) y muestra de metabolitos secundarios de Staphylococcus aureus.

• Determinar si la presencia de metabolitos secundarios de Staphylococcus aureus inhibe el

crecimiento de la cepa de B. Cereus.

• Aprender el uso del biorreactor en la producción de metabolitos secundarios.

III. MATERIALES

• Biorreactor • Centrifugadora

• Autoclave • Sacabocados

• Incubadora • Placas petri

 • Agar Muller Hinton o TSA • Blanco: caldo MRS

• Asa de drigaslky • Muestras de metabolitos secundarios de

Lactobacillus acidophilus
• Gentamicina
• Cepas de Staphylococcus aureus, Bacillus
• Inóculo de Lactobacillus spp.
cereus, Pseudomonas aeruginosa,
• Control positivo: gentamicina 20 μg/mL Eschericchia coli

IV. METODOLOGÍA
• Preparación de los equipos

Se procede a preparar el biorreactor y los medios MRS.

• Esterilización de los equipos y el medio de cultivo

El biorreactor y los sensores de PH y DO se esterilizan con el caldo MRS.

• Configuración del biorreactor

Se calibra el biorreactor:

o Temperatura: 42º o Agitación: 60 rpm

• Inoculación de la cepa

Se procede a controlar el pH, Temperatura y RPM.

• Control de metabolitos

Después de 18h de desarrollo se toma muestras de 1ml.

• Separación de metabolitos solubles

Se centrifuga a 300 RPM por 10 min.

• Evaluación in vitro de la presencia de antibacterianos

Se siembra por superficie Lactobacillus sp de referencia ( 0.5 McFarland )

Se hacen los pocillos donde ira el ATB

Se agrega 50 ul del sobrenadante de inoculo de Staphylococcus aureus, blanco y Gentaminicina
(20 ul/ml )

Por ultimo, incubar las placas

V. Resultados

SN= MP

G=gentamicina

C= Control

Placa sembrada con Bacillus cereus

 Placa sembrada con Staphylococcus aureus

Placa sembrada con Pseudomonas aeruginosa

Placa sembrada con Escherichia coli

VI. Discusiones
Vemos que el resultado de la exposición de los metabolitos secundarios producidos por
Lactobacillus sp. frente cepas de Bacillus cereus, Sthaphylococcus aureus, Pseudomona aeruginosa
y Eschericchia coli para probar la actividad antimicrobiana fue negativo en todos los casos. Lo que
indica que los metabolitos producidos por el Lactobacillus no tienen una actividad antimicrobiana
respeto frente a los microorganismos mencionados anteriormente.

Según los estudios realizados, determinan que las cepas del género Lactobacillus spp. producen una
gran cantidad de probióticos, que estos al consumirse en cantidades adecuadas generan beneficios
importantes al consumidor como: ser inmunomoduladores, favorecer el establecimiento de la
microbiota intestinal competente, actuar como antagonistas contra microorganismos patógenos
compitiendo por los sitios de unión al epitelio y nutrientes, producir compuestos antibacterianos
como ácidos orgánicos, etanol, diácetilo, peróxido de hidrogeno (H2O2) y bacteriocinas. Todos esos
compuestos disminuyen drásticamente el pH, incluso por debajo de 4, e inhiben el crecimiento de
microorganismos patógenos y favorecen la salud intestinal, por lo tanto, son considerados como
seguros. 4,5

VII. Conclusiones
• Por lo tanto se concluye que los metabolitos secundarios de Lactobacillus acidophilus generados
no tienen acción sobre los migroorganismos estudiados

VIII. Cuestionario
1-Explique gráficamente uno de los mecanismos de acción de las bacteriocinas

Modelo que muestra el mecanismo de acción dual de la nisina de Lactococcus lactis 3

Etapa 1, la nisina posee una carga neta positiva que incrementa su interacción con las cargas
negativas de los componentes de la pared celular.

Etapa 2, la nisina se une al lípido II, principal transportador de las subunidades de peptidoglucano
del citoplasma a la pared celular interfiriendo con su síntesis, lo que lleva a la bacteria a muerte
celular.

