LAPORAN AKHIR PRAKTIKUM

BIOTEKNOLOGI PERIKANAN

Disusun oleh:
KELOMPOK 10 / PERIKANAN C

Riduwan Ibrahim 230110170119

Raden Gumilar 230110170124
Regan Hanifelian 230110170145
Suci Rizkia Amalia 230110170150
Nidia Puspitasari 230110170162

UNIVERSITAS PADJADJARAN
FAKULTAS PERIKANAN DAN ILMU KELAUTAN
PROGRAM STUDI PERIKANAN
JATINANGOR

2019
 KATA PENGANTAR

Puji dan syukur penulis panjatkan kehadirat Allah SWT, Karena dengan
limpahan rahmat dan karunia-Nya, beserta izin-Nya penulis berhasil menyelesaikan
penulisan laporan tepat pada waktu yang telah ditentukan. Tak lupa shalawat serta
salam kepada junjungan Nabi Besar Muhammad SAW dan para sahabatnya yang telah
membawa kita dari kegelapan ke dalam terang benderang penuh ilmu pengetahuan.
Laporan praktikum merupakan tugas dari mata kuliah Bioteknologi Perikanan yang
berjudul “Laporan Akhir Praktikum Bioteknologi Perikanan ”.
Laporan praktikum yang berjudul “Laporan Akhir Praktikum Bioteknologi
Perikanan” dibuat untuk memenuhi laporan praktikum mata kuliah Bioteknologi
Perikanan pada Program Studi Perikanan, Fakultas Perikanan dan Ilmu Kelautan
Universitas Padjadjaran. Penulis juga mengucapkan terima kasih kepada:
1. Dr. Yuniar Mulyani, S.P., M.Si selaku dosen penanggung jawab mata kuliah
Bioteknologi Perikanan.
2. Sihlvia Oktanita dan Aisyah, selaku asisten penanggung jawab mata kuliah
Bioteknologi Perikanan Kelas C.
Penulis berharap, laporan ini dapat memberikan manfaat kepada para pembaca
dengan menambah pengaruh besar untuk kita semua.

Jatinangor, Mei 2019

Kelompok 10

i
 DAFTAR ISI

BAB Halaman

DAFTAR TABEL ........................................................................ iv

DAFTAR GAMBAR ................................................................... v
DAFTAR LAMPIRAN .............................................................. vi
I PENDAHULUAN
1.1 Latar Belakang ................................................................... 1
1.2 Tujuan ................................................................................ 2
1.2.1 Pengenalan Alat ................................................................. 2
1.2.2 Sterilisasi............................................................................ 3
1.2.3 Isolasi DNA ....................................................................... 3
1.2.4 PCR .................................................................................... 3
1.2.5 Elektroforesis .................................................................... 3
1.2.6 Bioinformatika .................................................................. 3
1.3 Prinsip Kerja ...................................................................... 4
1.3.1 Pengenalan Alat ................................................................. 4
1.3.2 Sterilisasi............................................................................ 5
1.3.3 Isolasi DNA ....................................................................... 6
1.3.4 PCR .................................................................................... 7
1.3.5 Elektroforesis .................................................................... 8
1.3.6 Bioinformatika .................................................................. 9
II TINJAUAN PUSTAKA
2.1 Ikan Uji ............................................................................. 10
2.1.1 Ikan Mas ............................................................................ 10
2.1.2 Ikan Mas Koki ................................................................... 12
2.1.3 Ikan Nilem ......................................................................... 16
2.1.4 Ikan Barbir ........................................................................ 17
2.1.5 Ikan Nila ........................................................................... 18
2.1.6 Ikan Komet ....................................................................... 22
2.2 Materi Genetik ................................................................... 23
2.3 Isolasi DNA ....................................................................... 26
2.4 Elektroforesis ..................................................................... 31
2.5 Polymerase Chain Reaction (PCR) ................................... 33
2.5.1 Teknik PCR ....................................................................... 34
2.5.2 Prinsip Kerja PCR.............................................................. 36
2.6 Marka DNA ....................................................................... 37
2.7 Keragaman Genetik ........................................................... 39

ii
III METODOLOGI PRAKTIKUM
3.1 Waktu dan Tempat Praktikum ........................................... 41
3.2 Alat Dan Bahan Praktikum ................................................ 41
3.2.1 Alat Praktikum ................................................................... 41
3.2.2 Bahan Praktikum ............................................................... 43
3.3 Prosedur Praktikum ........................................................... 44
3.3.1 Pengambilan Sampel ......................................................... 44
3.3.2 Proses Isolasi/Ekstraksi DNA ............................................ 45
3.3.3 Amplifikasi DNA dengan Teknik RAPD-PCR ................. 46
3.3.4 Elektroforesis ..................................................................... 47
3.4 Elektroforesis ..................................................................... 47
3.5 Analisis Data ...................................................................... 48
IV HASIL DAN PEMBAHASAN
4.1 Hasil Isolasi/Ekstraksi DNA Genom ................................ 49
4.2 Amplifikasi DNA dan Deteksi Polimorfisme ................... 52
4.3 Analisis Kekerabatan Genetik Ikan Uji ............................ 55
V KESIMPULAN DAN SARAN
5.1 Kesimpulan ........................................................................ 58
5.2 Saran .................................................................................. 58
DAFTAR PUSTAKA ................................................................. 59
LAMPIRAN ................................................................................ 65

iii
 DAFTAR TABEL

Nomor Judul Halaman

1 Alat Praktikum ................................................................................. 41

2 Bahan Praktikum .............................................................................. 43
3 Pita Polimorfik dan Monomorfik Ikan Uji ....................................... 54

iv
 DAFTAR GAMBAR

Nomor Judul Halaman

1. Ikan Mas ............................................................................................... 10
2. Ikan Mas Koki...................................................................................... 13
3. Saluran Pencernaan Ikan Mas Koki ..................................................... 15
4. Ikan Nilem ........................................................................................... 16
5. Ikan Barbir ........................................................................................... 18
6. Ikan Nila ............................................................................................... 19
7. Ikan Komet ........................................................................................... 22
8. Elektroforesis Hasil DNA Genom ....................................................... 51
9. Visualisasi Hasil PCR .......................................................................... 53
10. Fenogram kekerabatan genetik ikan uji ............................................... 55

v
 DAFTAR LAMPIRAN

Nomor Judul Halaman

1. Alat.........................................................................................66
2. Bahan......................................................................................69
3. Prosedur Kerja........................................................................71
4. Dokumentasi Kegiatan...........................................................76
5. Perhitungan.............................................................................79

