PENGEMBANGAN GALUR

MIKROORGANISME

TIM BIOTEKNOLOGI FARMASI - ISTN

Tujuan Pengembangan Galur
Mendapatkan mutan yg lebih unggul yi :
• Tingkat produksi lbh tinggi

• Dapat beradaptasi dg baik pd proses fermentasi

• Waktu fermentasi lebih singkat

• Tidak menghasilkan produksi yg tidak diinginkan

• Penggunaan substrat yg lebih murah

• Tidak membentuk busa pd waktu fermentasi

• Tingkat konsumsi oksigen lebih rendah

Cara meningkatkan produktivitas
mikroorganisme
 Optimasi kondisi lingkungan
 Modifikasi parameter fisika (suhu,agitasi dll)
 Modifikasi parameter kimia(pH,kadar O2,dll)
 Modifikasi parameter biologi(ko-kultur,enzim dll)
 Optimasi nutrisi mikroorganisme: Sumber karbon,
nitrogen, mineral dan sumber nutrisi lain,
Penambahan prekursor, enzim
 Modifikasi genetik (mutasi,rekombinasi,kloning
gen)
Modifikasi genetik

Mutasi genetik
• Perubahan dalam kromosom yg diturunkan kepada
generasi penerusnya
• Terjadi perubahan rangkaian nukleotida DNA
• Terjadi secara spontan dan terus menerus dg laju
lambat
• (LIHAT BAB MUTASI)
Seleksi Mutan

 Seleksi adalah prosedur utk mendeteksi dan

mengisolasi sel mikroorganisme yg
diinginkan dr banyak populasi yg telah
mendapatkan perlakuan dg komponen
mutagen
 Mutan yg didapat masih mendapat
perlakuan mutasi dan seleksi berulangkali
utk menghasilkan galur yg menguntungkan.
Karakterisasi mutan
• Karakterisasi mutan yg dikehendaki :
1.Murni,terbebas dr segala jenis organisme kontaminan
2.Dapat memproduksi sel vegetatif dan spora
3.Dapat tumbuh dg subur dan segera setelah diinokulasi
dilakukan dg fase lag yg pendek
4.Menghasilkan produk tunggal dl jml yg banyak,mudah
dipanen dan bebas dr senyawa yg bersifat toksin
5.Dapat menghasilkan metabolit/biomassa dl waktu yg
singkat.
6. Mempunyai sifat genetik yg stabil
7.Dapat disimpan dan diawetkan utk jangka waktu yg
lama
TEKNOLOGI DNA REKOMBINAN

 Rekombinasi antara molekul DNA dari

organisme berbeda:
 Corynebacterium diphtheriae yang diinfeksi
oleh virus
 menghasilkan toksin yang bertanggung jawab
terhadap gejala difteri.
 Perubahan genetik dalam bakteri ini
disebabkan oleh virus dan merupakan suatu
rekayasa genetik dalam alam.
 CONTOH PRODUK REKOMBINAN

KESEHATAN
Protein terapeutik, Diagnostik, vaksin
(protein / DNA), terapi gen

Bioremediasi Agrikultur
CONTOH PRODUK REKOMBINAN

 ANTIBODI REKOMBINAN
 PROTEIN TERAPEUTIK: insulin, interferon, albumin
serum manusia, hormon pertumbuhan manusia,
aktivator plasminogen jaringan, antithrombin, faktor
pembekuan darah, limfokin, faktor nekrosis tumor,
dismutase superoksida, dan gonadotropin manusia
 VAKSIN: hepatitis B, herpes, influenza, malaria
 VAKSIN DNA
 TERAPI GEN
CONTOH PRODUK REKOMBINAN
 PRODUK PERTANIAN: tanaman tahan
penyakit, resistensi pestisida,
bioinsektisida, fiksasi nitrogen
 PRODUK BIOREMEDIASI: pengurai
lemak/minyak, penghilangan herbisida,
pendegradasi pestisida
CONTOH:

 Tanaman kapas-Bt dan tomat-Bt tahan terhadap

serangan hama karena menghasilkan toksin yang
dapat membunuh hamanya.
 Toksin pada kapas-Bt dan tomat-Bt disandikan oleh
gen yang berasal dari bakteri Bacillus thuringiensis
(Bt = Bacillus thuringiensis)

 Tanaman kapas-Bt dan tomat-Bt = tanaman

transgenik
Tomat biasa
Tidak tahan hama

Tomat-Bt
Tahan hama
 Organisme transgenik: organisme yang membawa
gen yang berasal dari jenis organisme lainnya.
 Organisme transgenik dihasilkan melalui Rekayasa
Genetika
 Rekayasa Genetika menggunakan Teknologi DNA
Rekombinan
 Teknologi DNA Rekombinan : kumpulan teknik atau
metoda yang digunakan untuk mengkombinasikan
gen-gen secara buatan. (Proses: rekombinasi; Hasil:
rekombinan)
Teknologi DNA Rekombinan meliputi:

 Teknik untuk mengisolasi DNA.

