MEMORIA DESCRIPTIVA

Estado del arte

La pesca industrial en Chile y el mundo se nutre fundamentalmente de la gran capacidad

de reproducción de las especies comerciales que se han adaptado a las elevadas tasas de
mortalidad en el mar mediante la reproducción masiva. El problema surge cuando las capturas
son excesivas puesto que las pérdidas no pueden recuperarse al mismo ritmo. Indirectamente, los
centros de cultivo intensivos de especies marinas se ven afectado por este fenómeno, debido
principalmente al déficit de producción mundial de harina de pescado, rico en proteínas y
aminoácidos, constituyente esencial de las dietas para uso acuícola, pero con un impacto negativo
en el ambiente acuático. Dado lo anterior surge la necesidad de encontrar alternativas al uso de
harina de origen animal por otras de origen vegetal, que sean rentables y sustentables en el
ambiente. Por este motivo, en conjunto con la búsqueda de alternativas al uso de harina de
pescado, se ha enfocado el interés en la utilización de aditivos alimentarios, en particular los
probióticos, bien establecidos en la acuicultura de los países desarrollados, aun cuando la
incorporación de éstos en la acuicultura es relativamente reciente (Kosaza, 1986), y también
como alternativa al uso de antibióticos, sustancia química de comprobada acción antimicrobiana,
pero cuya actividad ha contribuido a la aparición de bacterias resistentes a estas sustancias, que
suponen un riesgo para los consumidores y para el ecosistema en general.
El concepto moderno de probiótico fue formulado por Parker, en 1974, que se refería a
“organismos o sustancias que contribuyen al balance microbiano intestinal”. Esta definición fue
restringida por Fuller en 1989, a “organismos o substancias que tienen un efecto beneficioso para
el animal anfitrión (humano y no humano) y que contribuye a su balance microbiano intestinal”.
Definiciones como ésta no son del todo satisfactorias, porque el término substancia incluye a
químicos como los antibióticos. Havenaar y Huis (1992) ampliaron la definición de probióticos a
“mezclas o monocultivos de microorganismos que, aplicados a un animal o ser humano, afectan
beneficiosamente el anfitrión, mejorando las propiedades de la microflora nativa del organismo”.
El tratamiento con probióticos puede ser considerado como un método de control biológico,
en términos de inhibir o eliminar infecciones causadas por organismos adversos, como parásitos
o patógenos específicos, muy comunes en centros de cultivos por la alta densidad poblacional de
éstos, que facilita la propagación de enfermedades entre los peces.
En este aspecto, la utilización de bacterias Gram positivas del género Lactobacillus,
microorganismos fáciles de cultivar, con altas tasas de crecimiento, fuentes de carbono y
nitrógeno, de muy bajo costo, en su mayoría GRAS (generalmente reconocidas como seguras),
no patógenas al hombre, productoras de una alta y diversa cantidad de metabolitos secundarios y
sustancias bioactivas, constituyen uno de los mejores candidatos para ser utilizados como
probióticos en la acuicultura.
El tratamiento con probióticos puede ser considerado como un método de control biológico
(biocontrol) en términos de la eliminación o limitación de enfermedades debido a la introducción
de organismos adversos al ambiento acuático, como parásitos o patógenos específicos.
Los peces están obligados a tragar agua constantemente para prevenir la pérdida de agua a
partir del cuerpo, y este flujo de agua continuo aumenta la influencia del medio circundante. En
acuicultura la microbiota intestinal interactúa de forma constante con el ambiente, el cual tiene
una influencia mucho mayor sobre la salud de los peces, que en el caso de los humanos o
animales terrestres. Es por esta razón que se estudia la incorporación de probióticos de dos
formas: a través de la adición en el agua y a través del alimento.
Panigrahi et al. (2004) estudió la incorporación de una cepa de Lactobacillus rhamnosus en la
dieta de truchas arcoiris para analizar su respuesta inmune. Este autor adicionó el probiótico a los
ingredientes basales del alimento bajo condiciones de esterilidad.
Balcázar et al. (2007) utilizaron cepas probióticas de Leuconostoc mesenteroides y
Lactobacillus plantarum para evaluar su acción en trucha arcoíris y efectuando ensayos de
desafío con una cepa de Lactococcus garvieae luego de 30 días de administrado el alimento
probiótico. Estos autores incorporan las bacterias en un alimento comercial mediante una etapa
de mezcla en un tambor, alcanzando una concentración de 10E6 UFC/g. Estos autores utilizaron
medio comercial MRS para la etapa de producción de biomasa probiótica.

Si bien existen otras referencias que citan la formulación de dietas con probióticos, el
procedimiento que se describirá a continuación cuenta con una serie de elementos asociados a la
patentabilidad de éste.
Estado de la propiedad Industrial.

Pendiente (trabajo de la UPI)

Descripción del invento.

La presente solicitud de patente de invención consiste en el desarrollo de un alimento

probiótico para trucha arcoiris, a partir de biomasa obtenida desde un medio de cultivo ya
patentado y optimizado para estas bacterias.
Este procedimiento destaca por la formulación de biomasa probiótica desde un medio de
cultivo en base a permeado de lactosuero con aditivos, utilización de bacterias autóctonas
aisladas en la octava región de Chile y una etapa de preparación del alimento para truchas que
incluye tratamiento térmico, dosificación de texturizantes, incorporación de biomasa y formación
de pellets probióticos.

El procedimiento para la formulación de este alimento consta de las siguientes etapas:

i) Una etapa de formulación de la biomasa probiótica utilizando un medio de cultivo

semidefinido al que se le han incorporado además algunos micronutrientes (magnesio,
manganeso en forma de sales)
ii) Una etapa de centrifugación de la biomasa probiótica y resuspensión de ella en una solución
de leche descremada con agua peptona (leche descremada al 5% y peptonas al 1%) en
condiciones de esterilidad.
iii) Una etapa de pasteurización del alimento fresco para truchas (tanque agitado con motor de
alto torque, 65ºC, 45 minutos)
iv) Una etapa de texturización del alimento pasteurizado mediante la incorporación de almidones
(harina de trigo, almidón de maíz, almidón de papa, en una concentración del 1%) en
condiciones de esterilidad.
v) Una etapa de incorporación de la mezcla de biomasa probiótica con el alimento pasteurizado
y texturizado bajo agitación controlada por 15 minutos, para asegurar la homogeneidad del
 producto (temperatura ambiente, motor de alto torque, 60 rpm), también en condiciones de
esterilidad.
vi) Una etapa de formación de pellet bajo condiciones de esterilidad, a temperatura ambiente en
un molino con tornillo sinfín. El molino cuenta con piezas intercambiables para la
elaboración de alimentos de 2, 3 y 4 mm de diámetro.

Ejemplos de aplicabilidad.

Optimización de medio de cultivo ya patentado para la producción de biomasa probiótica

para uso en trucha arcoíris.

Como se mencionó, el medio de cultivo previamente desarrollado a partir de permeado de

lactosuero para el cultivo de cepas de lactobacilos, fue necesario reformularlo para su utilización
en estas nuevas cepas. Esto se debe fundamentalmente a que los organismos acuáticos poseen
otros requerimientos nutricionales y pertenecen preferentemente además a un grupo metabólico
denominado “heterofermentativo”.

En el comienzo de este estudio, se efectuaron cinéticas de crecimiento de las 2 cepas de

Lactobacilos en los medios comerciales MRS y Rogosa (R), además del caldo LAPTg y del caldo
en base a permeado de lactosuero (M). En estas tres primeras Figuras se pueden observar las
tendencias obtenidas para la viabilidad de las cepas, crecidas en los diferentes caldos.
 1,E+12

1,E+10
Cepa 32, LAPTg
1,E+08 Cepa 32, R
UFC/ml Cepa 32, M
1,E+06 Cepa 32, MRS

1,E+04

1,E+02

1,E+00
0 12 24 36 48 60
Tiempo (h)

Figura 1. Viabilidad en función del tiempo, para cepa 32

(LAPTg, R, M, MRS, 20ºC, 90rpm, pHo = 6.0)

1,E+10
Cepa 87, LAPTg
1,E+08 Cepa 87, R
Cepa 87, M
1,E+06 Cepa 87, MRS
UFC/ml
1,E+04

1,E+02

1,E+00
0 12 24 36 48 60
Tiempo (h)

Figura 2. Viabilidad en función del tiempo, para cepa 87

(LAPTg, R, M, MRS, 20ºC, 90rpm, pHo = 6.0)
 1,E+12
Cepa 32, LAPTg

1,E+10 Cepa 32, R

Cepa 32, M
1,E+08 Cepa 32, MRS
Cepa 87, LAPTg
1,E+06
UFC/ml
Cepa 87, R

1,E+04 Cepa 87, M

Cepa 87, MRS
1,E+02

1,E+00
0 12 24 36 48 60
Tiempo (h)

Figura 3. Viabilidad en función del tiempo, para ambas cepas

(LAPTg, R, M, MRS, 20ºC, 90rpm, pHo = 6.0)

Al observar estas tres figuras queda claro que no existe un fuerte efecto del medio de
cultivo sobre las cinéticas de viabilidad de los microorganismos. Si bien en algunos puntos
experimentales no se observaron colonias viables para el caldo LAPTg, esto puede deberse a
error experimental o bien a la carencia mínima de nutrientes. En el caso de la Figura 2, para la
cepa 87, la explicación puede estar en un error experimental, puesto que luego de 60 horas la
viabilidad vuelve a encontrarse en el orden de 10e9 Ufc/ml para el caldo LAPTg. Sin embargo,
para todos los medios ensayados ambas cepas alcanzan la fase estacionaria luego de las 24 horas.
Otro aspecto muy importante que debe ser mencionado aquí es que las colonias viables
presentaron diferentes tiempos de incubación, además de diferencias de tamaño para cada medio
de cultivo, siendo siempre las colonias de mayor tamaño y de más rápida incubación en los
medios comerciales Rogosa (R) y MRS. Diferencias importantes fueron además visualizadas en
tinciones de gram efectuadas para distintos tiempos de crecimiento y para los distintos medios de
cultivo. Estos dos últimos aspectos indican que si bien las cepas se encontraban viables en cada
uno de los medios de cultivo, no se encontraban con idéntica actividad metabólica, debido a la
carencia de nutrientes, especialmente en los medios LAPTg y medio en base a permeado de
lactosuero (M). Esto queda demostrado al observar las tendencias de turbidez (540 nm) en
función del tiempo:
 5

Cepa 32, medio M

4
Cepa 32, medio LAPTg

Cepa 32, medio R

3
DO Cepa 32, medio MRS

0
0 12 24 36 48 60

Tiempo (h)

Figura 4. Turbidez (540 nm) en función del tiempo, para la cepa 32

(LAPTg, R, M, MRS, 20ºC, 90rpm, pHo = 6.0)