vi
 BAB I
PENDAHULUAN

1.1 Latar Belakang

Abad ke 21 memang menjadi abad kemajuan teknologi yang diciptakan oleh
umat manusia. Pemikiran manusia semakin berkembang, pun dengan keradaannya.
Teknologi telah membuat manusia memiliki kehidupan yang lebih mudah, lebih
praktis, dan lebih unggul dari sebelumnya.
Bioteknologi, rekayasa genetika merupakan salah satu dari sekian banyak
variable sains dan teknologi yang tetap memiliki banyak ambivalensi dalam
aplikasinya terhadap kehidupan manusia. Di satu sisi dia menawarkan kemudahan dan
di sisi lain, ia menyimpan potensi bagi ketimpangan dan kekhawatiran sosial.
Absurdnya hukum dan norma, juga potensi akan nampaknya pelecehan etis dan
degradasi moral.
Secara ilmiah, rekayasa genetika adalah manipulasi atau perubahan susunan
genetik dari suatu organisme. Rekayasa genetika merupakan proses buatan/sintetis dengan
menggunakan Teknologi DNA rekombinan. Hasil dari rekayasa genetika adalah sebuah
organisme yang memiliki sifat yang diingingkan atau organisme dengan sifat unggul,
organisme tersebut sering disebut sebagai organisme transgenik. Rekayasa genetika sangat
terkait dengan bidang bioteknologi lain seperti kloning hewan dan kloning manusia.
Rekayasa genetika telah memiliki aplikasi luas di hampir semua bidang yang
berkaitan dengan bioteknologi dimana genom organisme yang terlibat. Proses transfer
materi genetik dari satu organisme ke organisme lain menggunakan vektor atau pembawa
secara ilmiah disebut sebagai transformasi. Bahkan, semua percobaan telah dilakukan pada
bakteri, tanaman dan sebagian besar banyak hewan tikus, meskipun eksperimen manusia
belum mungkin karena alasan yang jelas.
Sebelum mendapatkan informasi ilmiah secara genetik, perlu dilakukan isolasi
DNA total dan amplifikasi wilayah. Ekstraksi untuk mendapatkan DNA berkualitas
tinggi merupakan satu kaidah dasar yang harus dipenuhi dalam studi molekuler (Jose

1
 2

dan Usha 2000). Ada tiga langkah utama dalam ekstraksi DNA, yaitu perusakan
dinding sel (lisis), pemisahan DNA dari debris sel, seperti lemak, selulosa dan protein,
serta pemurnian DNA (Surzycki 2000). Yang kemudian akan dielektroforesis untuk
dapat mengetahui cara kerja dan prinsip kerja dari elektroforesis gel agarose hasil dari
amplifikasi PCR.
Ringkasnya metode elektroforesis ini mulai berkembang akhir abad ke 19
setelah ditemukan penelitian yang menunjukkan adanya efek dari listrik terhadap
partikel-partikel atau molekul-molekul yang bermuatan listrik, dalam ha1 ini termasuk
juga protein (PORNET, QUINCKE, HARDY. Dalm RICHARDSON dkk 1986).
Menurut PASSTEUR dkk. (1988) elektroforesis berasal dari bahasa Junani yang
mempunyai arti transport atau perpindahan melalui partikel-partikel listrik.
Tujuan dilakukannya praktikum ini adalah pengenalan alat dan bahan agar
praktikan dapat mengetahui fungsi sehingga tidak salah menggunakan. Lalu
dilakukannya sterilisasi alat dan bahan agar mencegah kontaminan pada setiap alat dan
bahan. Dilanjutkan dengan isolasi DNA yang berarti memisahkan DNA dengan
berbagai macam kontaminan seperti protein , lemak , RNA, dst. Sedangkan proses
amplifikasi digunakan untuk memperbanyak / melipat gandakan DNA yang telah
diisolasi tujuannya agar DNA memiliki konsentrasi yang banyak dan baik sehingga
pada saat proses elektroforesis hasil yang didapatkan dari sampel DNA lebih mudah
diamati.

1.2 Tujuan
1.2.1 Pengenalan Alat
Tujuan praktikum pengenalan alat-alat laboratorium bioteknologi adalah untuk
mengetahui alat-alat yang digunakan selama praktikum beserta fungsi dan prosedur
penggunaannya, sehingga dalam melakukan praktikum, praktikan dapat memperoleh
hasil suatu percobaan atau penelitian yang maksimal.
 3

1.2.2 Sterilisasi
Tujuan praktikum sterilisasi adalah sebagai berikut:
1. Memahami dan melaksanakan proses sterilisasi yang tepat dan sesuai untuk
alat dan bahan yang akan digunakan dalam pengujian.
2. Mampu menyiapkan dan membuat media steril untuk pengujian

1.2.3 Isolasi DNA

Tujuan praktikum isolasi DNA adalah untuk mengetahui cara dan proses-
proses yang berkaitan langsung untuk melakukan isolasi DNA.

1.2.4 PCR
Untuk mempercepat isolasi DNA spesifik tanpa membuat dan melakukan
pustaka genom. DNA dapat dihasilkan dalam jumlah besar dengan waktu relatif
singkat sehingga memudahkan berbagai teknik lain yang menggunakan DNA.

1.2.5 Elektroforesis
Untuk mengetahui ukuran dan bentuk suatu partikel baik DNA, RNA dan
protein. Selain itu, elektroforesis juga digunakan untuk fraksionasi yang dapat
digunakan untuk mengisolasi masing-masing komponen dari campurannya,
mempelajari fitogenetika, kekerabatan dan mempelajari penyakit yang diturunkan
(Klug & Cummings 1994). Elektroforesis dalam bidang genetika, digunakan untuk
mengetahui ukuran dan jumlah basa yang dikandung suatu sekuen DNA tertentu (Klug
& Cummings 1994).

1.2.6 Bioinformatika
Tujuan bioinformatika adalah untuk mengelola dan menganalisis informasi
biologis. Bioinformatika mencakup penerapan metode-metode matematika, statistika,
dan informatika untuk memecahkan masalah-masalah biologis, terutama dengan
menggunakan sekuens DNA dan asam amino serta informasi yang berkaitan
 4

dengannya. Informasi biologis dalam praktikum ini adalah data hasil PCR dan
elektroforesis, sehingga data yang ada dapat dianalisis dan ditarik kesimpulannya.