 Teknik untuk memotong DNA.
 Teknik untuk menggabung atau menyambung
DNA.
 Teknik untuk memasukkan DNA ke dalam sel
hidup sehingga DNA rekombinan dapat
bereplikasi dan dapat diekspresikan.
 DNA dapat masuk ke dalam sel bakteri melalui 3
cara:
1. Konjugasi
2. Transformasi
3. Transduksi
Konjugasi

 Konjugasi merupakan pemindahan DNA langsung

dari satu sel ke sel lainnya.
 In conjugation, only one strand of DNA is
transferred.
 The recipient completes the structure of
doublestranded DNA by synthesizing the strand
that complements the strand acquired from the
donor.
Konjugasi:

 Kontak langsung
 Pili  melekatkan sel donor ke resipien
 Ori T: replikasi
 Helikase: memotong DNA
 Replikasi terjadi dengan cara rolling circle
replication.
 Spread antibiotic resistancy
Transformasi
 pengambilan DNA oleh bakteri dari lingkungan di
sekelilingnya
 Relatively few bacterial species are naturally competent for
transformation; these species assimilate donor DNA in linear
form.
 The reason for his results: DNA had leaked from dead cells of
virulent pneumococci and was taken up as free DNA by living
nonvirulent pneumococci, which became virulent as a result.

Kromosom bakteri
DNA asing (DNA bakteri)
Transduksi

 Transduksi merupakan pemindahan gen bakteri

yang diperantarai oleh virus (fage).
 In transduction, donor DNA is carried in a phage
coat and is transferred into the recipient by the
mechanism used for phage infection.
 Perangkat utama yang digunakan pada
pembentukan DNA rekombinan:
 Plasmid
 Enzim restriksi
 DNA ligase
 Bakteri
 Plasmid: Plasmid merupakan molekul DNA
sirkular yang berukuran kecil dan terpisah dari
kromosom.
 Enzim Restriksi untuk memotong DNA:

 Contoh: Enzim EcoRI telah diisolasi pertama kali oleh

Herbert Boyer pada tahun 1969 dari E.coli.
 Enzim EcoRI memotong pada bagian antara basa G dan
A pada sekuens GAATTC.
ENZIM RESTRIKSI & LIGASE
 Manfaat
Teknologi DNA rekombinan telah memberikan manfaat di bidang ilmu
pengetahuan maupun di bidang terapan.
Contoh:
A. Bidang Kesehatan:
A1. Insulin manusia telah diproduksi secara massal
menggunakan bakteri E.coli dan telah diperdagangkan
untuk mengobati penyakit diabetes.
Merek dagang: HumulinR
A2. Vaksin hepatitis B digunakan untuk mencegah infeksi
virus hepatitis. Telah diproduksi secara komersial
menggunakan S.cereviciae dalam skala industri

A3. Hormon tumbuh manusia (GH) diproduksi

menggunakan E.coli dan digunakan untuk mengobati
kelainan pertumbuhan (misal: cebol).
A4. Therapi gen untuk penyakit Klon gen Penyisipan normal
(alel normal) gen pada vektor
dilakukan dengan menggantikan gen yang
mengalami kerusakan dengan gen yang
normal, digunakan untuk mengobati DNA rekombinan
penyakit-penyakit keturunan (genetic Vektor retrovirus
disorders) dan penyakit lain yang
disebabkan oleh kerusakan gen (misal: Infeksi sel bone
kanker) marrow

DNA rekombinan
menyisip ke
kromosom

Sel bone marrow

dari pasien

Sel Bone marrow mengandung stem sel

yang mampu miningkatkan semua sel-sel darah dan Injeksi sel
sistem imun ke pasien
B. Bidang Pertanian:

B1. Bakteri Ice- (ice minus): bakteri yang telah

direkayasa sehingga tidak membeku pada suhu
rendah.
Digunakan (disemprotkan) pada tanaman agar
tanaman tidak membeku di musim dingin.
Telah diperdagangkan dengan merek FrostbanR.

B2. mikroba pendegradasi limbah.

B3. Tanaman tahan hama, misal kapas Bt, tomat Bt
B4. Tanaman tahan herbisida.