8
Cepa 87, medio M
Cepa 87, medio LAPTg
6 Cepa 87, medio R
Cepa 87, medio MRS

DO
4

0
0 12 24 36 48 60
Tiempo (h)

Figura 5. Turbidez (540 nm) en función del tiempo, para la cepa 87

(LAPTg, R, M, MRS, 20ºC, 90rpm, pHo = 6.0)
 8 Cepa 32, medio M

Cepa 32, medio LAPTg

Cepa 32, medio R

6
Cepa 32, medio MRS

Cepa 87, medio M

DO
4 Cepa 87, medio LAPTg

Cepa 87, medio R

Cepa 87, medio MRS

2

0
0 12 24 36 48 60
Tiempo (h)

Figura 6. Turbidez (540 nm) en función del tiempo, para ambas cepas
(LAPTg, R, M, MRS, 20ºC, 90rpm, pHo = 6.0)

En estas Figuras se observa que para ambas cepas sólo en los medios comerciales se
alcanzó una turbidez cercanos o superiores a 3, inversamente a lo ocurrido en los medios LAPTg
y M, donde sólo se alcanzaron valores próximos a la unidad. Estos resultados concuerdan con las
cinéticas de descenso de pH:
 6 Cepa 32, M

Cepa 32, medio LAPTg

5,5 Cepa 32, medio R

Cepa 32, medio MRS

5
pH

4,5

3,5
0 12 24 36 48 60
Tempo (h)

Figura 7. Descenso de pH en función del tiempo, para la cepa 32

(LAPTg, R, M, MRS, 20ºC, 90rpm, pHo = 6.0)

6
Cepa 87, M

Cepa 87, medio LAPTg

5,5
Cepa 87, medio R

Cepa 87, medio MRS

5
pH

4,5

3,5
0 12 24 36 48 60
Tempo (h)

Figura 8. Descenso de pH en función del tiempo, para la cepa 87

(LAPTg, R, M, MRS, 20ºC, 90rpm, pHo = 6.0)
 Cepa 32, M
6
Cepa 32, medio LAPTg

Cepa 32, medio R

5,5
Cepa 32, medio MRS

Cepa 87, M
5
pH Cepa 87, medio LAPTg

Cepa 87, medio R

4,5 Cepa 87, medio MRS

3,5
0 12 24 36 48 60
Tempo (h)

Figura 9. Descenso de pH en función del tiempo, para ambas cepas

(LAPTg, R, M, MRS, 20ºC, 90rpm, pHo = 6.0)

En las Figuras 7, 8 y 9 ha quedado de manifiesto que el descenso de pH se logra de mejor

forma en el medio comercial MRS, seguidos por los caldos Rogosa y LAPTg. Estos resultados
muestran que estas cepas, a diferencia de otras cepas anteriormente ensayadas, logran mayor
actividad metabólica en el caldo comercial MRS. Este caldo posee un conjunto de nutrientes que
lo hacen ser muy enriquecido, más que los caldos Rogosa, LAPTg y M. El importante descenso
de pH alcanzado en el medio LAPTg, semejante al logrado en medio comercial Rogosa, se debe
a su alta concentración de peptonas. Sin embargo, esto no es suficiente para suplir correctamente
las exigencias nutricionales de las bacterias, debido a la baja concentración de biomasa alcanzada
por las cepas en este medio (LAPTg)
En base a estos resultados, se ha planificado un nuevo conjunto de experimentos,
consistentes en la reformulación del medio M (en base a permeado de lactosuero), con el objetivo
de lograr una producción de biomasa con microorganismos con alta actividad, capaces de resistir
en mejor forma condiciones adversas impuestas por futuras operaciones unitarias
(concentraciones, secado, formulación de alimentos) y capaces además de ejercer de una mejor
forma su rol preventivo como probiótico en nuevos bioensayos.
Reformulación del medio en base a permeado de lactosuero (M)

Como ya se ha observado anteriormente, el medio comercial MRS suple de mejor forma

las exigencias nutricionales de estas cepas, respecto al medio comercial Rogosa. Es por ello que
se continuará utilizando como “control de crecimiento positivo” este caldo.
El objetivo será entonces emular el crecimiento de las cepas en MRS, para un caldo semidefinido
en base a permeado de lactosuero, con el aumento de algunos nutrientes que permitan alcanzar
una actividad necesaria que asegure el éxito de las operaciones futuras con las cepas, tanto en
etapas productivas como en su efecto final como probióticos. Es muy importante destacar aquí
que cualquier componente adicionado al medio de cultivo M ya existente encarecerá el proceso.
Es por ello que la justificación en la incorporación de un nuevo compuesto debe estar justificada
en un notable aumento en la actividad de los microorganismos y en su acción probiótica.
En esta etapa del trabajo se ha contemplado la modificación en las concentraciones de peptona,
extracto de levadura, extracto de carne y acetato de sodio. En la siguiente tabla se pueden
observar las modificaciones efectuadas para cada nuevo medio de cultivo:

Tabla 1. Nuevos medios de cultivo para el crecimiento de cepas de trucha arcoíris

MRS M M1 M2 M3 M4 M5
Peptona Caseina 1 - + - - + -
Extracto de carne 1 - - + - - -
Extracto de levadura 0,4 - - - + + -
D glucosa 2 - - - - - -
D-Hidrog.-Fosf.-P. 0,2 +/- +/- +/- +/- +/- +/-
Tween 80 0,1 +/- +/- +/- +/- +/- +/-
Acetato de sodio 0,5 + + + + - -
Permeado de 0 + + + + + +
lactosuero
Enzima 0 + + + + + +
Citrato 0,2 - - - - - -
S. manganeso 0,001 - - - - - -
S. mangnesio 0,02 - - - - - -

Obs. + Indica un aumento de la concentración del reactivo con respecto al medio M

- Indica una disminución de la concentración del reactivo con respecto al medio M
 Es importante mencionar que todos los nutrientes modificados, a excepción del acetato de
sodio, son nutrientes semidefinidos, tal como lo es el permeado de lactosuero (peptonas, extracto
de carne, extracto de levadura). Con esto, cobra más fuerza la opción de incorporar nutrientes
semidefinidos provenientes de la industria alimenticia, con el fin de abaratar costos en la etapa de
cultivo. Futuros trabajos tenderán a la incorporación de fuentes de nitrógeno de origen animal y/o
vegetal, fuentes de vitaminas, micronutrientes, fuentes de minerales (tomando en cuenta que
somos grandes productores y exportadores de una amplia grama de minerales).
De los resultados obtenidos al igual que los anteriores, se observa que no existe una
dependencia entre el medio de cultivo formulado y las colonias viables, pero de la misma forma
se observaron diferencias importantes en la morfología obtenida por tinción de Gram, además de
los tiempos de incubación de las placas para cada medio y el tamaño de las colonias. Estas dos
observaciones serán tomadas en cuenta en futuros ensayos, para efectuar tinciones de Gram desde
biomasa lavada para tomar fotografías apropiadas, además de fotografiar las colonias obtenidas
para los distintos medios de cultivo.
En las Figuras de turbidez (540 nm) en función del medio de cultivo se puede observar
que, si bien existieron aumentos en las concentraciones de biomasa para los medios de cultivo
M4 y M5, estos no son comparables todavía con el aumento experimentado en medio comercial
MRS. La diferencia en producción de turbidez experimentada por los medios M4 y M5 no es
sustancialmente diferente, a pesar de que el medio M4 sólo considera la reducción en la
concentración de acetato y el medio M5 considera la reducción de esta sustancia y el aumento en
la concentración de peptonas, extracto de carne y extracto de levadura. Diferentes autores han
mencionado al acetato como inhibidor del crecimiento para otras cepas diferentes a Lactobacillus
spp., mientras que otros lo han reportado como potenciador en el crecimiento de estos
microorganismos. A la luz de estos resultados, el acetato actúa como inhibidor en el crecimiento
de estas cepas. Hay que recordar que los requerimientos nutricionales de los microorganismos
son específicos para cada uno, al igual que la producción de metabolitos de reacción. En el caso
de estas cepas, que pertenecen a grupos metabólicos heterofermentativos, excretan acetato como
respuesta a sus procesos de vida, al igual que CO 2. Si bien la producción de CO 2 no fue
cuantificada, fue necesario efectuar un sello especial para la tapa de lo viales de cultivo, con el fin
de que no se produjeran fugas y potenciales contaminaciones.
 Cepa 32, MRS
5
Cepa 32, M

4 Cepa 32, M1

Cepa 32, M2
3
Cepa 32, M3
DO

2 Cepa 32, M4

Cepa 32, M5
1

0
0 12 24 36 48 60 72 84 96
Tempo (h)

Figura 10. Turbidez (540 nm) en función del tiempo, para la cepa 32
(MRS, M, M1, M2, M3, M4, M5, 20ºC, 90rpm, pHo = 6.0)

Cepa 87, MRS

9
Cepa 87, M

7,5 Cepa 87, M1

Cepa 87, M2
6
Cepa 87, M3
DO
4,5 Cepa 87, M4

Cepa 87, M5
3

1,5

0
0 12 24 36 48 60 72 84 96
Tempo (h)

Figura 11. Turbidez (540 nm) en función del tiempo, para la cepa 87
(MRS, M, M1, M2, M3, M4, M5, 20ºC, 90rpm, pHo = 6.0)
 Cepa 32, MRS
9
Cepa 32, M
Cepa 32, M1
7,5
Cepa 32, M2
Cepa 32, M3
6
Cepa 32, M4
Cepa 32, M5
DO

4,5
Cepa 87, MRS
Cepa 87, M
3
Cepa 87, M1
Cepa 87, M2
1,5
Cepa 87, M3
Cepa 87, M4
0
Cepa 87, M5
0 12 24 36 48 60 72 84 96
tiempo (h)

Figura 12. Turbidez (540 nm) en función del tiempo, para ambas cepas
(MRS, M, M1, M2, M3, M4, M5, 20ºC, 90rpm, pHo = 6.0)

En cuanto al descenso del pH, estos son concordantes con las tendencias obtenidas para el
aumento en la turbidez, produciéndose de mejor forma en el medio MRS, seguidos por los
medios M4 y M5.