1.3 Prinsip Kerja

1.3.1 Pengenalan Alat
Prinsip kerja pengenalan alat yaitu berdasarkan identifikasi alat yang biasa
digunakan pada saat praktikum serta fungsi dari masing-masing alat tersebut, dan
penggunaan atau cara yang tepat untuk menggunakannya. Contoh prinsip kerja
beberapa alat-alat laboratorium:
1. Sarung Tangan (glove) adalah salah satu keperluan didalam bidang kerja. Alat
ini berguna untuk melindungi tangan dari benda yang dihadapi/dikerjakan
apakah bahan korosif, panas, dingin, tajam atau kasar karena alat pelindung
tangan berbeda-beda bisa terbuat dari karet, kulit ataupun kain katun. Sarung
tangan Berguna sebagai alat pelindung tangan saat bekerja di tempat atau
kondisi yang dapat mengakibatkan cedera tangan. Bahan dan bentuk sarung
tangan di sesuaikan dengan fungsi masing-masing pekerjaan.
2. Autoklaf merupakan alat sterilisasi dengan menggunakan uap panas
bertekanan 2 atm/ 15 psi (pounds per square inci) dan suhu 121 C selama 15
menit untuk bahan dan 20 menit untuk alat. Spesifikasi Autoklaf : Autoklaf
merupakan alat untuk mensterilisasi alat dan bahan dalam waktu yang cukup
singkat. Dapat langsung mematikan sel-sel vegetative dari suatu mikroba.
Tidak semua bahan bisa disterilisasikan dengan autoklaf, seperti serum,
vitamin, antibiotic, dan enzim
3. Waterbath Merupakan oven atau bisa disebut penangas air yang fungsi
utamanya untuk menciptakan suhu yang konstan . merupakan wadah yang
berisi air yang bisa mempertahkan suhu air pada kondisi tertentu selama selang
waktu yang ditentukan. Pada saat saklar diposisi “on” maka arus listrik dari
sumber akan member suplay listrik ke heater. Heater yang diberi arus listrik
 5

memberikan panas pada alat, suhu semain tinggi , dan berhenti naik sampai
suhu yang diinginkan.
4. Plastik Wrap merupakan plastic tpis yang digunakan untuk membungkus alat-
alat yang telah disterilkan.

1.3.2 Sterilisasi
Sterilisasi panas memanfaatkan sumber panas untuk membunuh mikroba.
Faktor dari sterilisasi panas adalah temperatur sumber panas dan durasi pemanasan.
Sumber panasnya dapat dibagi menjadi 2 kategori yaitu panas lembab dan panas
kering. Panas Lembab: Autoclave Perebusan Panas Kering: Flaming Insinerasi Oven
Radiasi: Non-Ionis, ada 4 alat untuk sterilisasi yaitu
1. Autoklaf merupakan alat sterilisasi dengan menggunakan uap panas bertekanan
2 atm/ 15 psi (pounds per square inci) dan suhu 121 C selama 15 menit untuk
bahan dan 20 menit untuk alat. Spesifikasi Autoklaf : Autoklaf merupakan alat
untuk mensterilisasi alat dan bahan dalam waktu yang cukup singkat. Dapat
langsung mematikan sel-sel vegetative dari suatu mikroba. Tidak semua bahan
bisa disterilisasikan dengan autoklaf, seperti serum, vitamin, antibiotic, dan
enzim
2. Oven merupakan alat sterilisasi dengan menggunakan Uap Panas Kering.
Protein mikroba akan mengalami dehidrasi hingga terjadi kekeringan,
selanjutnya teroksidasi oleh oksigen di udara sehingga menyebabkan matinya
mikroba. Spesifikasi Alat : Merupakan alat untuk mensterilisasi alat dan bahan.
Tidak semua bahan dapat disterilisasi dengan oven seperti serum, vitamin,
antibiotic, dan enzim. Tidak menimbulkan embun/kondensasi pada alat yang
disterilisasi karena menggunakan uap panas kering. Dapat digunakan sebagai
incubator
3. Bunsen menggunakan metanol atau bahan bakar gas sebagai bahan bakarnya
Digunakan untuk memanaskan dan/atau mensterilkan cairan dalam beaker,
labu erlenmeyer, dll dan juga untuk mensterilkan alat alat laboratorium berbasis
 6

platina seperti jarum inokulasi. Spesifikasi Alat : Merupakan alat untuk

mensterilisasi alat dan bahan menggunakan panas api. Untuk alat berbasis
platina disterilkan dengan dipanaskan di api bunsen sampai berpijar
4. BSC merupakan alat untuk mensterilisasi alat dan bahan dengan menggunakan
teknik pengaturan udara dan adanya penyinaran UV. sistem kerja ini sangat erat
hubungannya dengan kontaminasi mikroorganisme. Alat Ini juga penting
dalam proses Pembuatan Media Pertumbuhan Mikrobiologi agar tidak terjadi
kontaminasi. Spesifikasi alat: Dapat dilakukan untuk kerja aseptis. Resiko
kontaminan kecil karena adanya pengaturan udara dan sinar UV. Tidak dapat
langsung digunakan karena harus adanya penyinaran UV selama 2 jam terlebih
dahulu.

1.3.3 Isolasi DNA

Prinsip utama dalam isolasi DNA ada tiga yakni penghancuran (lisis), ektraksi
atau pemisahan DNA dari bahan padat seperti selulosa dan protein, serta pemurnian
DNA (Corkill dan Rapley 2008; Dolphin 2008). Pemecahan sel (lisis) merupakan
tahapan dari awal isolasi DNA yang bertujuan untuk mengeluarkan isi sel (Holme dan
Hazel 1998). Tahap penghancuran sel atau jaringan memiliki beberapa cara yakni
dengan cara fisik seperti menggerus sampel dengan menggunakan mortar dan pestle
dalam nitrogen cair atau dengan menggunakan metode freezing-thawing dan iradiasi
(Giacomazzi et al. 2005). Cara lain yakni dengan menggunakan kimiawi maupun
enzimatik. Penghancuran dengan menggunakan kimiawi seperti penggunaan detergen
yang dapat melarutkan lipid pada membran sel sehingga terjadi destabilisasi membran
sel (Surzycki 2000). Sementara cara enzimatik seperti menggunakan proteinase K
seperti untuk melisiskan membran pada sel darah (Khosravinia et al. 2007) serta
mendegradasi protein globular maupun rantai polipeptida dalam komponen sel.
Pada tahapan ekstraksi DNA, seringkali digunakan chelating agent seperti
ethylenediamine tetraacetic acid (EDTA) yang berperan menginaktivasi enzim DNase
yang dapat mendenaturasi DNA yang diisolasi, EDTA menginaktivasi enzim nuklease
 7

