INMUNOLOGICAS
PRIMARIAS
Bioq. Esp. Federico Payes Monzón
Cátedra de Inmunología 2014
EL LABORATORIO DE HORMONAS
•Conjunto de operaciones relacionadas en forma directa con
la realización de las mediciones de los analitos
Fase analitica
•Antigeno –
Anticuerpo
•Sustancia •Sensibilidad
•Antígenos
Interacción marcadora Interpretación
Analitos (hormonas) primaria del resultado •Especificidad
•Metodos de
•Anticuerpos •Errores
marcación
•Tipos de
técnica
ANALITOS
Anticuerpos
Antigenos:
Presentes naturalmente Ej Hormonas, CD
No presentes naturalmente Ej drogas de abuso
Inmunoanalisis heterogeneos
El compuesto marcado presenta igual comportamiento este libre o
unido a un anticuerpo .
Requieren separación física de las fracciones ligadas (Ac-Ag*) y libres
(Ag*) antes de la medición
Requiere soporte sólido
Ej Ag microbianos
SEGÚN LA DISPONIBILIDAD DEL REACTIVO
Competitivos (modulacion de actividad)
Requiere un exceso de anticuerpos fijados.
Se utiliza un Ag marcado
Suero del paciente (contiene el Ag a medir)
La señal generada es inversamente proporcional a
la concentración del antigeno (analito).
No Competitivos (amplificación de actividad)
Requiere un exceso de anticuerpos fijados
Suero del paciente (contiene el Ag a medir)
Requiere un exeso de anticuerpos marcados
La señal generada es directamente proporcional a
la concentración del antigeno (analito).
INMUNOENSAYOS COMPETITIVOS
INMUNOENSAYOS NO COMPETITIVOS
TIPOS DE INMUNOENSAYOS SEGÚN MARCADORES
Sustancias
Inmunoensayo Marcadoras
RIA (Marcador: isótopo radiactivo)
Formación de conjugados a
ELISA (Marcador: enzima)
complejos moléculas
IF (Marcador: partícula fluorescente)
Ag-Ac que emiten
CLIA marcador: sust.quimioluminiscente
señales
detectables
El enzimoinmunoanálisis (EIA)
Efecto matriz
Se define como el conjunto de alteraciones ocasionadas por componentes de la
muestra, a excepción del analito a determinar.
Su detección puede ser llevada a cabo mediante la realización de diluciones sucesivas
en las muestras.
Anticuerpos heterófilos:
Constituidos por anticuerpos anti-IgG de animales empleados para la obtención
de los reactivos del inmunoanálisis, tales como ratón (HAMA), conejo, oveja,
etc. Existen interferencias para la TSH, prolactina y gonadotropina coriónica
humana, debido al uso de anticuerpos monoclonales de ratón con fines
diagnósticos (pruebas de imagen) o terapeúticos (antivirales, antineoplásicos,
trombolíticos, etc.).
Especificidad de los anticuerpos
Las características propias de los anticuerpos utilizados en las técnicas de
inmunoanálisis condicionan la especificidad de las mismas. Los problemas
derivados pueden ser debidos a una falta de especificidad, surgidos
principalmente en la utilización de anticuerpos policlonales y debidos
principalmente a reacciones cruzadas con componentes en la muestra de
estructura química similar, endógenos o farmacológicos, o por una excesiva
especificidad, propia de los anticuerpos monoclonales, y que tiene su origen en la
valoración exclusiva de la molécula intacta.
Este problema, especialmente presente cuando la hormona a cuantificar presenta
heterogeneicidad molecular o en el caso de secreción tumoral, es importante en los
análisis de hormona luteinizante, gonadotropina coriónica humana, hormona de
crecimiento y corticotropina entre otras
Efecto hook o gancho
Se produce de forma ocasional cuando la concentración del antígeno a
determinar es inusualmente elevada y uno o ambos anticuerpos quedan
saturados antes de que se forme el sándwich, induciendo resultados
falsamente disminuidos. La curva dosis-respuesta típica de estos métodos es
lineal hasta una concentración determinada en que se produce una meseta;
en caso de producirse el efecto hook, la curva inicia una pendiente negativa
hasta alcanzar valores bajos (Figura 10). Esta interferencia ha sido descrita
para la determinación de tiroglobulina, gonadotropina coriónica humana y
prolactina entre otras. Cuando se sospecha este fenómeno se recomienda la
realización de diluciones seriadas de la muestra hasta alcanzar una
concentración dentro del intervalo de referencia de la técnica
Fase postanalítica
Esta fase comprende el proceso desde que se obtiene el resultado de una prueba
hasta que el informe es recibido por el médico peticionario. El facultativo responsable
de la aceptación o validación de los resultados obtenidos ha de conocer determinados
aspectos analíticos, entre los que se incluyen los siguientes:
3) Errores analíticos:
Imprecisión e inexactitud existente de forma inherente en la técnica empleada, y que
han de ser mantenidas bajo el límite del error total permisible definido por el objetivo
analítico marcado.