6 Cepa 32, MRS

Cepa 32, M
5,5 Cepa 32, M1
Cepa 32, M2
Cepa 32, M3
5
Cepa 32, M4
pH

Cepa 32, M5
4,5

3,5
0 12 24 36 48 60 72 84 96
tiempo (h)

Figura 13. Descenso del pH en función del tiempo, para la cepa 32

(MRS, M, M1, M2, M3, M4, M5, 20ºC, 90rpm, pHo = 6.0)
 6 Cepa 87, MRS

Cepa 87, M
5,5 Cepa 87, M1

Cepa 87, M2
5
Cepa 87, M3
pH

Cepa 87, M4
4,5
Cepa 87, M5

3,5
0 12 24 36 48 60 72 84 96
tiempo (h)

Figura 14. Descenso del pH en función del tiempo, para la cepa 87

(MRS, M, M1, M2, M3, M4, M5, 20ºC, 90rpm, pHo = 6.0)

Cepa 32, MRS

6
Cepa 32, M
Cepa 32, M1
5,5 Cepa 32, M2
Cepa 32, M3

5 Cepa 32, M4
Cepa 32, M5
pH

Cepa 87, MRS

4,5
Cepa 87, M
Cepa 87, M1
4 Cepa 87, M2
Cepa 87, M3

3,5 Cepa 87, M4

0 12 24 36 48 60 72 84 96 Cepa 87, M5

tiempo (h)

Figura 15. Descenso del pH en función del tiempo, para ambas cepas.
(MRS, M, M1, M2, M3, M4, M5, 20ºC, 90rpm, pHo = 6.0)

Hay que destacar que el efecto favorable alcanzado tanto en la producción de biomasa
como en el descenso de pH en los medios M4 y M5 se deben fundamentalmente a la reducción en
la concentración de acetato en el medio de cultivo. La explicación para esto radica en el hecho de
que estas cepas son productoras de acetato, poseen otros mecanismos metabólicos diferentes que
los de las cepas homofermentativas.
En virtud de lo anterior, se ha planeado el estudio en nuevos medios de cultivo, pero con la
incorporación de magnesio, manganeso y citrato en bajas concentraciones, para el medio de
cultivo M4.

Efecto de la incorporación de citrato, magnesio y manganeso sobre el crecimiento de las cepas

probióticas

Como en los experimentos anteriores ha quedado demostrado que la viabilidad de los

microorganismos es independiente del medio de cultivo utilizado, en este nuevo set experimental
se ha contemplado la medición de turbidez, pH y observación de tinciones de Gram.
Este nuevo set experimental contempla la incorporación de citrato, magnesio y
manganeso en cantidades muy pequeñas, especialmente el magnesio y el manganeso. El citrato
actúa como cofactor de fermentación, junto con algún azúcar como glucosa, ribosa, galactosa,
etc., aunque algunos autores lo han reportado como fuente energética sin la necesidad de
presentar azúcares. Por otra parte, las sales de magnesio y manganeso han sido asociadas a la
producción de enzimas relacionadas con los procesos de vida de los Lactobacilos (racemasa
encargada de producir L-lactato y D-lactato, fermentación de azúcares, producción de otras
moléculas de los microorganismos).
 La siguiente tabla muestra el nuevo diseño experimental efectuado:

Tabla 2. Nuevos medios formulados para el crecimiento de cepas de trucha arcoíris.

Con permeado Con agua destilada
MRS M M1 M2 M3 M8 M5 M6 M7
Peptona Caseina 1 - - - - + - - -
Extracto de carne 1 - - - - - - - -
Extracto de levadura 0,4 - - - - + - - -
D glucosa 2 - - - - - + - +
D-Hidrog.-Fosf.-P. 0,2 +/- +/- +/- +/- +/- +/- +/- +/-
Tween 80 0,1 +/- +/- +/- +/- +/- +/- +/- +/-
Acetato de sodio 0,5 + - - - - - - -
Permeado de 0 + + + + + - - -
lactosuero
Enzima 0 + + + + + - - -
Citrato 0,2 - + - + + - + +
S. manganeso 0,001 - - + + - - - -
S. mangnesio 0,02 - - + + - - - -

Obs. + Indica un aumento de la concentración del reactivo con respecto al medio M

- Indica una disminución de la concentración del reactivo con respecto al medio M

6 Cepa 32, MRS

Cepa 32, M

Cepa 32, M1
5
Cepa 32, M2

Cepa 32, M3
4
Cepa 32, M5

Cepa 32, M6
DO

3 Cepa 32, M7

Cepa 32, M8

0
0 12 24 36 48 60 72
tiempo (h)

Figura 16. Turbidez (540 nm) en función del tiempo, para la cepa 32.
(MRS, M, M1, M2, M3, M5, M6, M7, M8, 20ºC, 90rpm, pHo = 6.0)
 7 Cepa 87, MRS

Cepa 87, M
6
Cepa 87, M1

Cepa 87, M2
5
Cepa 87, M3

Cepa 87, M5
4
DO

Cepa 87, M6

Cepa 87, M7
3
Cepa 87, M8

0
0 12 24 36 48 60 72
tiempo (h)

Figura 17. Turbidez (540 nm) en función del tiempo, para la cepa 87.
(MRS, M, M1, M2, M3, M5, M6, M7, M8, 20ºC, 90rpm, pHo = 6.0)

7 Cepa 32, MRS

Cepa 32, M
Cepa 32, M1
6
Cepa 32, M2
Cepa 32, M3
5 Cepa 32, M5
Cepa 32, M6
Cepa 32, M7
4
Cepa 32, M8
DO

Cepa 87, MRS

3 Cepa 87, M
Cepa 87, M1
Cepa 87, M2
2 Cepa 87, M3
Cepa 87, M5
Cepa 87, M6
1
Cepa 87, M7
Cepa 87, M8
0
0 12 24 36 48 60 72
tiempo (h)

Figura 18. Turbidez (540 nm) en función del tiempo, para ambas cepas.
(MRS, M, M1, M2, M3, M5, M6, M7, M8, 20ºC, 90rpm, pHo = 6.0)

De estas Figuras se observa el fuerte efecto provocado por la incorporación de estos

nuevos factores nutricionales, que aunque se encuentran en baja concentración, permiten activar
una serie de complejos procesos en los microorganismos, que se traducen en el aumento en su
capacidad de asimilar el medio M con la incorporación de citrato, magnesio y manganeso (M2 y
M3). La incorporación sólo de los minerales (MRS) ya permite un aumento en la producción de
biomasa, cercano al experimentado en el medio comercial MRS.
Similares tendencias se observaron con el descenso del pH, tanto para los medios M2 y
M3 y MRS.

Cepa 32, MRS

Cepa 32, M
5,5
Cepa 32, M1
Cepa 32, M2
Cepa 32, M3
pH

5
Cepa 32, M5
Cepa 32, M6
Cepa 32, M7
4,5
Cepa 32, M8

4
0 12 24 36 48 60 72
tiempo (h)

Figura 19. Descenso del pH en función del tiempo, para la cepa 32.
(MRS, M, M1, M2, M3, M5, M6, M7, M8, 20ºC, 90rpm, pHo = 6.0)
 6 Cepa 87, MRS
Cepa 87, M
Cepa 87, M1
5,5
Cepa 87, M2
Cepa 87, M3
5 Cepa 87, M5
Cepa 87, M6
pH

Cepa 87, M7
4,5 Cepa 87, M8

3,5
0 12 24 36 48 60 72
tiempo (h)

Figura 20. Descenso del pH en función del tiempo, para la cepa 87.
(MRS, M, M1, M2, M3, M5, M6, M7, M8, 20ºC, 90rpm, pHo = 6.0)

Cepa 32, MRS

6
Cepa 32, M
Cepa 32, M1
Cepa 32, M2
5,5
Cepa 32, M3
Cepa 32, M5
Cepa 32, M6
5 Cepa 32, M7
Cepa 32, M8
pH

Cepa 87, MRS

4,5 Cepa 87, M
Cepa 87, M1
Cepa 87, M2
4 Cepa 87, M3
Cepa 87, M5
Cepa 87, M6
3,5 Cepa 87, M7
0 12 24 36 48 60 72 Cepa 87, M8

tiempo (h)

Figura 21. Descenso del pH en función del tiempo, para ambas cepas.
(MRS, M, M1, M2, M3, M5, M6, M7, M8, 20ºC, 90rpm, pHo = 6.0)
 Con estos resultados es posible concluir que estas nuevas cepas en estudio poseen
diferentes exigencias nutricionales que las cepas aisladas desde mujeres. El medio de cultivo M
fue optimizado para cepas vaginales con propiedades probióticas, perteneciendo en su mayoría a
grupos metabólicos homofermentativos.
Hay que mencionar que las pequeñas cantidades de nutrientes incorporada al medio ya
existente no resulta económicamente desventajoso frente a la posibilidad de contar con una
biomasa altamente activa, resistente a entornos adversos y potencialmente con mayor capacidad
para expresar sus propiedades probióticas (en forma de biomasa fresca, a través de un alimento
probiótico, otras). De ninguna manera se pierde el horizonte para la formulación de nuevos
ingredientes semidefinidos a partir de residuos de la industria alimenticia, para la reducción en
los costos de producción en la etapa de cultivo (por lo menos un 30% de los costos totales de
producción)
Para finalizar sólo basta mencionar que debido a la rápida capacidad de adaptación y a la
alta actividad que presentan los microorganismos en medio comercial MRS, se propone en
futuras experiencias modificar el protocolo de activación de las cepas, utilizando caldo MRS y
agitación. En estos momentos se está trabajando en ello y se han encontrado importantes
diferencias entre el protocolo de activación ya establecido y los nuevos protocolos de activación a
utilizar. La literatura muestra además que existe un efecto en la activación de los
microorganismos sobre la etapa de crecimiento y producción de metabolitos en cepas de
Lactobacillus spp.
En cuanto a la producción de CO 2, acetato y otros metabolitos, ellos pueden ser una
potencial fuente de nuevos productos que permitan incrementar el valor agregado del proceso
global.
En las siguientes páginas se muestran los principales resultados obtenidos para las cepas
probióticas estudiadas. Sin embargo, en el APÉNDICE de este informe se muestran algunos de
los procedimientos y metodologías ya utilizados previamente, tanto para las etapas de cultivo
como para las etapas de deshidratación. Un nuevo procedimiento es mostrado en este trabajo y
está asociado a la formulación del alimento probiótico. Este procedimiento consiste en una etapa
de pasteurización del alimento proveniente de la planta Frionatur, una etapa de incorporación de
la biomasa probiótica y una etapa de formulación de pellets de distinto diámetro de acuerdo a los
requerimientos (dependiendo de la talla de los peces a alimentar).
Cultivo de biomasa y formulación de alimento probiótico para su uso en trucha arcoíris
(Toledo, II-2005)

Propiedades Tecnológicas de las cepas probióticas

Resistencia de las cepas de lactobacilos probióticos a temperatura.