dengan cara mengikat ion magnesium dan kalsium yang dibutuhkan sebagai kofaktor
enzim DNAse (Corkill dan Rapley 2008). DNA yang telah diekstraksi dari dalam sel
selanjutnya perlu dipisahkan dari kontaminan komponen penyusun sel lainnya seperti
polisakarida dan protein agar DNA yang didapatkan memiliki kemurnian yang tinggi.
Fenol seringkali digunakan sebagai pendenaturasi protein, ekstraksi dengan
menggunakan fenol menyebabkan protein kehilangan kelarutannya dan mengalami
presipitasi yang selanjutnya dapat dipisahkan dari DNA melalui sentrifugasi (Karp
2008).
Bettelheim dan Landesberg (2007) menyebutkan bahwa setelah sentrifugasi
akan terbentuk 2 fase yang terpisah yakni fase organik pada apisan bawah dan fase
aquoeus (air) pada lapisan atas sedangkan DNA dan RNA akan berada pada fase
aquoeus setelah sentrifugasi sedangkan protein yang terdenaturasi akan berada pada
interfase dan lipid akan berada pada fase organik. Prinsip utama sentrifugasi adalah
memisahkan substansi berdasarkan berat jenis molekul dengan cara memberikan gaya
sentrifugal sehingga substansi yang lebih berat akan berada di dasar, sedangkan
substansi yang lebih ringan akan terletak di atas. Teknik sentrifugasi tersebut dilakukan
di dalam sebuah mesin yang bernama mesin sentrifugasi dengan kecepatan yang
bervariasi, contohnya 2500 rpm (rotation per minute) atau 3000 rpm.
Setelah proses ekstraksi, DNA yang didapat dapat dipekatkan melalui
presipitasi. Pada umumnya digunakan etanol atau isopropanol dalam tahapan
presipitasi. Kedua senyawa tersebut akan mempresipitasi DNA pada fase aquoeus
sehingga DNA menggumpal membentuk struktur fiber dan terbentuk pellet setelah
dilakukan sentrifugasi (Switzer 1999). Hoelzel (1992) juga menambahkan bahwa
presipitasi juga berfungsi untuk menghilangkan residu-residu kloroform yang berasal
dari tahapan ekstraksi.

1.3.4 PCR
Polymerase Chain Reaction (PCR) adalah metode untuk amplifikasi
(perbanyakan) primer oligonukleotida diarahkan secara enzimatik urutan DNA
 8

spesifik. Teknik ini mampu memperbanyak sebuah urutan 105-106-kali lipat dari
jumlah nanogram DNA template dalam latar belakang besar pada sequence yang tidak
relevan (misalnya dari total DNA genomik). Perbanyakan DNA diawali dengan
pengudaran utas DNA ganda menjadi utas tunggal (denaturasi), penempelan primer
forard hingga primer reserve utas tunggal (annealing), dan sintesis utas DNA baru
(Muladno 2002).
Komponen- komponen yang diperlukan pada proses PCR adalah templat DNA;
sepasang primer, yaitu suatu oligonukleotida pendek yang mempunyai urutan
nukleotida yang komplementer dengan urutan nukleotida DNA templat; dNTPs
(Deoxynucleotide triphosphates); buffer PCR; magnesium klorida (MgCl2) dan enzim
polimerase DNA.
Proses PCR melibatkan beberapa tahap yaitu: (1) pra-denaturasi DNA templat;
(2) denaturasi DNA templat; (3) penempelan primer pada templat (annealing); (4)
pemanjangan primer (extension) dan (5) pemantapan (post-extension). Tahap (2)
sampai dengan (4) merupakan tahapan berulang (siklus), di mana pada setiap siklus
terjadi duplikasi jumlah DNA.

1.3.5 Elektroforesis
Elektroforesis adalah suatu teknik yang mengukur laju perpindahan atau
pergerakan partikel-partikel bermuatan dalam suatu medan listrik. Prinsip kerja dari
elektroforesis berdasarkan pergerakan partikel-partikel bermuatan negatif (anion),
dalam hal tersebut DNA, yang bergerak menuju kutub positif (anode), sedangkan
partikel-partikel bermuatan positif (kation) akan bergerak menuju kutub negatif
(anode) (Klug & Cummings 1994: A-6). Elektroforesis digunakan untuk mengamati
hasil amplifikasi dari DNA. Hasil elektroforesis yang terlihat adalah
terbentuknya band yang merupakan fragmen DNA hasil amplifikasi dan menunjukkan
potongan-potongan jumlah pasangan basanya (Klug & Cummings 1994: 397).
 9

1.3.6 Bioinformatika
Bioinformatika didefinisikan sebagai aplikasi dari alat komputasi dan analisa
untuk menangkap dan menginterpretasikan data-data biologi molekul. Biologi molekul
sendiri juga merupakan bidang interdisipliner, mempelajari kehidupan dalam level
molekul. Bioinformatika memadukan penerapan metode matematika, statistika, dan
informatika untuk memecahkan persoalan biologi, khususnya yang terkait dengan
DNA. Contoh kajiannya antara lain tentang pengelolaan informasi hayati, penyejajaran
urutan, prediksi struktur, analisis filogenetik, analisis ekspresi gen, dan manipulasi
DNA.
 BAB II
TINJAUAN PUSTAKA

2.1 Ikan Uji

Ikan uji yang digunakan dalam praktikum ini adalah ikan mas, ikan mas koki,
ikan nilem, ikan barbir, dan ikan nila.
2.1.1 Ikan Mas
Ikan mas merupakan jenis ikan air tawar dengan bentuk tubuh memanjang dan
sedikit pipih kesamping (Compressed), mulut terletak diujung tengah (terminal) dan
bernilai ekonomis penting dan sudah tersebar luas di Indonesia (Djoko 2000). Ikan mas
yang terdapat di Indonesia merupakan ikan mas yang dibawa dari Cina, Eropa, Taiwan
dan Jepang (Susanto 2007). Klasifikasi Ikan Mas menurut (Amri & Khairuman 2008)
adalah sebagai berikut:
Filum : Chordata
Kelas : Pisces
Ordo : Cypriniformes
Famili : Cyprinidae
Genus : Cyprinus
Spesies : Cyprinus carpio L.

Gambar 1. Ikan Mas

Tubuh ikan mas terbagi menjadi tiga bagian, yaitu kepala, badan, dan ekor.
Memiliki mulut kecil yang membelah bagian depan kepala, sepasang mata, sepasang
lubang hidung terletak di bagian kepala, dan tutup insang terletak di bagian belakang
kepala. Seluruh bagian tubuh ikan mas ditutupi dengan sisik yang besar, dan berjenis
cycloid yaitu sisik halus yang berbentuk lingkaran. Ikan Mas memiliki lima buah sirip,