Etapa 3, adicionalmente, varias moléculas de nisina utilizan al lípido II para anclarse e insertarse en
la membrana celular y comenzar con la formación de los poros, lo que lleva a la bacteria a una rápida
muerte celular

2-¿Cuál es la metodología para evaluar la actividad antimicrobiana solo de las bacteriocinas?

La evaluación de la actividad antimicrobiana se podrá realizar sobre microorganismos Gram (+),

Bacillus cereus y Bacillus sphaericus y Gram (-), Pseudomonas aeruginosa y Pseudomonas putida.
Estos microorganismos se caracterizaron mediante curva de crecimiento. Para evaluar la actividad
antimicrobiana se pueden realizar dos tipos de pruebas diferentes, una prueba de crecimiento en
medio líquido y la prueba de difusión en gel que es en medio sólido.7

Prueba de actividad en medio líquido: Se realiza para cada microorganismo con cada una de las
muestras de bacteriocinas producidas, además de dos muestras de nisina a 200 ppm y 500 ppm
como control positivo. Esta prueba consiste en crecer en 90 mL de medio de cultivo LuriaBertani
(LB) para Pseudomonas y Bacillus cereus o de medio Standard Plate Count (SPC) para Bacillus
sphaericus durante aproximadamente 12 h, tiempo en el cual el microorganismo se encontraba en
crecimiento en fase exponencial, y se adiciona 10 mL del extracto crudo enzimático obtenido
durante el crecimiento de los microorganismos productores de bacteriocinas. Este procedimiento
se realiza por duplicado para cada microorganismo. El monitoreo de la evolución del crecimiento de
los microorganismos con las bacteriocinas ensayadas se realizó mediante mediciones de
Absorbancia a 600 nm, contra blanco de medio de cultivo con bacteriocina, con el fin de descartar
el efecto de dilución en el medio de cultivo de los microorganismos de ensayo (Pseudomonas y
Bacillus) causado por la adición del extracto enzimático, un ensayo como blanco se realizó
adicionando 10 mL de agua, realizando el monitoreo de la Absorbancia durante el tiempo de los
ensayos.

3-Mencione las bacterias probióticas comercializados en el mercado y sus indicaciones

Fuente: WGO,2011 8

IX. Bibliografía
1.- Chaparro A. Aislamiento e identificación de metabolitos producidos por la cepa nativa SPG 321
de Mucor circinelloides y evaluación de su actividad antimicrobiana. [Tesis]. Pontificia Universidad
Javeriana. Facultad de Ciencias. 2010.

2.- Demian, Arnold, Solomon. (1986). Manual of Industrial Microbiology and Biotechnology.
American Society for Microbiology, Washington. Pág.: 98- 117.

3.- López, J. E., Ochoa, A., Santoyo, G., Anaya, J. L., Medina, E., Martínez, M., Loeza, P. D.
Bacteriocinas de bacterias Gram positivas: una fuente potencial de nuevos tratamientos
biomédicos. Revista Mexicana de Ciencias Farmacéuticas, 2008 39(3), 49-57.

4.- Saavedra, J.M. Clinical applications of probiotic agents. The American Journal of Clinical
Nutrition. 2001, 73(6): 1147-1151.

5.- Schrezenmeir, J. and M. Vrese. 2001. Probiotics, prebiotics, and synbiotics-approaching a

definition. American Society for Clinical Nutrition 73(2): 361- 364.

6.- Vélez, J, Gutierrez, L, Montoya, O. Evaluación de la Actividad Bactericida de Bacterias Ácido

Lácticas Aisladas en Calostro de Cerdas Frente a Salmonella typhimurium. Rev. Fac. Nal. Agr.
Medellín 68(1): 7481-7486. 2015

7.- Giraldo, D. J., del Pilar Meléndez, A., Medina, O. F. S. Evaluación de la producción de
bacteriocinas a partir de Lactobacilosy Bifidobacterias. Revista Venezolana de Ciencia y Tecnología
de Alimentos, 2010 1(2), 193-209.

8.- WGO. Probióticos y prebióticos. Guías Mundiales de la Organización Mundial de

Gastroenterología, 2011.

9.- Castro Albornoz, G., Valbuena Colmenares, E. Biopreservación: alternativa para mejorar la
calidad de los quesos. Venezuela, 2009