Una propiedad deseable para una cepa probiótica es que sea resistente a un potencial
estrés térmico, debido a las operaciones de concentración y secado, que pueden implicar un
calentamiento excesivo de esta, especialmente en la etapa de secado del material.
A continuación se presentan las figuras asociadas a la pérdida de viabilidad en el tiempo
para las cepas probióticas en estudio. Estos microorganismos mostraron curvas de de destrucción
térmica de primer orden, características para bacterias (Bórquez, 1995):
 N 
ln   k  t (1)
 N0 
Donde N es la concentración de microorganismos en un tiempo “t”, N0 es la concentración
inicial y “k” es la constante de destrucción térmica del microorganismo. Otro parámetro de
interés industrial y que permite conocer la dinámica del comportamiento del microorganismo
frente a procesos de calentamientos es “z”. Físicamente “z” representa el salto de temperatura
necesario que se requiere para que la constante “k” de destrucción térmica reduzca 1/10 veces su
valor (Junge, 1989; Bórquez, 1995):

 k   T  T1 
log 2   2 (2)
 k1  z

Si este valor de “z” es alto significa que es necesario un mayor salto térmico para lograr
una mayor destrucción del microorganismo.
 Figura 22. Resistencia térmica de la cepa probiótica 32.

Figura 23. Resistencia de la cepa probiótica 87

Una respuesta predecible para estos microorganismos es que ellos son más sensibles que
cepas provenientes de organismos terrestres que poseen una temperatura media de 37ºC. Hay que
recordar que estos microorganismos provienen de animales cuyas temperaturas oscilan entre 4-
15ºC. Otro resultado que resulta interesante es que tanto la cepa 32 como la cepa 87 poseen
prácticamente los mismos parámetros de destrucción térmica para las temperaturas ensayadas.
Como era de esperar la mayor reducción decimal se obtuvo a 60 (ºC). Hassan S (2003), quien
trabajó con una cepa de Lactobacillus acidophillus probiótica, demostró que la cepa en estudio
mostraba una mayor termo-resistencia si se encontraba microencapsulada en diferentes gomas y
aditivos como alginato de sodio, goma guar, derivados lácteos, entre otros, con respecto a la
termo-resistencia de la misma cepa, pero no microencapsulada y sin presencia de agentes
protectores (sólo las bacterias libres). Este resultado confirma además que la incorporación de
aditivos puede mejorar la termo-resistencia de los lactobacilos. Sin embargo, el objetivo de este
estudio fue determinar la resistencia térmica de las cepas sin aditivos, pues los aditivos a utilizar
serán incorporados en la etapa de secado, donde influyen una serie de mecanismos sobre la
viabilidad del producto y no se pueden separar los efectos de cada uno de ellos. Por otra parte, la
información aquí recopilada permite confirmar que estas cepas, además de sus propiedades
probióticas, poseen una alta resistencia térmica, lo que la hace potencialmente resistente a futuros
procesos de concentración y secado. Cuando un producto que posee agua libre es secado con aire,
la temperatura de secado se aproxima a la temperatura de bulbo húmedo, que oscila entre los 35-
60ºC, dependiendo de la humedad del aire y de su temperatura de bulbo seco. Ross et al (2000)
determinaron curvas de destrucción térmica entre 55 y 61ºC para cepas de Lactobacillus spp en
un período de tiempo inferior a 5 minutos en todos los casos, por alta pérdida de viabilidad en el
tiempo. Estos autores no determinaron parámetros de destrucción térmica. Bayrock e Ingledew
(10) determinaron que sus cepas de levaduras para uso panario sólo resistían temperaturas
inferiores a 52ºC. Este último resultado es muy alentador si se piensa que las levaduras en general
tienden a ser más resistentes a condiciones adversas que otros microorganismos. Esta propiedad
tecnológica favorable de estas cepas permite predecir que las futuras operaciones de
concentración, deshidratación y alguna otra operación asociada a temperatura será resistida por
ellas, especialmente en el rango comprendido entre 40-50ºC.
Finalmente, se muestran tablas con las constantes de destrucción térmica de ambos
microorganismos y se comparan con los obtenidos para lactobacilos vaginales (obtenidas de
cepario construido durante la ejecución de proyecto Fondef D01 I1121).
 Tabla 3. Parámetros de destrucción térmica para cepas de trucha
Cepa T(ºC) k (min-1) D (min)
40 0 inf
50 0,0264 87,12
32
55 0,0309 74,43
60 0,7315 3,14
40 0 inf
50 0,0463 49,68
87
55 0,1682 13,67
60 1,3963 1,65

Cepa Z (ºC)
32 6,93
87 6,76

Tabla 4. Parámetros de destrucción térmica para cepas vaginales

Cepa T(ºC) k (min-1) D (min)
45 0 inf
50 0,0153 150,33
31Ra
55 0,0181 127,07
60 0,1124 20,46
45 0,0032 718,75
50 0,0438 52,51
44La
55 0,1058 21,74
60 0,8004 2,87
45 0,001 2300
50 0,0395 58,23
69Ra
55 0,0967 23,78
60 0,6064 3,79

Cepa Z
31Ra 11.55
44La 7.92
69Ra 8.43

De estas últimas tablas se infiere lo que ya se había mencionado: las cepas de origen
vaginal (hembra a 37ºC) poseen mayor resistencia térmica que las cepas de origen acuático
(truchas a 4-15ºC). Es notable destacar los parámetros de destrucción de la cepa 31Ra, productora
de biopelículas y con altas propiedades probióticas. Estas altas propiedades probióticas se
correlacionan con la resistencia térmica de la cepa, mayor que las demás cepas vaginales y que
las cepas de trucha. Es interesante destacar además que tanto las constantes “k” como el
parámetro “z” de todos los microorganismos (a excepción de la cepa 31Ra) no difieren en
órdenes de magnitud, por lo que existen grandes diferencias en la resistencia térmica de las cepas.
La literatura también avala que la producción de biopelículas y de exopolisacáridos por parte de
cepas de Lactobacillus spp. poseen una mayor resistencia a condiciones y entornos adversos
(Texeira et al., 2004).

Resistencia de cepas de lactobacilos probióticos a estrés químico

El objetivo de realizar estos ensayos es definir la capacidad de las cepas para resistir
entornos químicos adversos. Esto último no está solamente asociado a las propiedades
tecnológicas de las cepas, hay estudios que demuestran que una etapa de estrés previo o durante
el cultivo de bacterias permite que los microorganismos resistan de mejor forma etapas
posteriores de concentración, secado, etc.

Prasad et at (2003) encontraron que una etapa de estrés para una cepa de Lactobacillus
rhamnosus era capaz de mejorar la resistencia a una posterior etapa de secado. Estos autores
utilizaron una etapa de pre-estrés térmico ó de estrés salino (con NaCl), dando mejores resultados
el estrés salino. En el caso del estrés térmico, encontraron una mejor respuesta cuando el
microorganismo fue estresado en la etapa estacionaria de crecimiento, en comparación con el
estrés efectuado en la etapa de crecimiento exponencial. Estos autores asocian las etapas de pre-
estrés a una serie de modificaciones de procesos enzimáticos regulados por el genoma del
microorganismo y cuantificados en su trabajo. Es por ello que resultará de vital importancia
conocer las propiedades tecnológicas de las cepas modificadas por una etapa de estrés previo.
Esta alternativa resulta totalmente factible, pues los resultados obtenidos muestran que ambas
cepas (32 y 87) son capaces de resistir altas concentraciones de NaCl y concentración de ácido
clorhídrico. Sin embargo, estos estudios serán efectuados si no se obtienen los resultados que se
esperan con las cepas originales, debido principalmente a que, como ya se ha mencionado, las
bacterias sufren modificaciones internas y externas, que las hacen alejarse aún más de la cepa
autóctona aislada originalmente.

Kets et al. (1995) encontraron que cepas de Lactobacillus spp y una cepa de Enterococcus
faecium fueron capaces de crecer en medios complejos (semejantes a MRS) en presencia de
NaCl. Luego los autores identifican que las cepas que fueron cultivadas en presencia de sal
soportaron de mejor forma una posterior etapa de secado, por su capacidad de acumular betaína.
Lo que los autores encontraron también es que de las cepas que ellos estudiaron encontraron una
(Lactobacillus bulgaricus) con una muy baja resistencia a la sal en comparación a las demás.
Justamente esta cepa no fue capaz de acumular solutos como betaína y carnitina en la etapa de
cultivo, en ausencia y en presencia de distintas concentraciones de sal. En conclusión, existe una
correlación entre las propiedades de membrana de los microorganismos, que le permiten
acumular solutos compatibles para posteriores aplicaciones tecnológicas, y su resistencia al NaCl
o una potencial etapa de estrés con esta sustancia.

Hay que recordar además que NaCl es una sustancia que se encuentra en diferentes
concentraciones para los distintos cuerpos de agua en los que son cultivados los salmónidos. En
el caso de trucha arcoíris como la producción se realiza en agua dulce, la concentración de esta
sal es baja, mientras que en la producción de salmón, hay una etapa prolongada del proceso de
cultivo de los peces que se efectúa en agua salada. El agua de mar posee una concentración
mayor que 3% (algo superior que 0,5molar).

Las siguientes Figuras muestran las cinéticas de cultivo de las cepas en estudio frente a la
presencia de NaCl (0,5 y 1molar) y la presencia de HCl (pH = 4,5). El pH del ácido utilizado
corresponde al pH medio que posee el estómago de los peces, medido experimentalmente en los
ensayos efectuados en el proyecto.
Figura 24. Densidad óptica (540 nm) en función del tiempo, para resistencia a NaCl y HCl por la cepa 32

Figura 25. pH en función del tiempo, para resistencia a NaCl y a HCl por la cepa 32
 Figura 26. Viabilidad en función del tiempo, para resistencia de NaCl y a HCl por la cepa 32.

En las Figuras anteriores se observa que una concentración de 0,5molar de NaCl ó HCl no
afecta el crecimiento de la cepa 32, expresado como producción de biomasa (densidad óptica),
descenso de pH y viabilidad en placas. Es importante resaltar además que esta concentración de
sal no afecta la viabilidad final obtenida en la biomasa. Otro aspecto importante de estos
resultados es que el efecto provocado por HCl es muy semejante al provocado por NaCl
0,5molar, sin embargo, a la luz de lo obtenido por otros autores (Kets 1995, Prasad 2003) es
probable que la respuesta interna de los microorganismos como sus propiedades de membrana,
permeabilidad, expresión de genes, etc., sea distinto en ambos tipos de condiciones de estrés. Lo
que sí está claro es que el efecto que debería provocar un aumento en la concentración de NaCl
sobre los microorganismos sería un aumento en su resistencia frente a condiciones adversas,
como puede ser una etapa de secado o una etapa de concentración. Futuros experimentos
asociados a esto último tenderán a dilucidar el efecto provocado por una etapa de estrés sobre el
microorganismo en cuanto a su capacidad de resistir operaciones de secado y otras condiciones
adversas, tanto de proceso como de aplicación final del producto. Otro aspecto importante es
verificar las propiedades probióticas de la cepa estresada, si se mantienen o son modificadas con
respecto a la cepa no estresada.
 De las Figuras anteriores se desprende también que para una concentración de NaCl de
1molar la cepa ve reprimido su crecimiento y su viabilidad, pero no se desactiva. La importancia
de este resultado radica en que esta concentración de NaCl se encuentra por sobre la
concentración de los cuerpos de agua potenciales donde el microorganismo debe ejercer su
efecto. Esta misma conclusión es aplicable para el estrés por pH, la cepa no se desactiva por pH,
sólo ve reprimido su crecimiento, pero el resultado final es casi idéntico que para la cepa no
estresada y que para la cepa estresada con NaCl 0,5molar.
Resultados semejantes fueron obtenidos con la cepa 87. Las Figuras se muestran a continuación.