FARMASI ISTN BIOTEKNOLOGI FARMASI DNA REKOMBINAN

 Rekombinasi penggabungan
(fusi)protoplasma
• Fusi protoplasma adalah suatu teknik umum utk
menginduksi rekombinasi genetik
• Protoplas adalah seluruh sel tanpa dinding sel
• Dibuat dg cara membuang dinding sel menggunakan
enzim . Utk bakteri digunakan lisozim, utk kapang
digunakan chitinase atau selulase
• Dilakukan di dlm larutan penstabil osmosis,mis sukrosa
• Dg bantuan lar PEG ,protoplas akan membentuk
agregat dan bergabung yg disertai dg pertukaran DNA
• Teknik lain adalah dg induksi medan listrik
Tujuan rekombinasi protoplas

 rekombinasiintra spesifik,dr galur yg tidak

mempunyai siklus seksual atau paraseksual,atau
peluang rekombinasinya rendah
 hibridisasi
interspesifik,untuk memperoleh
mikroorganisme yg baru yg mempunyai
kemampuan mensintesis metabolit yg
dimodifikasi
 tranfeksi
atau transformasi protoplas di dalam
percobaan cloning DNA
Isolasi, Seleksi dan Penyimpanan
Mikroorganisme
 Mikroba yg sudah diisolasi dan diseleksi disebut
dg isolat
 Isolat dikembangkan menjadi populasi sel ,yg
disebut kultur
 Inokulum adalah populasi sel yg siap
diinokulasikan
Kriteria memilih mikroorganisme
1. karakteristik gizi dr organisme,proses dijalankan dg
medium yg tdk mahal
2. suhu optimum dr organisme
3. reaksi dr organisme dg peralatan yg akan dipakai dan
kecocokan organisme terhadap tipe proses tg
digunakan
4. stabilitas organisme dan dapat diuji utk manipulasi
genetik
5. produktivitas dr organisme tinggi
6. mudahnya recovery hasil dari kultur,umumnya kultur
diisolasi dari lingkungan alamiah(tanah) dan Culture
collection
Metode Isolasi menggunakan seleksi
dari karakteristik yg diinginkan
• 1.Enrichment liquid culture
– Encirichment culture adalah teknik yg menghasilkan
naiknya jml organisme relative terhadap jml dr tipe-
tipe lain dlm inokulum asli
Proses meliputi :
– mengambil populasi campuran

– Melengkapi kondisi-kondisi yg sesuai baik utk

pertumbuhan dan tipe-tipe yg dikehendaki atau tdk
cocok dg pertumbuhan dr mikroorganisme lain
• 2.Solidified media
-sudah digunakan utk isolasi dr produser-
produser enzim tertentu
- teknik ini umumnya menggunakan medium
selektive,dg menggunakan substrat yg
dapat mempercepat pertumbuhan dr tipe
mikroorganisme yg diinginkan
Metode Isolasi yang tidak menggunakan
seleksi dari karakteristik yang diinginkan

• Mikroorganisme diisolasi secara random dg teknik

yg sudah dikembangkan yg kemudian secara cepat
terjadi seleksi organisme yg sudah terisolasi utk
karakteristik yg diinginkan
• Screening utk produksi Antibiotik
• Screening utk senyawa2 aktif farmakologi
• Screening utk produksi dr faktor2 pertumbuhan
• Screening utk produksi polisakarida
Metode penyimpanan
mikroorganisme
Penyimpanan pd suhu rendah
a.penyimpanan pada agar miring
– Kultur yg tumbuh pd agar miring dapat disimpan
dlm refrigerator atau freezer
b.penyimpanan dg nitrogen cair
- Kultur ditumbuhkan dulu sampai fase pertumbuhan
stationer,kmd sel dimasukkan dl lar gliserol 10% dl
vial,dibekukan dan disimpan dlm pendingin nitrogen
cair.
Penyimpanan dalam bentuk kering

– A.kultur dr tanah,tanah yg lembab dan steril dpt

diinokulasi dg kultur,diinkubasi utk
pertumbuhan,dikeringkan pd suhu kamar selama 2
minggu,tanah kering tsb disimpan pd tek atm,kering
dlm re frigerator
– B.liofilisasi(freeze drying),kultur ditumbuhkan sampai
fase stasioner,dimasukan ke dalam vial yg berisi serum
atau sodium glutamat,kemudian dilakukan proses
freeze drying
Penyimpanan mikroorganisme
• Tujuan penyimpanan:
-mikroorganisme tetap hidup
-menghindari terjadinya kontaminasi
-mencegah terjadinya perubahan
genetik
-produktivitas tetap tinggi
Pengendalian kultur stock
 Pengujian secara periodik terhadap
-kemurnian
-viabilitas
-produktivitas