BAB III

METODE PENELITIAN

3.1 Jenis Penelitian

Penelitian ini merupakan penelitian eksperimental yang dilakukan di

laboratorium Universitas YARSI secara in vitro.

3.2 Rancangan Penelitian

Penelitian ini menggunakan 4 variasi dosis ekstrak Binahong yaitu, 0,5%,

1%, 2%, dan 4% (untuk uji in vitro pada HDF) kemudian dilakukan
pemeriksaan viabilitas dan migrasi.

3.3 Populasi

Human Dermal Fibroblast Cell (HDF Cell)

3.4 Sampel

Human Dermal Fibroblast Cell (HDF Cell) yang berasal dari biorepository
Universitas YARSI.

3.5 Cara Penetapan Sampel

Sel HDF ditanam dengan kepadatan 10.000 sel/cm2 .

3.6 Penetapan Besar Sampel

Sebanyak 10.000 sel/cm2 dengan pada multiple 96 well untuk

pemeriksaan viabilitas dan sebanyak 40.000 sel/sumuran dengan pada
multiple 24 well untuk pemeriksaan migrasi.

3.7 Jenis Data

Kualitatif : morfologi sel

1
 Kuantitatif : Jumlah dan persentase sel yang mengisi ruang kosong

3.8 Cara Pengumpulan dan Pengukuran Data

I. Migrasi

Sel HDF ditanam dalam multi well plate 24 well, masing-masing well berisi
40.000 sel/well. Setelah konfluen 80%, dilakukan scratch dengan ujung tip 100
µl. kemudian diberikan ekstrak daun binahong dengan variasi konsentrasi dosis
ekstrak daun binahong dan diinkubasi selama 0 jam, 6 jam, 12 jam dan 24 jam.
Setelah itu akan diukur luas penutupan luka pada masing-masing jam tersebut.

Kelompok perlakuan :

1) Kontrol dengan serum

2) Kontrol tanpa serum
3) Perlakuan dosis ekstrak Binahong 0,5%
4) Perlakuan dosis ekstrak Binahong 1%
5) Perlakuan dosis ekstrak Binahong 2%
6) Perlakuan dosis ekstrak Binahong 4%
II. Viabilitas

Sel HDF ditanam dalam multi well plate 96 well, masing-masing well berisi
10.000 sel/well. Setelah 24 jam diberi perlakuan dosis Ekstrak daun binahong
dengan variasi konsentrasi dosis ekstrak daun binahong masing-masing
kelompok dengan 3 kali pengulangan (tripliket). Inkubasi 24 jam dimasukan ke
dalam inkubator. Kemudian diambil sel 90 µl dan ditambah dengan pelarut 10
µl trypan blue.

2
 Kelompok perlakuan :

1) Kontrol dengan serum

2) Kontrol tanpa serum
3) Perlakuan dosis ekstrak Binahong 0,5%
4) Perlakuan dosis ekstrak Binahong 1%
5) Perlakuan dosis ekstrak Binahong 2%
6) Perlakuan dosis ekstrak Binahong 4%

3.9 Instrumen Pengumpulan Data

Menggunakan microscope inverted dan perangkat lunak Nikon Advanced

Research Element 3.21.00 dan di analisis dengan software T-Scratch untuk
pemeriksaan migrasi dan menggunakan TC20 Automated Cell Counter untuk
pemeriksaan viabilitas.

3.10 Analisis Data

Data akan diperoleh dari gambar yang diambil dari mikroskop inverted yang
dilengkapi dengan kamera, untuk selanjutnya akan dianalisa secara kuantitatif
dengan menggunakan Microsoft excel dan SPSS untuk pemeriksaan Migrasi
dan menggunakan Kamera Handphone untuk pemeriksaan Viabilitas.

3
3.11 Alur Penelitian

Gambar 3.1 Alur Penelitian

4
Cara Kerja

Prosedur: Pembuatan Ekstrak Daun Binahong

1. 200 gr daun binahong (Anredera cordifolia (Ten.) Steenis) yang telah

dikeringkan dilarutkan dalam 2 L ethanol.
2. Campuran daun binahong dan ethanol disaring menggunakan kertas
saring.
3. Hasil filtrasi dikonsentrasikan dengan menggunakan rotary evaporator
pada suhu 60°C.
4. Ekstrak diencerkan sesuai dosis perlakuan, yaitu 0,5%, 1%, 2%, dan 4%.