Figura 27. Densidad óptica (540 nm) en función del tiempo, para resistencia a NaCl y HCl por la cepa 87
 Figura 28. pH en función del tiempo, para resistencia a NaCl y a HCl por la cepa 87

Figura 29. Viabilidad en función del tiempo, para resistencia de NaCl y a HCl por la cepa 87
 De todos los resultados aquí mostrados es posible concluir que ambas cepas poseen alta
resistencia a NaCl y resistencia a HCl. Los resultados anteriores nos permitirán efectuar futuros
ensayos de crecimiento, secado y estudios de propiedades probióticas y tecnológicas con cepas
estresadas por NaCl.

Estrés térmico

Debido a que la literatura muestra que también es posible efectuar una etapa de estrés
térmico de cepas de microorganismos con el fin de aumentar su capacidad de resistir entornos
adversos, se hicieron estudios de crecimiento de cepas estresadas por temperatura. La selección
de la temperatura y del tiempo debería ser tal que permitiera que luego del tratamiento existieran
microorganismos viables y que además realmente haya un efecto sobre los microorganismos.
Sobre los resultados encontrados de resistencia térmica de los microorganismos se decidió por
efectuar un tratamiento de 30 minutos a 55ºC a las bacterias correspondientes a la etapa de
activación que sirve de inóculo de la bioreacción (bacterias en fase estacionaria).

Figura 30. Curvas de crecimiento (DO a 540 nm) para las cepas probióticas sometidas a estrés térmico.
 Figura 31. Descenso de pH en función del tiempo para las cepas probióticas sometidas a
estrés térmico.

Figura 32. Viabilidad de la cepa probiótica 32 en función del tiempo sometida a estrés térmico.
 Figura 33. Viabilidad de la cepa probiótica 87 en función del tiempo sometida a estrés térmico.

De las Figuras aquí mostradas se puede concluir que es posible cultivar microorganismos
estresados térmicamente sin aumentar el tiempo de producción. Esto queda en evidencia al
observar las curvas de viabilidad de ambas cepas, comparadas con el control (no estresada). Otro
aspecto importante en resaltar es que ambas cepas mostraron un leve descenso en su dinámica de
crecimiento por el efecto de golpe térmico, pero fue más notorio en la cepa 87. Esto concuerda
con los parámetros de destrucción térmica de los microorganismos, que indicaban que la cepa 32
es levemente más resistente que la cepa 87 a la temperatura ensayada. Al igual que en el caso de
estrés químico, estos resultados indican que es posible cultivar microorganismos estresados por
temperatura, para evaluar sus futuras propiedades probióticas y tecnológicas.
Sin embargo se vuelve a recalcar lo que ya se mencionó: el objetivo de este estudio
siempre ha sido intentar mantener las propiedades de la cepa indígena, por lo que este tipo de
recursos serán utilizados en la medida de los requerimientos del proyecto. La literatura hace
mucho hincapié en cuanto a la modificación en la expresión de genes, cambios en las propiedades
de membrana, etc., que de alguna forma pueden incidir sobre las propiedades probióticas y la
respuesta final de los productos desarrollados. El fin último siempre ha sido desarrollar procesos
que minimicen las posibles modificaciones (genéticas, fisiológicas, etc.) sobre los productos,
pues la génesis de los productos está en un microorganismo naturalmente inocuo y benéfico.

Crecimiento de la cepa 34 en medios comerciales y en medio permeado de lactosuero. Pruebas

de estrés químico de esta nueva cepa.

Debido a la necesidad de contar con un grupo más amplio de cepas probióticas, se ha

decidido trabajar con una nueva cepa del lactobacilo denominada 34. El grupo de microbiología
ha efectuado y continúa efectuando ensayos con este microorganismo para determinar
verdaderamente sus potencialidades como probiótico. Se han efectuado cinéticas de crecimiento
de esta cepa, para determinar si es posible cultivarla para propósitos comerciales. La importancia
de la etapa de cultivo radica en que por lo menos entre el 30-50% de los costos de producción de
un bioproceso dependen fuertemente de la etapa de bioreacción, de los costos asociados a la
formulación de los medios de cultivo (Atkinson (1991), Shuler (2002), Chang y cols.(2000)). Es
por ello que futuros trabajos también tenderán a la formulación de productos para uso animal
desde sustratos provenientes de la industria agro-alimentaria, que sean de bajo costo, más bajo
que el actualmente obtenido.

Figura 34. Viabilidad de la cepa 34 en función del tiempo, crecida en medio comercial MRS y en medio en base a
permeado de lactosuero(experimento en duplicado).
 Figura 35. Evolución del pH de la cepa 34 en función del tiempo, crecida en medio comercial MRS y en medio en
base a permeado de lactosuero(experimento en duplicado).

Figura 36. Turbidez de la cepa 34 en función del tiempo (DO a 540 nm), crecida en medio comercial MRS
(experimento en duplicado).

A la luz de los resultados es posible observar que esta cepa de lactobacilo crece
adecuadamente tanto en medio comercial como en medio en base a permeado de lactosuero, tal
como ocurrió con las cepas 32 y 87. Con lo aquí obtenido más los resultados proporcionados por
el grupo de Microbiología, será posible cultivar este microorganismo para desarrollo de
productos probióticos para trucha arcoiris en un medio de cultivo técnica y económicamente
factible.
Estudios de resistencia a estrés químico (NaCl y HCl) de esta cepa indican, al igual que
las cepas 32 y 87, que este microorganismo posee potenciales propiedades tecnológicas. La
tendencia que se puede apreciar en las siguientes figuras es la misma que la que se obtuvo para
las otras cepas probióticas: un aumento en la concentración de NaCl hasta un 1molar no inhibe el
crecimiento del microorganismo, sólo produce un retardo en su dinámica de crecimiento.
Similares resultados fueron obtenidos por Melo (2005), para cepas de lactobacilos probióticas de
origen vaginal estresadas con NaCl (en el marco de proyecto Fondef D01 I1121).

Figura 37. DO (540 nm) en función del tiempo, para resistencia a NaCl y HCl por la cepa 34
Figura 38. pH en función del tiempo, para resistencia a NaCl y a HCl por la cepa 34 (el índice P indica “medio
permeado de lactosuero sin químicos”)

Figura 39. Viabilidad en función del tiempo, para resistencia de NaCl y a HCl por la cepa 34 (el índice P indica
“medio permeado de lactosuero sin químicos”)
Formulación de alimento probiótico

Tomando como materia prima alimento fresco formulado por Frionatur (35-40% humedad),
ha sido posible desarrollar pellets para trucha arcoiris de distinto tamaño. Para ello se ha
implementado un molino artesanal. El molino puede operar distribuidores de distinto diámetro,
que forman los pellets (entre 2-4mm). Para el caso de pellets de 2mm de diámetro fue necesaria
la construcción en maestranza de un dispositivo de dosificación, pues los comercialmente
existentes son de 3-4mm. Otro aspecto importante es que el alimento fresco posee una alta carga
bacteriana microbiológica, expresada por el crecimiento en placas no selectivas (LAPTg,
Tripticasa), crecimiento de bacterias Gram-negativas (R2-A) y crecimiento de bacterias lácticas
y/o lactobacilos (MRS, LBS). Como el producto a formular debe ser repetible para cada lote de
producción y además existe un bioensayo a realizar con el alimento, se implementó también un
sistema de pasteurización del producto (65ºC, 30min.), el cual asegura que se ha eliminado toda
la flora microbiana que traía originalmente el alimento, sin éste sufra daños en sus propiedades
nutricionales. A partir de la literatura es posible encontrar los distintos parámetros de destrucción
térmica de los microorganismos presentes en el pescado. Se utilizó esta información debido a que
el alimento que formula la empresa es a partir de una serie de materiales provenientes de la
industria pesquera, más otros materiales de origen vegetal. En la siguiente tabla se pueden
observar parámetros de destrucción térmica de microorganismos asociados a materias primas y
productos de pesquería. Se observan además parámetros de resistencia a pH, actividad de agua,
NaCl.
Tabla 5. Parámetros de resistencia térmica y osmótica de microorganismos asociados a materias primas y productos
de pesquería.
(Microorganisms in Foods, Vol. 1, 1974)
Temperatura
Resistencia
NaCl (%)
Microorganismo Mínima Óptima pH mínimo aw mínimo Térmica
máximo
(D(TºC), min.)
C.botulinum tipo D121(esporas)
10 35 4,0-4,6 0,94 10
proteolótico A, B, F 0,1-0,25
D82,2 0,15-2
(caldo) D80
C.botulinum tipo no
3,3 30 5,0 0,97 3-5 4,5-10,5
proteolótico B, E, F
(producto alta prot.-
grasa)

Vibrio sp. 5-8 37 5,0 D71 0,3

D55
Vibrio Cholerae 5 37 6,0 0,97 <8
0,24
60ºC por 5 min
Vibrio parahaemolyticus 5 37 4,8 0,93 8-10 reducción de 7
log(10)
Vibrio vulnificus 8 37 5,0 0,94 5

Aeromonas sp. 0-4 20-35 4,0 4-5 D55 0,17

60ºC 30min no hay

Plesiomonas sp. 8 37 4,0 4-5
sobrevivencia
D60
Listeria monocytogenes 1 30-37 5,0 0,92 10
1,95-4,48

Salmonella 5 37 4,0 0,94 4-5 D60 0,2-6,5

Shigella 7-10 37 5,5 4-5 60ºC 5 min

D60
0,1
E.coli 5-7 37 4,4 0,95 6
D55
5
D60
Staphylococcus aureus 7 37 4,0 0,83 10-15
0,43-7,9
Staphylococcus aureus
15 40-45 5,0 0,86 10 toxina muy estable
(productor de toxina)