10
 11

yaitu sirip punggung yangterletak di bagian punggung (dorsal fin), sirip dada yang
terletak di belakang tutup insang (pectoral fin), sirip perut yang terletak pada perut
(pelvic fin), sirip dubur yang terletak di belakang dubur (anal fin) dan sirip ekor yang
terletak di belakang tubuh dengan bentuk cagak (caudal fin) (Santoso 2011).
Sirip punggung ikan mas berbentuk memanjang yang terletak pada bagian
permukaannya, sama dengan permukaan sirip perut. Di bagian belakang sirip
punggung ini berjari keras, dan di bagian akhir bergerigi seperti juga sirip punggung.
Di bagian sirip dubur ikan mas ini juga berjari keras dan bagian yang terakhir bergerigi,
sedangkan sisik ikan mas ini berukuran cukup besar dengan tipe sisik liingkaran
(cycloid) dan terletak beraturan (Santoso 2011).
Habitat yang disukai ikan mas adalah perairan dengan kedalaman 1 meter yang
mengalir pelan, dan subur yang ditandai melimpahnya pakan alami, misalnya rotifer,
rotatoria, udang-udang renik dan lain-lain. Sebaliknya larva ikan mas menyukai
perairan dangkal, tenang dan terbuka. Benih ikan mas yang berukuran cukup besar
lebih menyukai perairan yang agak dalam, mengalir dan terbuka. Di negara tropis ikan
mas berpijah pada musim hujan. Waktu pemijahan biasanya bertepatan dengan
turunnya hujan. Kesiapan proses pemijahan induk dapat terganggu jika media
hidupnya tercemar, kandungan oksigen terlarut menurun dan kondisi kesehatan induk
menurun (Djarijah 2011).
Di alam bebas ikan mas hidup di pinggiran sungai, danau, atau perairan tawar
lain dengan kedalaman air yang tidak terlalu dalam dan tidak terlalu deras aliran airnya.
Lingkungan perairan yang ideal untuk tempat hidup ikan mas adalah daerah dengan
ketinggian 150 – 600 m di atas permukaan laut. Habitat utama ikan mas adalah dalam
air tawar. Namun dapat hidup juga di daerah muara sungai yang airnya payau
(Narantaka 2012). Penyebaran ikan mas merata di daratan Asia juga Eropa, sebagian
Amerika Utara dan Australia. Di Indonesia, ikan mas terdapat di sungai dan danau-
danau di pulau Sulawesi, Kalimantan, dan Jawa (Cholik 2005).
Ikan mas tergolong jenis omnivora, yakni ikan yang dapat memangsa berbagai
 12

jenis makanan, baik yang berasal dari tumbuhan maupun binatang renik, misalnya
invertebrata air, udang-udangan renik, larva dan serangga air, kerang-kerangan dan
tanaman air. Ikan ini juga senang memakan berbagai jenis biji-bijian yang dicampurkan
sebagai suplemen makanan buatan (artificial foods). Sumber protein, vitamin, lemak,
dan mineral sebagai sumber energi metabolisme tubuh dan pertumbuhan diperoleh dari
makanan renik berupa plankton, yaitu plankton nabati (phitoplankton) dan plankton
hewani (zooplankton). Hewan-hewan kecil tersebut disedot bersama lumpurnya,
diambil yang dapat dimanfaatkan dan sisanya dikeluarkan melalui mulut (Djarijah
2011).
Ikan mas sering mencari sumber makanan berupa jasad-jasad renik di sekeliling
pematang, oleh sebab itu pematang sering rusak dan longsor karenanya. Ikan mas juga
suka mengaduk-aduk dasar kolam untuk mencari makanan yang bisa dimanfaatkan
seperti larva insecta, cacing-cacingan dan sebagainya. Aktivitas ini akan membantu
kawanan benih mencari makanan karena binatang-binatang di dasar kolam yang
teraduk ke atas dapat menjadi santapan lezat bagi benih (Santoso 1993).
Ikan mas yang dibudidayakan di kolam-kolam budidaya dapat dikawinkan
sepanjang tahun tanpa harus menunggu musim kawin terlebih dahulu, sedangkan di
alam seperti sungai, danau maupun wilayah yang digenangi air lainnya, ikan mas akan
memijah pada awal atau sepanjang musim penghujan. Ikan mas biasanya memijah pada
perairan dangkal, setelah terjadi kekeringan selama musim kemarau. Ikan mas
menempelkan seluruh telurnya pada tanaman atau rerumputan di tepian perairan
(Santoso 1993).

2.1.2 Ikan Mas Koki

Ikan mas koki (Carassius auratus) pertama kali dibudidayakan oleh
masyarakat Cina pada tahun 960-1729. Awalnya bentuk ikan maskoki seperti ikan mas
(Cyprinus carpio L), bedanya ikan mas koki tidak memiliki sepasang sungut di
mulutnya (Bachtiar 2002). Pada masa dinasti Ming (tahun 1368-1644) popularitas ikan
mas koki mulai menanjak. Di sinilah bermunculan ikan mas koki dengan bentuk tubuh
 13

yang bervariasi dan unik. Perkembangan ikan mas koki kemudian merambah hingga
ke negeri Jepang.
Di negeri matahari terbit ikan mas koki terus mengalami perkembangan pesat
sehingga menghasilkan bentuk yang lebih bervariatif seperti saat ini. Dari negeri
Sakura, ikan mas koki mulai menyebar ke seluruh dunia, termasuk Indonesia (Bachtiar
2002). Umumnya, bentuk tubuh ikan mas koki unik, bermata besar agak menonjol ke
luar dan warna sisik yang menarik. Ikan mas koki tergolong mudah dipelihara karena
sifatnya cukup adaptif terhadap lingkungan yang baru. Tak mengherankan jika ikan
mas koki dengan berbagai varietasnya tersebar di seluruh dunia (Bachtiar 2002).
Ikan mas koki dalam ilmu taksonomi hewan masih satu kerabat dengan ikan
mas (Cyprinus carpio). Menurut Bachtiar (2002), sistematika ikan mas koki
berdasarkan ilmu taksonomi dijelaskan sebagai berikut:
Filum : Chordata
Subfilum : Craniata
Kelas : Ostheichthyes
Ordo : Teleoste
Subordo : Cyprinoidea
Family : Cyprinidae
Genus : Carassius
Spesies : Carassius auratus Linnaeus.