4) Límite de detección:
Es el resultado aislado más pequeño que, con una determinada probabilidad, se
puede distinguir de un blanco verdadero.
5) Especificidad:
Es la capacidad de un método para determinar únicamente el componente que se
pretende medir.
6) Interferencias de la técnica:
La alteración de un determinado resultado debido a sustancias ajenas a las que se
pretende determinar.
Para que un resultado se considere aceptable, el Error Total del laboratorio ha de ser
inferior al Error Máximo Permitido basado en la especificación de calidad exigida.
Control de calidad interno
El control de calidad interno es aquel que se realiza íntegramente en el laboratorio
durante la actividad
diaria del mismo. Los resultados se obtienen de forma inmediata y permite tomar
decisiones en
tiempo real. El sistema clásico de control de calidad fue propuesto por Levey y
Jennings en la
década de los 50, y está basado en la representación gráfica de los resultados
analíticos de controles
a lo largo del tiempo (Figura 13). La media del valor control es el valor central de la
gráfica, y
el intervalo comprendido entre la media y dos DE limita el intervalo dentro del cual
el proceso
analítico se considera correcto (con un 95% de confianza)(29).
Este sistema fue perfeccionado por Westgard en 1970, mediante la implantación de un
sistema informatizado de normas, conocidas hoy en día como las reglas de Westgard,
incorporadas en la mayoría de los autoanalizadores automáticos. Se basa en el empleo de
una secuencia lógica de normas de control, cuya aplicación minimiza los falsos rechazos y
potencia la detección de errores.
Algunas de las reglas más empleadas son las siguientes
(36)(Figura 14):
-1-2s:Un valor sobrepasa los límites de +/- 2 DE. Detecta error aleatorio.
- 2-2s:Dos valores consecutivos sobrepasan los límites de +/- 2 DE. Detecta error
sistemático.
-1-3s:Un valor excede los límites de +/- 2 DE. Detecta error aleatorio.
- R-4s:La diferencia entre dos valores consecutivos del control es superior a 4 DE. Detecta
error aleatorio.
-4-1s:Cuatro valores consecutivos sobrepasan los límites de +/- 1 DE. Detecta error
sistemático.
-10-X:Diez valores consecutivos se encuentran por debajo o por encima de la media. Detecta
error sistemático.
Como norma general, la regla 1-2s se considera de aviso, mientras que el
resto se consideran criterio de rechazo, aunque depende en cada caso del
criterio del laboratorio. Dado que no existe una norma de control que
proporcione una respuesta óptima para el conjunto de errores aleatorios y
sistemáticos, la tendencia es la utilización de una combinación de estas
normas, las conocidas como multireglas de Westgard (33-36). La elección de
estas reglas depende del rendimiento del método y de las especificaciones
de calidad escogidas por el laboratorio, y pueden ser definidas en base a las
denominadas curvas de potencia, cuya elaboración se realiza en base a
programas informáticos y su
descripción queda fuera de los objetivos de este texto.
Control de calidad externo
Si bien los procedimientos de control interno permiten verificar la imprecisión propia
del proceso analítico, tienen como limitación su dificultad en la determinación de la
inexactitud del mismo.
Para ello se hace necesaria la participación en programas de control de calidad
externos.
Estos programas valoran los resultados obtenidos por varios laboratorios sobre los
mismos materiales de control.
La organización del programa compara los diferentes resultados aportados y verifica
la homogeneidad entre los mismos, permitiendo definir la inexactitud de cada
laboratorio con respecto del conjunto y facilitando de esta forma la transferibilidad de
resultados entre los participantes .
Este tipo de controles utiliza como valor diana la media del conjunto de todos los
laboratorios, teniendo en cuenta la agrupación de los mismos en función del método
empleado en los casos en los que existan grandes diferencias entre ellos.
La información obtenida puede ser empleada para ajustar los valores de los
calibradores de cada laboratorio, ajustándose de esta forma al valor medio
consenso de los participantes.
MUCHAS GRACIAS