De los datos aquí observados se puede apreciar que existe una amplia gama de resistencias
térmicas de distintos microorganismos, expresadas por el parámetro “D (TºC)” (2,3/k), que representa el
tiempo necesario para reducir 1 ciclo logarítmico del microorganismo a la temperatura TºC. Un caso
especial corresponde al C.Botulinum, microorganismo altamente resistente a temperatura en su forma
esporulada. Sin embargo, sobre los parámetros de destrucción de los demás microorganismos mostrados
en esta tabla se optó por utilizar un proceso de pasteurización a 65ºC por 30 minutos. La probabilidad de
que existan otros microorganismos presentes en el alimento que resistan este tratamiento térmico es
prácticamente nula, porque las materias primas utilizadas en la formulación de este son todas muy frescas.
Ensayos de cuantificación de crecimiento microbiano en los distintos tipos de agares mencionados
muestran que el alimento luego de la etapa de pasteurización no presenta colonias viables. Con este
resultado se reafirma el hecho de que el proceso térmico destruyó la flora microbiana presente en él. Por
otra parte, la selección de la temperatura y el tiempo aseguran la mínima destrucción de componentes
nutricionales valiosos en el producto.
Todos los dispositivos tanto para la etapa de pasteurización como de formación de los pellets son
esterilizables. Finalmente, un sistema de dosificación por atomización de la biomasa ha sido también
implementado para la correcta distribución del probiótico en el alimento. Para mayores detalles en cuanto
a este nuevo procedimiento, se puede en el APÉNDICE.
En cuanto a la formulación de alimentos para salmónidos y animales acuáticos, la literatura señala
una serie de componentes, que dependen fuertemente de la ubicación geográfica de la planta. Sin
embargo, independiente del producto formulado, ellos siempre cuentan con proteínas, hidratos de carbono,
grasas, sales minerales, vitaminas, todos estos componentes provenientes de fuentes animales y/o
vegetales. Es importante resaltar que para los formulados utilizados en plantas de proceso existe escasa
información lo que se atribuye a que la composición e ingredientes que presenta cada formulado forma
parte del “know-how” de las empresas, pues todas las plantas cuentan con equipamiento muy similar,
consistentes principalmente en equipos de mezcla, extrusión y/o pelletización (Muñoz L. Osvaldo, 2004).
Otro aspecto muy importante que debe ser resaltado en cuanto a la formulación de alimentos para
salmónidos es que la comunidad científica hace ya más de 1 década ha puesto una voz de alerta sobre el
uso excesivo de la harina de pescado como ingrediente principal este tipo de productos. Actualmente y
desde hace algunos años se realizan muchos esfuerzos para encontrar fuentes proteicas que compitan con
la harina de pescado tanto técnica como económicamente (Alvarado H., 1995; Muñoz L. Osvaldo, 2004).
Hernández (1987) reporta que existen en Chile 2 tipos de preparados para salmóinidos: los
húmedos y los secos. Este autor menciona que un producto seco se obtiene por mezcla y
extrusión/pelletización de ingredientes secos como harina de pescado, harina de carne y hueso, aceite de
pescado, melaza, harinas vegetales, premezclas de vitaminas, minerales y carotenos naturales y artificiales
para darle el color salmón a la carne. Las dietas húmedas (como es nuestro caso) se obtienen mezclando
40-50% de pescado fresco o subproductos de matadero molidos con un 50-60% de ingredientes secos, los
que básicamente son los mismos usados en la dieta seca
 Tabla 6. Comparación de fórmulas, extruidas y pelletizadas para camarones
(Muñoz L. Osvaldo, 2004)

Tabla 7. Ventajas y desventajas entre alimentos secos y húmedos (Hernández, 1987)

Alimento Seco
Ventajas Desventajas
Deterioro lento del alimento Inversión alta en equipos
Menor palatibilidad que el alimento húmedo en
Fácil manejo condiciones de crianza en agua de mar
Almacenaje y transporte simple y barato
Alimento Húmedo
Ventajas Desventajas
Elaboración simple Necesidad de almacenaje en frío
Transporte caro (mayor volumen por alto
Infraestructura relativamente simple y menor costo contenido de agua)
Buenas tasas de crecimiento Pérdida rápida de las vitaminas
Contiene la mayoría de las vitaminas en niveles
adecuados, por formularse con elementos frescos y
ser el proceso de fabricación a baja temperatura Rápida descomposición a temperatura ambiente

Además de los requerimientos nutricionales, un alimento para salmónidos debe cumplir

una serie de otros requisitos para que pueda ser ingerido por el pez, para que no provoque
problemas de ninguna especie durante la digestión, y que genere ciertas características deseadas.
Los requerimientos más importantes que deben cumplir las dietas de salmónidos dicen relación
con las propiedades físicas (flotabilidad y dureza del pellet, adherencia de los componentes) y
organolépticas (sabor, olor y color, palatabilidad).
Ensayos de secado preliminares de alimento para trucha

Como ya se mencionó anteriormente, el alimento formulado por Frionatur es fresco, por lo

que posee un porcentaje de humedad que no permite que éste sea almacenable en el tiempo. Un
producto comercial almacenable en el tiempo contiene una humedad cercana o inferior al 10%,
con lo que se asegura una vida útil prolongada del producto y la reducción de la actividad
microbiana y biológica de éste (Treybal (1980), Bórquez (1995)).
Los resultados aquí mostrados indican que es posible deshidratar alimento en un sistema en lecho
fluidizado (40ºC) como el implementado en el Departamento de Ingeniería Química. Este equipo
es un prototipo de laboratorio que permite trabajar con aire estéril, para el secado de bioproductos
que no pueden sufrir contaminación ambiental. El sistema cuenta con un ventilador, esterilizador
de luz UV para el agente secante, intercambiador de calor para control de temperatura de bulbo
húmedo, sensores de presión y temperaturas de bulbo seco y húmedo en distintos puntos del
proceso.

Figura 40. Pérdida de humedad para secado de pellet sin y con tratamiento térmico
(secador el lecho fluidizado, 40ºC, producto 4mm diámetro).
Figura 41. Flujo de agua evaporada para secado de pellet con y sin tratamiento térmico
(secador el lecho fluidizado, 40ºC, producto 4mm diámetro).

Figura 42. Pérdida de humedad para secado de pellet con tratamiento térmico
(secador el lecho fluidizado, 40ºC, producto 2mm diámetro).
 Figura 43. Flujo de agua evaporada para secado de pellet con tratamiento térmico
(secador el lecho fluidizado, 40ºC, producto 2mm diámetro).

En las Figuras anteriores se aprecia que para el producto de 2mm de diámetro como de
4mm de diámetro se obtienen un producto con una humedad inferior al 10% en menos de 40
minutos. Sin embargo, el efecto provocado por la disminución en el diámetro de los pellets es
notable, pues en este caso se alcanza una humedad inferior al 10% en menos de 30 minutos,
mientras que para el producto de 4mm de diámetro se alcanza el mismo porcentaje de humedad
después de 40 minutos. Este resultado concuerda con lo esperado y se relaciona directamente con
el área de transferencia de calor y materia (Treybal (1980), Incropera (1996)). Este resultado
concuerda también con resultados previos obtenidos por Melo (2005), quien secó una cepa
probiótica vaginal microencapsuladas en esferas de alginato de sodio en el mismo secador en
lecho fluidizado utilizado en este trabajo. Melo encontró que al disminuir el diámetro de las
perlas de alginato aumentaba la velocidad de secado de estas. Este autor utilizó las mismas
condiciones experimentales utilizadas en este trabajo y obtuvo bacterias probióticas
deshidratadas, con una muy baja pérdida de viabilidad. Actualmente se está trabajando en la
formulación de alimento con biomasa probiótica para su utilización en bioensayos. Este trabajo
se encuentra enmarcado dentro de Memoria de Título en Ingeniería Química de la alumna Natalia
Toledo.
 Como ya se mencionó en párrafos anteriores, los productos alimenticios utilizados en
salmónidos se pueden formular húmedos o secos. Es por este motivo que no se ha encontrado
literatura relacionada con la deshidratación de alimentos de este tipo. Los alimentos
deshidratados no son otra cosa que una mezcla de materias primas ya deshidratadas. Sin
embargo, una tecnología como la aquí utilizada no sólo permitirá obtener un bioproducto con
bacterias probióticas viables, sino que asegurará la retención sustancial de factores nutricionales
al trabajar a bajas temperaturas (la operación de secado ocurre a 40ºC). Actualmente se trabaja
también en la deshidratación de alimento probiótico en secador a vacío. Algunos problemas
operacionales y fallos de esta unidad no permitieron efectuar estudios previos en ella antes de la
confección de este informe.
Debido a que actualmente se utiliza como materia prima para la formulación del alimento
probiótico un producto fresco, futuros trabajos tenderán a desarrollar procesos para la obtención
de productos alimenticios probióticos para salmónidos desde mezclas de materias primas secas,
esto último debido a que las grandes plantas procesadoras de alimentos para salmónidos formulan
productos secos. Sin embargo, la alternativa actualmente utilizada no deja de ser atractiva por los
aspectos ya mencionados.

Secado de alimento fresco con biomasa probiótica LPT32. Almacenamiento de producto fresco
y deshidratado.

Debido a que el primer ensayo experimental con trucha arcoíris se efectuó con la cepa
LPT32 en forma de un preparado fresco, se decidió continuar ensayando esta cepa pero alimento
fresco, pasteurizado, reconstituido y con esta cepa probiótica. La siguiente Figura muestra la
viabilidad de la cepa LPT32 en el alimento, almacenada a 4ºC:
 1,E+10

1,E+09

1,E+08
ufc/g

1,E+07

1,E+06

1,E+05
0 4 8 12 16 20 24 28 32
tiempo (días)

Figura 44. Viabilidad del microorganismo LPT32 almacenado a 4ºC en alimento fresco y biomasa fresca.

Como se puede observar en esta Figura, el producto mantiene su viabilidad luego de 32

días de efectuado el procedimiento de elaboración de alimento probiótico. Sin embargo, el
alimento fresco comienza a producir aromas luego de 30 días de almacenado, debido
fundamentalmente a que al estar fresco contiene todavía un alto porcentaje de humedad (cercano
al 40%), lo que permite que la actividad biológica (preferentemente del microorganismo
probiótico) no cese. La actividad de agua resulta ser un factor importante para el desarrollo de
microorganismos y para la expresión de actividad biológica (Bórquez, 1995; Junge, 1989; Shuler,
2002). Es por ello que resulta de especial interés estudiar una forma de almacenaje deshidratado,
que asegure la calidad del alimento y la viabilidad del lactobacilo probiótico en el tiempo. Hay
que recordar que con la etapa de pasteurización la actividad biológica del alimento se ve reducida
drásticamente, expresada como la no presencia colonias viables en placas agarizadas enriquecidas
(Tripticasa, R2A, LAPTg, MRS, LBS), es por ello muy probable que la modificación del
alimento esté siendo producida por la cepa LPT32.
Luego de analizar la eficiencia del sistema de pasteurización, de homogenización y de
formación de pellet de 2 y 4mm de diámetro, se procedió a la deshidratación del alimento fresco.
Para ello se efectuaron experimentos en secador a vacío rotatorio con resistencias eléctricas,
control de rpm y control de temperatura, además de secador en lecho fluidizado con aire estéril,
válvula para control de flujo y controlador de temperatura.
Figura 45. Secado de alimento de 2mm en lecho fluidizado (aire, 40ºC), conteniendo biomasa probiótica LPT32.