Gambar 2. Ikan Mas Koki

Ikan mas koki memiliki bentuk badan pendek dan gemuk dengan perangkat
sirip lengkap, antara lain sirip punggung, sirip dada, sirip perut, sirip anus dan sirip
ekor. Pada masing-masing jenis ikan mas koki memiliki bentuk kepala yang berbeda,
 14

perbedaan inilah yang menjadikan ikan mas koki memiliki keunikan dibanding dengan
ikan hias lainnya.
Suhu optimal air untuk hidup ikan mas koki adalah 18-24ºC. Mempertahankan
suhu untuk terus berada dalam kisaran suhu optimal perlu dilakukan. Hal ini
dikarenakan pemeliharaan di luar suhu optimal dapat menekan sistem kekebalan tubuh
ikan dan akan menyebabkan penurunan nafsu makan serta gangguan pada
pertumbuhan ikan. Ikan mas koki dapat hidup dalam air yang memiliki kandungan
oksigen minimal 5 mg/L, pH 7-7.8, tingkat amoniak terlarut maksimal 0,05 mg/L dan
tingkat nitrit terlarut maksimal 0,05 mg/L (Watson et al. 2004).
Ikan mas koki dianggap sebagai ikan yang tangguh karena dapat bertahan hidup
di air berkualitas buruk. Walaupun demikian, kualitas air penting diperhatikan agar
pertumbuhan, reproduksi dan kesehatan ikan berjalan optimal (Watson et al. 2004).
Ikan mas koki dapat hidup hingga umur 30 tahun dengan panjang mencapai 23 inches
(58 cm) dan berat mencapai 2,7 kg.
Ikan mas koki memiliki organ interna dan eksterna yang keseluruhan organ
tersebut memiliki ciri dan fungsi tertentu untuk mendukung kelangsungan hidup ikan
(Yanong 2003). Insang merupakan salah satu organ interna ikan maskoki yang
memiliki peranan penting bagi kelangsungan hidup ikan. Peranan penting tersebut
adalah sebagai media pertukaran gas (Campbell et al. 2004). Insang terdiri dari lamela
insang primer, lamela insang sekunder, dan tulang rawan insang. Lamela primer adalah
lamela yang bersentuhan langsung dengan tulang rawan insang dan lamela sekunder
merupakan percabangan dari lamela primer (Yanong 2003).
Insang akan mengoptimalkan ekstraksi oksigen dari air dan merupakan tempat
untuk melepaskan karbon dioksida. Ikan memompa air melalui mulut dan keluar
diantara celah insang lewat gerakan terkoordinasi dari rahang dan operculum (penutup
insang), agar terjadi ventilasi. Ventilasi yang dimaksudkan berupa aktivitas inhalasi
dan ekshalasi atau proses mengambil oksigen dan melepaskan karbon dioksida lewat
pernafasan. Ketika ventilasi terjadi, darah mengalir dengan arah yang berlawanan
 15

dengan aliran air yang mengalir, oksigen akan masuk ke dalam aliran darah dan CO2
akan dibuang ke air (Campbell et al. 2004).
Usus merupakan salah satu organ interna ikan yang mengambil peranandalam
sistem pencernaan. Usus berbentuk seperti tabung memanjang yang melingkar-lingkar
dan mengisi sebagian besar rongga abdomen. Makanan yang ditangkap oleh mulut
akan masuk ke dalam rongga mulut, melewati faring, esofagus, bola usus (intestinal
bulb), usus kemudian sisa makanan yang tidak diserap akan dikeluarkan lewat anus
(Sarbahi 1951).

Gambar 3. Saluran Pencernaan Ikan Mas Koki

Sumber: (Sarbahi 1951)

Bola usus merupakan kantung hasil pembengkakan anterior usus yang

berfungsi untuk menyimpan makanan. Bola usus tidak memiliki kelenjar lambung dan
memiliki mukosa yang mirip dengan mukosa usus (Khanna dan Yadav 2004). Usus
ikan maskoki sendiri terbagi atas usus depan, usus belakang dan rektum. Perbedaan
antara usus depan, usus belakang, dan rektum terletak pada pola lipatan dari membran
mukosa. Usus depan memiliki pola lipatan berupa garis dan sudut sedangkan usus
belakang memiliki pola lipatan berupa garis yang berbelit-belit. Pola lipatan rektum
ikan mas koki berupa pola miring melintang (Sarbahi 1951).
 16

Ikan mas koki merupakan ikan pemakan segala atau omnivora. Pakan yang
biasa diberikan untuk pembesaran ikan mas koki yaitu pellet (Lingga dan Susanto
1999). Kualitas pakan sangat menentukan keindahan warna sebagai daya tarik,
sehingga banyak upaya yang dilakukan dengan menambahkan zat pigmen yang
mengandung karoten dalam pakan buatan. Pemberian pakan berdasarkan jumlah ikan
(bobot biomassa) dengan kisaran 3-5% per hari, dan frekuensi pemberiannya 2-3 kali
per hari disesuaikan dengan kondisi ikan dan media air pemeliharaannya.

2.1.3 Ikan Nilem

Ikan nilem sangat potensial untuk dikembangkan menjadi produk unggulan
perikanan budidaya di kawasan Jawa Barat seperti Ciamis, Tasikmalaya, Sumedang,
dan Bandung. Budidaya ikan nilem ini menguntungkan dilihat dari sisi ekonomi,
kelestarian lingkungan, dan produksi budidaya (Nuryanto 2001). Selain itu, telur ikan
nilem digemari masyarakat karena rasanya yang lezat dan mempunyai peluang sebagai
komoditas ekspor (Mulyasari et al. 2010).
Klasifikasi ikan nilem (Osteochilus hasselti) menurut Saanin (1984) adalah
sebagai berikut:
Phylum : Chordata
Sub phylum : Vertebrata
Kelas : Pisces
Sub kelas : Teleostei
Ordo : Ostariophysi
Familia : Cyprinidae
Genus : Ostechilus
Spesies : Osteochilus hasselti

Gambar 4. Ikan Nilem

Sumber : Sayid (2019)
 17

Peningkatan permintaan dapat dilihat dari adanya peningkatan produksi ikan

nilem dari tahun ke tahun. Produksi ikan nilem di Jawa Barat mengalami peningkatan
dari tahun 2009 ke tahun 2011. Pada tahun 2009 produksi ikan nilem mencapai 11.413
ton dan mengalami peningkatan pada tahun 2011 sebanyak 7.921 ton menjadi 19.334
ton (Kementerian Kelautan Perikanan 2012).
Ikan nilem mempunyai bentuk tubuh pipih, mulut dapat disembulkan. Posisi
mulut terletak diujung hidung (terminal). Posisi sirip perut terletak di belakang sirip
dada (abdominal). Ikan nilem tergolong bersisik lingkaran (sikloid). Rahang atas sama
panjang atau lebih panjang dari diameter mata, sedangkan sungut moncong lebih
pendek daripada panjang kepala. Permulaan sirip punggung berhadapan dengan sisik
garis rusuk ke-8 sampai ke-10.
Bentuk sirip dubur agak tegak, permulaan sirip dubur berhadapan dengan sisik
garis rusuk ke-22 atau ke-23 di belakang jari-jari sirip punggung terakhir. Sirip perut
dan sirip dada hampir sama panjang. Permulaan sirip perut dipisahkan oleh 4 – 4 1/2
sisik dari sisik garis rusuk ke-10 sampai ke-12. Sirip perut tidak mencapai dubur. Sirip
ekor bercagak. Tinggi batang ekor hampir sama dengan panjang batang ekor dan
dikelilingi oleh 16 sisik (Weber dan de Beaufort 1916 dalam Nuryanto 2001). Menurut
Hardjamulia (1979) ikan nilem berdasarkan warna sisiknya dapat dibedakan menjadi
2, yaitu ikan nilem yang berwarna coklat kehitaman (ikan nilem yang berwarna coklat
hijau pada punggungnya dan terang di bagian perut) dan ikan nilem merah (ikan nilem
yang berwarna merah atau kemerah-merahan pada bagian punggungnya dan pada
bagian perut agak terang).