I. Migrasi

Bahan :

1. Sel Human Dermal Fibroblast (HDF)

2. Ekstrak Daun Binahong
3. DMEM (Dulbecco’s Modified Eagle Medium)
4. FBS (Fetal Bovine Serum)
5. PBS (Phospate Buffered Saline)
6. Penicillin dan Streptomicin

Peralatan :

1. Multi plate 24 well

2. Microtube
3. Pipet 100 l
4. Sentrifugasi
5. Inkubator (37oC)
6. Microscope inverted
7. Microplate reader dengan panjang gelombang 420-480 nm

Pengumpulan data :

Luas luka pada 0 jam-luas luka pada t jam dibagi luas luka pada 0 jam kali
100%

¿ 0−Ltx
% wound healing = x 100%
¿0

5
Software:

1. Microsoft excel atau SPSS

2. Tscartch

Prosedur :

1. Sel HDF ditanam pada medium penumbuh (growth medium) pada multi
plate 24 well masing-masing sebanyak 40.000 sel/well.
2. Setiap hari medium diganti sampai 80% konfluen dan terbentuk suatu
monolayer.
3. Secara perlahan-lahan scratch monolayer tersebut dengan ujung pipet tip
100 µl, ujung dari pipet tip harus selalu tegak lurus dari dasar monolayer.
4. Setelah itu sel dicuci dengan menggunakan PBS.
5. Lalu sel diberi perlakuan penambahan ekstrak Daun dengan berbagai
variasi dosis yaitu 0,5%, 1%, 2%, 4%, kontrol dengan serum, dan kontrol
non serum dalam berbagai kelompok perlakuan.
6. Perhatikan luas penutupan luka yang terjadi dalam 0 jam, 6 jam, 12 jam
dan 24 jam.
7. Setelah itu sel difoto dengan menggunakan mikroskop.
8. Kemudian dilihat perubahan yang terjadi pada sel.
9. Sel dianalisis dengan menggunakan Microsoft Excel, SPSS dan TScartch.

II. Viabiltas

Bahan :

1. Sel Human Dermal Fibroblast (HDF)

2. Ekstrak Daun Binahong
3. DMEM (Dulbecco’s Modified Eagle Medium)
4. FBS (Fetal Bovine Serum)
5. Penicillin dan Streptomicin
6. Trypan Blue

Peralatan :

1. Multi plate 96 well

2. Microtube
3. Inkubator (37oC)
4. TC20 Automated Cell Counter/ Hemositometer
5. Counting Slide/Bilik Hitung Neubauer
6. Kamera Handphone

6
Prosedur :

1. Sel HDF ditanam pada medium penumbuh (growth medium) pada multi
plate 96 well masing-masing sebanyak 10.000 sel/well.
2. Setelah 24 jam, sel diberi perlakuan penambahan ekstrak Daun dengan
berbagai variasi dosis yaitu 0,5%, 1%, 2%, 4%, kontrol dengan serum, dan
kontrol non serum dalam berbagai kelompok perlakuan dengan 3 kali
pengulangan.
3. Kemudian diinkubasi selama 24 jam ke dalam inkubator.
4. Setelah itu, diambil sel 90 µl dan ditambah dengan 10 µl trypan blue ke
dalam counting slide/Bilik Hitung Neubauer .
5. Masukan silde ke dalam TC20 Automated Cell Counter/ Hemositometer
dan tunggu hasilnya.
6. Setelah didapatkan hasilnya, foto dengan menggunakan kamera hp.

3.12 Jadwal Penelitian

Tabel. 3.1. Jadwal Penelitian Pengaruh Ekstrak Daun Binahong (Anredera

Cordifilia (Ten.) Steenis) Terhadap Viablitas dan Migrasi sel Human Dermal
Fibroblast dalam Kondisi High Glucose Dan Tinjauannya Menurut Islam

No. Kegiatan Waktu

Sosialisasi Pembagian Kelompok dan September (minggu I) –

1 Pembimbing September (minggu II)

Pengajuan Topik/Judul Penelitian September (minggu III) –

2 Oktober (minggu II)

Bimbingan Proposal dengan Dosen Oktober (minggu I) –

3 Pembimbing Januari (minggu IV)

Pendaftaran Ujian Proposal Desember (minggu II) –

4 Januari (minggu IV)

Ujian Proposal Januari (minggu IV) –

5 Februari (minggu III)

Revisi Proposal Februari (minggu IV) –

6 Maret (minggu IV)

7
 Pelaksanaan Penelitian (Koleksi Data) April (minggu I) – Mei
7 (minggu IV)

Penyusunan Laporan Hasil Penelitian Juni (minggu I) –

8 Juli (minggu III)

Pendaftaran Ujian Skripsi Juli (minggu IV) –

9 Agustus (minggu II)

Ujian Skripsi Agustus (minggu III) –

10 September (minggu III)

Revisi September (minggu IV) –

11 Oktober (minggu IV)

Penyerahan Laporan Akhir Oktober (minggu II) –

12 November (minggu III)