Figura 46. Secado de alimento de 2mm en secador a vacío (60ºC, 10mm Hg), conteniendo biomasa probiótica
LPT32.
Figura 47. Comparación de tecnologías de secado de alimento, conteniendo biomasa probiótica LPT32 para pellet
de 2mm.

De las Figuras es posible observar que en tiempos próximos a 60 minutos se logra un

producto con menos de un 10% de humedad y además se alcanza una retención del 100% de la
viabilidad, tanto para secado en lecho fluidizado como para secado a vacío. Estos resultados son
muy alentadores y contrastan con algunos obtenidos por otros autores. Por ejemplo, Bayrock e W.
M. Ingledew (1998) secaron levaduras, perdiendo un alto porcentaje de viabilidad por debajo de
una humedad del 10%. Los autores concluyen que es el mecanismo de deshidratación uno de los
más importantes y que explica la pérdida de viabilidad de los microorganismos. Pese a que las
levaduras son en general más resistentes a condiciones adversas que las bacterias lácticas, en este
trabajo realizado con una cepa de Lactobacillus spp.(LPT32) se obtuvo un producto sin pérdida
de viabilidad. Ross (2001) alcanzó una retención de viabilidad del 25-30% para una cepa de L.
Paracasei probiótico estresado con sal y con temperatura y posteriormente secado en spray. Este
autor encontró que las cepas estresadas alcanzaban una resistencia muy superior a la etapa de
secado que las células no estresadas, además de un aumento considerable también a la resistencia
a la temperatura, atribuyendo esta respuesta principalmente a la “reprogramación metabólica”
que permite alcanzar un estado celular de mayor resistencia al entorno adverso. Este mismo autor
en otra publicación (2000) muestra curvas de secado y de retención de viabilidad para 2 cepas de
Lactobacillus spp. probióticas. Por debajo de un 5% de humedad, la retención de viabilidad fue
cercana a un 60% para la cepa L. Paracasei y de un 6% para la cepa L.salivarius, resultando
también esta última cepa ser más sensible al estrés térmico. Los resultados obtenidos tampoco
son concordantes con los informados en las revisiones en extenso efecuadas por Lienevse y Van
Riet (1992). Estos últimos autores no muestran una “receta universal” ni un procedimiento
específico para cada microorganismo ni para cada operación, pero sí deja muy en claro que con
técnicas convencionales de secado como spray, granulación-spray y lecho fluidizado es complejo
alcanzar un 100% de retención de viabilidad de los microorganismos. Los autores sí hacen
alusión al hecho de que al utilizar estas técnicas es posible obtener productos a bajo costo. Otros
autores que también mencionan que cada microorganismo debe ser estudiado individualmente y
sólo existen “recomendaciones generales para secar microorganismos” son Texeira et al. (2004).
En el review de Texeira se discute en extenso la producción de bacterias ácido lácticas por
liofilización. Esta tecnología está restringida al desarrollo de productos de alto valor agregado. En
cuanto a los mecanismos involucrados en la inactivación de microorganismos, al igual que
Bayrock e W. M. Ingledew (1998), Lievense y Van Riet (1992) mencionan la temperatura, la
dehumidificación y el rol que pueden jugar algunos agentes osmoreguladores y protectores para
evitar pérdidas de viabilidad y daño celular.
Selmer-Olsen (1999) reporta tiempos de secado entre 3 y 6 h para perlas de alginato,
utilizando un secador en lecho fluidizado a una temperatura de 5ºC y una humedad relativa
controlada de 55%. Estos autores secaron también en placas petri, a 30ºC y 20% de humedad
relativa. Para el caso del secado en lecho fluidizado, los autores siempre encontraron pérdida de
viabilidad de los microorganismos deshidratados (entre el 90 y el 50%). Esta pérdida de
viabilidad dependió del agente osmoregulador utilizado (adonitol, botaina, glicerol y sólidos
lácteos no grasos). Estos resultados son semejantes a los obtenidos en este trabajo, aunque los
tiempos de secado utilizados por estos autores son muy prolongados, debido fuertemente a la baja
temperatura utilizada. Si bien es atractivo utilizar bajas temperaturas para deshidratar
microorganismos, no resulta económicamente viable, más aún si se trata de temperaturas
inferiores a la ambiental (para lograr un aire a 5ºC se requiere de sistemas de generación de frío,
equipos adiabáticos y otros insumos de alto costo). Los autores también encontraron una alta
pérdida de viabilidad y de actividad de enzima lactato-deshidrogenasa, tanto para la etapa de
secado a 30ºC (placas petri) como en etapas posteriores de almacenamiento. Sin embargo, lo que
encuentran los autores es una marcada pérdida de viabilidad para una cepa de Lactobacillus
helveticus, por debajo de un 25% de humedad (base húmeda), independiente del agente
osmoregulador utilizado, la cual puede ser atribuida principalmente a la dehumidificación como
mecanismo de desactivación. Este fenómeno no ocurrió con la cepa LPT32, que mantiene su
viabilidad incluso por debajo de 5% de humedad. Otro aspecto importante a destacar es que la
pérdida de actividad de enzima efectuada por estos autores no es comparable con los
experimentos en lecho fluidizado, pues las bacterias para este caso fueron deshidratadas en placas
petri, donde los mecanismos que gobiernan el fenómeno de secado son diferentes que para el
caso de un sistema fluidizado.
Gardner y Champagne (2001) deshidrataron una cepa de Streptococcus thermophilus
microencapsulada en perlas de alginato, mediante el uso de aire y liofilización. Para el caso de la
bacteria secada con aire, utilizaron una cámara de flujo laminar (24ºC, 16h), manteniendo las
perlas sobre un papel filtro estéril. Lo interesante de este trabajo es que los autores encontraron
una alta tasa de viabilidad, inclusive más alta que la obtenida por liofilización, al secar la bacteria
con aire. Sin embargo, a diferencia de este trabajo, las velocidades de secado reportadas por estos
autores son del orden de horas (mínimo 4 horas en el mejor de los casos), mientras que en este
estudio se ha logrado una alta tasa de retención de viabilidad a 40-60ºC en un tiempo menor a 60
minutos, mediante una operación unitaria escalable con fines productivos y no en cámaras
laminares ni en placas petri.
Lievense y van’t Riet (1992) hacen referencia también a la inactivación de una cepa de L.
plantarum en un secador en lecho fluidizado, mediante destrucción térmica y por efecto del
proceso mismo de remoción de humedad. Es en este proceso de remoción de humedad cuando los
agentes protectores juegan un rol protagónico. Es por ello que una adecuada selección de estos
permite minimizar el deterioro o pérdida de viabilidad en productos con actividad biológica. Hay
que destacar que aunque es posible utilizar una mezcla osmoprotectora, la evaluación final de
costos avalará su uso para la formulación de alimento para trucha arcoíris. La incorporación de
azúcares, aminoácidos y metabolitos como adonitol, inositol, entre otros, debe ser correctamente
justificado al momento de escalar el proceso para obtener un producto un precio de mercado
competitivo.
Otros aspectos que son reportados y que pueden incidir en la viabilidad de un
microorganismo deshidratado son, según Lievense y Van Riet (1992):
.- La especie bacteriana a secar. Ya ha quedado de manifiesto en este trabajo que cada cepa,
inclusive dentro del mismo genero Lactobacillus, poseen propiedades de resistencia térmica
diferentes. Las diferencias son aún más notorias entre diferentes especies de microorganismos.
Uno de los microorganismos que mas ha sido deshidratado y del cual existen muchos reportes
son las levaduras, ya sea para uso panario o para otros fines.
.- Las condiciones de cultivo del microorganismo.
.- La presencia de aditivos protectores. Si bien durante esta investigación no se han utilizado
agentes protectores para la etapa de secado, se debe continuar investigando esta alternativa,
especialmente si se considera la formulación de preparados altamente estables en el tiempo. Los
mecanismos mediante los cuales actúan los protectores pueden ser reemplazando las moléculas
de agua removidas y así no dañar las estructuras, actuar como sustancias osmoreguladoras, o bien
generar una matriz que proteja a los microorganismos frente a las condiciones de secado.
.- Otras variables que pueden incidir en la viabilidad final de un microorganismo deshidratado
son la concentración celular, el pH, el agente secante, la velocidad y el tiempo de secado. En
general el uso de otros agentes secantes que no sean aire, para el caso de secado convectivo,
queda restringido para uso de laboratorio.
Con lo hasta aquí expuesto, se concluye que la cepa LPT32 posee muy buenas
propiedades tecnológicas, puesto que resiste de muy buena forma todas las operaciones unitarias
tendientes a la formulación de un producto deshidratado y estable. Según lo revisado, el factor
microorganismo y los factores asociados al proceso (condiciones de estrés, etapa de activación,
etapa de fermentación, uso de protectores y osmoreguladores, entre otros) son los que
condicionan el éxito de la obtención de un producto para uso en trucha arcoíris estable, altamente
deshidratado y con una alta tasa de retención de viabilidad probiótica.
En cuanto a las diferencias presentadas en las cinéticas de secado para lecho fluidizado y
para secado a vacío, estas se deben fundamentalmente a que los mecanismos de secado son
diferentes en ambos casos, primando la convección en el caso de la fluidización y la conducción-
radiación en el caso del secado a vacío (Incropera, 1996; Treybal, 1980). De acuerdo a la Figura
24, ninguna de las operaciones de secado presenta un claro período de secado constante, a
excepción de lecho fluidizado los primeros 10 minutos. Esto permite afirmar que la etapa
controlante durante el secado se encuentre en el producto mismo y no en su entorno.
Ensayos realizados con alimento probiótico pero para alimento de 4mm muestran
tendencias semejantes a las obtenidas para secado de alimento de 2mm (ver Fig. 48, 49 y 50). A
diferencia de los pellets de 2mm, para el caso del pellet de 4mm la diferencias obtenidas entre
secado a vacío y fluidizado son casi nulas, debido fundamentalmente al tamaño del alimento. Al
aumentar de tamaño, se hacen más notorios los mecanismos de secado asociados al producto,
siendo este fenómeno independiente del tipo de secador. El tamaño y la geometría de un producto
a secar condicionan su velocidad de sedimentación, coeficientes de transporte, velocidad de
secado en período decreciente, etc. (Treybal, 1980). A pesar de que la cinética de secado es más
lenta para el alimento más grande, se alcanza una humedad cercana a un 5% luego de 60minutos
de secado y se retiene un 100% de viabilidad a lo largo del proceso. Otro aspecto importante a
resaltar aquí es que el área de secado sólo puede ser estimada, debido a que el producto es una
matriz porosa y además que este va modificando su tamaño a medida que el proceso avanza.