2.1.4 Ikan Barbir

Ikan barbir memiliki tubuh memanjang berbentuk pipih ke samping. Sebagian
besar tubuh termasuk perut berwarna perak dan mengkilat dengan corak merah lembut.
Selama masa kawin biasanya warna merah akan sangat dominan. Sirip ikan barbir
berwarna kemerahan dan transparan, dibawah jari-jari sirip punggung terakhir terdapat
sebuah titik hitam berbentuk lingkaran. Sirip punggung dan sirip anal berwarna gelap
 18

pada ujungnya. Ikan barbir muda memiliki satu warna yakni perak dengan bintik hitam
pada bagian bawah ujung sirip punggung (Lingga & Susanto 2003).
Klasifikasi ilmiah ikan barbir menurut Hamilton (1822) dalam Kesner (2010)
adalah sebagai berikut:
Phylum : Chordata
Kelas : Actinopterygii
Ordo : Cypriniformes
Famili : Cyprinidae
Genus : Puntius
Spesies : Puntius conchonius

Gambar 5. Ikan Barbir

(sumber: daftarikanhias.web.id)

Ikan barbir hidup berkoloni pada perairan yang tenag dan mengalir. Kualitas
air yang optimal yaitu suhu 20-25°C dengan pH sebesar 6-7. Ikan barbir merupakan
salah satu jenis ikan yang telurnya diserakkan. Ikan barbir dapat hidup di akuarium dan
dapat hidup berdampingan dengan jenis ikan lain (Lingga & Susanto 2003)

2.1.5 Ikan Nila

Ikan nila sangat dikenal oleh masyarakat penggemar ikan air tawar, baik di
negara berkembang maupun di negara maju. Di Asia Tenggara, ikan nila banyak
dibudidayakan, terutama Filipina, Malaysia, Thailand dan Indonesia. Di Indonesia,
ikan ini sudah tersebar hampir ke seluruh pelosok wilayah tanah air (Amri dan
Khairuman 2003).
Ikan ini sebenarnya bukan asli perairan Indonesia, melainkan ikan yang berasal
dari Afrika. Menurut sejarahnya, ikan nila pertama kali didatangkan dari Taiwan ke
Balai Penelitian Perikanan Air Tawar Bogor pada tahun 1969. Setelah melalui masa
 19

penelitian dan adaptasi, ikan ini kemudian disebarluaskan kepada petani di seluruh
Indonesia. Pemberian nama “Nila” berdasarkan ketetapan Direktur Jenderal Perikanan
tahun 1972, jadi “Nila” adalah nama khas Indonesia yang diberikan oleh pemerintah
melalui Direktur Jenderal Perikanan. Nama tersebut diambil dari nama spesies ikan ini,
yakni nilotica yang kemudian diubah menjadi Nila. Para pakar perikanan memutuskan
bahwa nama ilmiah yang tepat untuk ikan Nila adalah Oreochromis niloticus atau
Oreochromis sp. dan dalam bahasa Inggris dikenal sebagai Nile tilapia (Amri dan
Khairuman 2003).
Secara umum klasifikasi ikan nila menurut Suyanto (2003) adalah sebagai
berikut:
Filum : Chordata
Sub filum : Vertebrata
Kelas : Osteichthyes
Sub kelas : Acanthoptherigii
Ordo : Percomorphi
Sub ordo : Percoidea
Famili : Cichlidae
Genus : Oreochromis
Spesies : Oreochromis niloticus

Gambar 6. Ikan Nila

Sumber : Purwanto (2011)

Ikan ini merupakan spesies ikan yang berukuran besar antara 200-400 gram,
sifat omnivora sehingga bisa mengkonsumsi makanan berupa hewan dan tumbuhan
(Amri dan Khairuman 2003). Nila dapat tumbuh dan berkembang dengan baik pada
lingkungan perairan dengan kadar Dissolved Oxygen (DO) antara 2,0-2,5 mg/l. Secara
umum nilai pH air pada budidaya ikan nila antara 5 sampai 10 tetapi nilai pH optimum
 20

adalah berkisar 6-9. Ikan nila umumnya hidup di perairan tawar, seperti sungai, danau,
waduk, rawa, sawah dan saluran irigasi, memiliki toleransi terhadap salinitas sehingga
ikan nila dapat hidup dan berkembangbiak di perairan payau dengan salinitas 20-25‰
(Setyo 2006).
Ikan nila termasuk famili Cichlidae yang mempunyai sifat menyimpan telur dan
larvanya di dalam mulut. Morfologi ikan nila (Oreochromis niloticus) menurut Saanin
(1968), mempunyai ciri-ciri bentuk tubuh bulat pipih, punggung lebih tinggi, pada
badan dan sirip ekor (caundal fin) ditemukan garis lurus (vertikal). Pada sirip punggung
ditemukan garis lurus memanjang Saanin (1968).
Nila memiliki lima buah Sirip, yaitu sirip punggung (dorsal fin), sirip dada
(pectoral fin) sirip perut (ventral fin), sirip anal (anal fin), dan sirip ekor (caudal fin).
Sirip punggungnya memanjang dari bagian atas tutup ingsang sampai bagian atas sirip
ekor. Terdapat juga sepasang sirip dada dan sirip perut yang berukuran kecil dan sirip
anus yang hanya satu buah berbentuk agak panjang. Sementara itu, jumlah sirip
ekornya hanya satu buah dengan bentuk bulat. Sirip punggung, sirip dubur dan sirip
perut terdapat jari-jari lemah dan jari-jari keras yang tajam seperti duri. Sirip punggung
memiliki lima belas jari-jari keras dan sepuluh jari-jari lemah, sedangkan sirip ekor
mempunyai dua buah jari-jari keras dan sepuluh jari-jari lemah. Sirip perut mempunyai
satu jari-jari keras dan lima belas jari-jari lemah (Suyanto 2003).
Ikan nila mempunyai mulut yang letaknya terminal, garis rusuk terputus menjadi
2 bagian dan letaknya memanjang dari atas sirip dan dada, bentuk sisik stenoid, sirip
kaudal rata dan terdapat garis-garis tegak lurus. Mempunyai jumlah sisik pada gurat
sisi 34 buah. Sebagian besar tubuh ikan ditutupi oleh lapisan kulit dermis yang
memiliki sisik. Sisik ini tersusun seperti genteng rumah, bagian muka sisik menutupi
oleh sisik yang lain (Santoso 1996).
Secara alami, ikan nila bisa berpijah sepanjang tahun di daerah tropis. Frekuensi
pemijahan yang terbanyak terjadi pada musim hujan. Di alamnya, ikan nila bisa
berpijah 6-7 kali dalam setahun. Berarti, rata-rata setiap dua bulan sekali, ikan nila akan
 21

