EXTRACCION DE RNA CON TRIZOL

1. Homogenización de la muestra: Pulverizar con nitrógeno líquido, tejido vegetal joven,

y colocar en tubos Eppendorf hasta la marca de 250µL.
2. Colocar las muestras en hielo y añadir 1 mL de Reactivo TRIZOL, homogeneizar en
Vortex 60 segundos. Evitar el calentamiento de la muestra colocando el tubo repetidas
veces en hielo.
3. Separación de Fases: centrifugar a 12,000 rpm durante 10 minutos a 4°C.
4. Transferir el sobrenadante aclarado a un tubo nuevo y desechar el tubo.
5. Incubar la muestra a temperatura ambiente (TA) por 5 minutos, para permitir la
disociación del complejo de la nucleoproteína.
6. Añadir 200µL de Cloroformo a 4°C, agitar vigorosamente con las manos durante 15
segundos.
7. Incubar 3 minutos a TA.
8. Centrifugar la muestra a 12,000 rpm durante 15 minutos a 4°C (la mezcla se separa en
una fase inferior roja de fenol-cloroformo, una interface, y una fase acuosa superior
incolora. El RNA pertenece exclusivamente en la fase acuosa, superior a 50% de
volumen total.
9. Retirar la fase acuosa de la muestra inclinando el tubo a 45° y el pipetear evitando traer
la capa de interface u orgánica en la pipeta cuando se haga la eliminación de la fase
acuosa.
10. Colocar la fase acuosa en un nuevo tubo y proceder al aislamiento de RNA.
11. Procedimiento para el aislamiento de RNA: añadir 500µL de Isopropanol 100% a
4°C e incubar a temperatura ambiente durante 10 minutos.
12. Centrifugar a 12,000 rpm durante 10 minutos a 4°C (el RNA es a menudo invisible a
menudo invisible antes de la centrifugación, y forma un granulo similar a un gel en el
lado y la parte inferior del tubo).
13. Lavado del RNA: eliminar el sobrenadante del tubo, dejando solo el precipitado de
RNA.
14. Lavar la pastilla con 1 mL de Etanol 70% preparado con H2O DEPC a 4°C.
15. Dar un spin a la muestra y centrifugar a 75,000 rpm durante 5 minutos a 4°C, decantar
el etanol, dejar secar la pastilla de 5 - 10 minutos sobre la mesa.
16. Resuspender el RNA: en alícuotas de 20µL, en H2O DEPC.
17. Cuantificar en el Genovo Nano.
18. Verificar la calidad del RNA en gel de agarosa al 1%, utilizar como blanco agua Milli-
Q estéril.
19. Almacenar a - 80°C hasta su uso.