Figura 48. Secado de alimento de 4mm en lecho fluidizado (aire, 40ºC), conteniendo biomasa probiótica LPT32.
 Figura 49. Secado de alimento de 4mm en secador a vacío (60ºC, 10mm Hg), conteniendo biomasa probiótica
LPT32.

Figura 50. Comparación de tecnologías de secado de alimento, conteniendo biomasa probiótica LPT32 para pellet
de 4mm.
Figura 51. Comparación de tecnologías de secado de alimento, conteniendo biomasa probiótica LPT32 para pellet
de 4mm.

La Figura 51 sólo permite comparar de mejor forma los 2 tipos de secado utilizado y los 2
tamaños de producto, reafirmando lo ya explicado anteriormente. En las curvas de humedad se
observa claramente el efecto del tamaño del alimento, siendo siempre el secado más rápido para
2mm de diámetro. El aspecto más importante que hay que volver a resaltar es el hecho de que en
todas las operaciones efectuadas los microorganismos retuvieron su viabilidad. Una futura etapa
de escalamiento de estos procesos quedará avalada por la tecnología que resulte más atractiva
económicamente.
 Figura 52. Almacenamiento de producto deshidratado en función del tiempo (4ºC, 25ºC)

Como se puede observar, el producto almacenado a 4ºC resiste de excelente forma el

almacenamiento, no siendo así a 25ºC. Este resultado ya había sido previamiente obtenido para
cepas de origen vaginal (Fondef D01 I1121). Ross et al. (2000) presenta también curvas
semejantes de almacenamiento para cepas de Lactobacillus spp probióticos, siendo 4ºC la
temperatura con la que se retiene de mejor forma la viabilidad del producto deshidratado. Este
resultado motiva a efectuar nuevos estudios de almacenamiento de producto deshidratado a vacío,
producto obtenido desde biomasa estresada e incorporando agentes protectores que no encarezcan
el producto y que permitan una mayor vida media del producto en el tiempo (estos estudios se
efectúan actualmente). Otros estudios a realizar serán utilizar atmósferas de almacenamiento
especiales, vacío y envases especiales que permitan almacenamiento a mayores temperaturas sin
encarecen en exceso el producto
Estos resultados demuestran que almacenar el producto probiótico genera un costo
asociado a un sistema de refrigeración para mantener una temperatura baja. Sería interesante
modificar en algún punto el procedimiento que se ha llevado a cabo hasta el momento para
formular el alimento con la cepa probiótica, de tal forma de optimizar la viabilidad del producto
almacenado a las dos temperaturas aquí estudiadas. Es claro que esto depende única y
exclusivamente de la etapa de activación y cultivo de la cepa probiótica. Por tal motivo, se
analizaron dos alternativas:
 1. Cosechar la biomasa del biorreactor a las 72 horas, en vez de las 50 horas que se
aplicaba hasta el momento. Debido a la cinética de crecimiento de la cepa estudiada, se
estima que alcanza la fase estacionaria después de 48 horas. En experiencias previas con
otras cepas probióticas que se han cosechado en 72 horas y liofilizadas, se ha conservado
la viabilidad del producto seco, más que con la misma cepa cosechada a las 48 horas.

2. Estresar la cepa probiótica en la etapa de crecimiento. Muchos autores, entre otros,

Becker et al.[8] sugieren que estresar la cepa en la etapa de cultivo (crecimiento de la cepa)
es beneficioso para la sobrevivencia del microorganismo después de una etapa de secado.
Por tal motivo, al medio de permeado de suero, se adicionó NaCl a 0.5M, de tal forma de
estudiar el efecto del estrés osmótico en la sobrevivencia de la cepa en la etapa de
almacenamiento.

Los resultados se presentan a continuación:

1,E+10 1,E+10

1,E+09 1,E+09
LF1
ufc/g

ufc/g

LF1
SV1
1,E+08 1,E+08 SV1

1,E+07
1,E+07
0 10 20 30 40
0 20 40 60
Tiempo (min)
1 2
Tiempo (min)
 Figura 53. Viabilidad en función del tiempo para la biomasa con 72 horas de cultivo: 1: alimento de 2 mm; 2:
alimento de 4 mm.

1,E+10
1,E+10
1,E+09
1,E+08 1,E+09
LF1

ufc/g
ufc/g

1,E+07 LF1
SV1
1,E+06 SV1 1,E+08
1,E+05
1,E+04 1,E+07
0 30 60 0 10 20 30 40
Tiem po (m in) 1 Tiempo (min) 2

Figura 54. Viabilidad en función del tiempo para la biomasa estresada con sal: 1: alimento de 2 mm; 2: alimento de
4 mm.

Las Figs. 55 y 56 demuestran, una vez más, la conservación de la viabilidad de la cepa

probiótica durante la etapa de secado. Se tomaron menos puntos experimentales que en los
ensayos anteriores, puesto que interesaba estudiar el efecto de estas dos alternativas en la etapa de
almacenamiento.

1,E+11

1,E+10

1,E+09

1,E+08

1,E+07
ufc/g

LF 4ºC
1,E+06
LF 20ºC
1,E+05 SV 4ºC
1,E+04 SV 20ºC

1,E+03

1,E+02
0 7 14 21
Tiempo (días)
 Figura 55. Viabilidad del alimento probiótico seco de 2 mm (biomasa con 72 hrs. de cultivo) almacenado.

1,E+10

1,E+09

1,E+08

1,E+07
LF 4ºC
ufc/g

1,E+06 LF 20ºC
1,E+05 SV 4ºC
SV 20ºC
1,E+04

1,E+03

1,E+02
0 7 14 21
Tiempo (días)

Figura 56. Viabilidad del alimento probiótico seco de 4 mm (biomasa con 72 hrs. de cultivo) almacenado.

Tal como se observa en las Figs. 55 y 56, la viabilidad del producto probiótico en la etapa
de almacenamiento mejora notoriamente, al compararlo con la Fig. 52.
Las células en fase estacionaria desarrollan un metabolismo diferente al de la fase de
exponencial (fase de crecimiento exponencial) y durante ella se produce una acumulación y
liberación de metabolitos secundarios. Los microorganismos entran en fase estacionaria bien
porque se agota algún nutriente esencial del medio, porque los productos de desecho que han
liberado durante la fase de crecimiento exponencial hacen que el medio sea inhóspito para el
crecimiento microbiano o por la presencia de competidores u otras células que limiten su
crecimiento. Si se considera que no existe presencia de competidores (medio de cultivo se
considera estéril), la presencia de metabolitos potencialmente tóxicos genera un medio de estrés
que, tal como acontece con el estrés osmótico, confiere resistencia a las bacterias ante una etapa
de secado. 1,E+10

Sin embargo
1,E+09los buenos resultados mostrados con respecto a la alternativa de cosechar la

1,E+08
biomasa a las 72 horas, el costo de aumentar el tiempo de residencia de las bacterias es alto, pues
1,E+07
implica contar con un fermentador de mayor
LF 4ºC capacidad para tal efecto.
ufc/g

1,E+06
LF 20ºC
1,E+05 SV 4ºC
SV 20ºC
1,E+04

1,E+03

1,E+02
0 7 14 21
Tiempo (días)
 Figura 57. Viabilidad del alimento probiótico seco de 2 mm (biomasa estresada con NaCl en la etapa de cultivo)
almacenado.

1,E+10
1,E+09
1,E+08
1,E+07
1,E+06 LF 4ºC
ufc/g

1,E+05 LF 20ºC
1,E+04 SV 4ºC
SV 20ºC
1,E+03
1,E+02
1,E+01
1,E+00
0 7 14 21
Tiempo (días)

Figura 58. Viabilidad del alimento probiótico seco de 4 mm (biomasa estresada con sal en la etapa de cultivo)
almacenado.
Las Figs. 57 y 58 muestran los resultados obtenidos con el alimento con biomasa estresada
con NaCl en la etapa de cultivo, es decir, la viabilidad mejora notoriamente al compararlo con el
almacenamiento del producto con biomasa sin alterar, si bien la viabilidad del producto
almacenado se reduce en al menos 1 ciclo logarítmico al cabo de 2 semanas (tanto en el alimento
de 2 mm como en el de 4 mm).
Los efectos del estrés osmótico en la cepa LPT32 ya han sido mencionado en análisis
anteriores, pero es preciso recalcar que este fenómeno otorga una mayor resistencia a este
microorganismo después de una etapa de secado, por modificiación en la estructura de la
membrana celular, por acumulación de solutos compatibles que actúan como agentes protectores,
etc.
Al contrario que lo que acontece con la alternativa de cosechar a las 72 horas la cepa en
estudio, el costo de estresar la biomasa con NaCl no está asociado a invertir en un equipo de
mayor tamaño, sólo comprende el costo de la sal propiamente tal.

Concentración de la biomasa probiótica en el alimento y costo de producirla.

Con el procedimiento aquí descrito, se asegura una concentración de 109 ufc por gramo de
alimento. Por otro lado, el costo de producir esta biomasa asciende a 1005 [$/kg alimento] 1. Este
costo es excesivo si se piensa en escalar a una producción de toneladas de alimento, por ejemplo.
Un producto probiótico comercial posee una concentración no superior a 10 8 ufc por gramo, esto
es 10 veces menos que lo que se obtiene en laboratorio. Por lo tanto, puede estimarse que el costo
de elaborar alimento probiótico para truchas también disminuye 10 veces, es decir, a sólo 100
[$/kg alimento].
En cuanto al proceso de elaboración del alimento para truchas la alternativa propuesta en
esta memoria de título equivale a tres etapas extras: una etapa de fermentación, otra de separación
y una de secado.

Figura 59. Proceso actual de elaboración de alimento para truchas.

1
 Figura 60. Proceso propuesto para elaborar alimento probiótico para truchas.

Bibliografía

 Panigrahi, “The viability of probiotic bacteria as a factor influencing the inmune response
in rainbow trout Oncorhynchus mykiss”, Aquaculture 243 (2005) 241– 254.
 Balcázar et al. (2007) “Protection of rainbow trout (Oncorhynchus mykiss) from
lactococcosis by probiotic bacteria”, Comparative Immunology, Microbiology &
Infectious Diseases, article in press (2007).
 Gatesoupe, F.J., “The use of probiotics in aquaculture”, Aquaculture 180 (1999) 147–165.
 Nikoskelainen et al., “Protection of rainbow trout (Oncorhynchus mykiss) from
furunculosis by Lactobacillus rhamnosus”, Aquaculture 198 (2001) 229–236.
 Robertson et al., “Use of Carnobacterium sp. as a probiotic for Atlantic salmon_Salmo
salar L./and rainbow trout (Oncorhynchus mykiss, Walbaum)”, Aquaculture 185 (2000)
235–243.
 Havenaar, R., Huisin’t Veld, J. “Probiotics: A general view.”, Wood J. B.J. (ed)., Lactic
Acid Bacteria in health and Disease, Vol. 1. Elsevier Applied Science Publishers, (1992).