berkembang biak. Ikan ini mencapai stadium dewasa pada umur 4-5 bulan dengan
bobot sekitar 250 gram. Masa pemijahan produktif adalah ketika induk berumur 1,5-2
tahun dengan bobot di atas 500 gram/ekor. Seekor ikan nila betina dengan berat sekitar
800 gram menghasilkan larva sebanyak 1.200-1.500 ekor pada setiap pemijahan (Amri
& Khairuman 2002).
Sebelum memijah, ikan nila jantan selalu membuat sarang berupa lekukan
berbentuk bulat di dasar perairan. Diameter lekukan setara dengan ukuran ikan nila
jantan. Sarang itu merupakan daerah teritorial ikan nila jantan. Sarang tersebut
berfungsi sebagai tempat pemijahan dan pembuahan telur (Amri & Khairuman 2002).
Proses pemijahan ikan nila berlangsung sangat cepat. Telur ikan nila
berdiameter kurang lebih 2,8 mm, berwarna abu-abu, kadang-kadang berwarna kuning,
tidak lengket, dan tenggelam di dasar perairan. Telur-telur yang telah dibuahi dierami
di dalam mulut induk betina kemudian menetas setelah 4-5 hari. Telur yang sudah
menetas disebut larva. Panjang larva 4-5 mm. Larva yang sudah menetas diasuh oleh
induk betina hingga mencapai umur 11 hari dan berukuran 8 mm. Larva yang sudah
tidak diasuh oleh induknya akan berenang secara bergerombol di bagian perairan yang
dangkal atau di pinggir kolam (Amri & Khairuman 2002).
Telur ikan nila bulat dengan warna kekuningan. Sekali memijah dapat
mengeluarkan telur sebanyak 300-1.500 butir tergantung ukuran induk betina. Ikan
Nila mulai berpijah pada bobot 100-150 gram, tetapi produksi telurnya masih sedikit.
Induk yang paling produktif bobotnya antara 500-600 gram (Suyanto 1993).
Ikan nila tergolong ikan pemakan segala atau omnivora, karena itulah, ikan ini
sangat mudah dibudidayakan. Ketika masih benih, makanan yang disukai ikan nila
adalah zooplankton (plankton hewani), seperti Rotifera sp., Moina sp. atau Daphnia
sp. Selain itu, juga memakan alga atau lumut yang menempel pada benda-benda di
habitat hidupnya. Ikan nila dewasa ataupun induk pada umumnya mencari makanan di
tempat yang dalam. Jenis makanan yang disukai ikan dewasa adalah fitoplankton,
 22

seperti algae berfilamen, tumbuh-tumbuhan air, dan ooganisme renik yang melayang-
layang dalam air (Rukmana 1998).
Ikan nila merupakan ikan konsumsi yang umum hidup di perairan tawar,
terkadang ikan nila juga ditemukan hidup di perairan yang agak asin (payau). Ikan nila
dikenal sebagai ikan yang bersifat euryhaline (dapat hidup pada kisaran salinitas yang
lebar). Habitat ikan nila di perairan tawar, termasuk saluran air yang dangkal, kolam,
sungai dan danau.
Ikan nila mempunyai kemampuan tumbuh secara normal pada kisaran suhu 14-
38°C dengan suhu optimum bagi pertumbuhan dan perkembangannya yaitu 25-30°C.
Kandungan oksigen air minimal 4 mg/l, kandungan karbondioksida maksimal 5 mg/l,
kadar amoniak dalam air harus dalam batas yang tidak meracuni (lebih rendah 0,1 mg/l)
dan tingkat alkalinitas air berkisar 50-300 mg/l (BPPAT DKP 2001). Ikan nila dapat
hidup pada lingkungan yang mempunyai kisaran pH 5-11 (Arie 2000).

2.1.6 Ikan Komet

Klasifikasi ikan komet berdasarkan ilmu taksonomi (Lingga dan Susanto 2003)
adalah sebagai berikut:
Filum : Chordata
Sub Filum : Vertebrata
Kelas : Pisces
Sub Kelas : Teleostei
Ordo : Otariphisysoidei
Sub Ordo : Cyprinoidae
Famili : Cyprinidae
Genus : Carassius
Spesies : Carassius auratus

Gambar 7. Ikan Komet

 23

Ikan komet memiliki keindahan warna, gerak-gerik, dan bentuk tubuhnya yang
unik, oleh karena itu ikan komet digemari oleh masyarakat. Morfologi ikan komet
relatif menyerupai dengan morfologi ikan mas. Karakteristik yang membedakan dari
ikan komet dan ikan mas adalah bentuk siripnya. Ikan komet mempunyai bentuk sirip
yang lebih panjang dari ikan mas, meskipun jika didekatkan keduanya akan sangat
mirip, oleh sebab itu diluar negeri ikan komet dijuluki sebagai ikan mas (goldfish).
Perbedaan ikan komet jantan dan betina. Ikan komet jantan memiliki sirip dada panjang
dan tebal, kepala tidak melebar, tubuh lebih tipis (ramping), sedangkan ikan komet
betina memiliki sirip dada relatif pendek dan luar tipis, kepala relatif kecil dan
bentuknya agak meruncing, tubuh lebih tebal (gemuk) (Lingga dan Heru 1995).
Bentuk tubuh ikan komet agak memanjang dan memipih tegak (compressed)
mulutnya terletak di ujung tengah dan dapat disembulkan. Bagian ujung mulut
memiliki dua pasang sungut. Di ujung dalam mulut terdapat gigi kerongkongan yang
tersusun atas tiga baris dan gigi geraham secara umum. Sebagian besar tubuh ikan
komet ditutupi oleh sisik kecuali beberapa varietas yang memiliki beberapa sisik. Sisik
ikan komet termasuk sisik sikloid dan kecil. Sirip punggung memanjang dan pada
bagian belakangnya berjari keras. Letak sirip punggung berseberangan dengan sirip
perut. Gurat sisi pada ikan komet tergolong lengkap berada di pertengahan tubuh dan
melentang dari tutup insang sampai ke ujung belakang pangkal ekor (Partical Fish
Keeping 2013).

2.2 Materi Genetik

Genetika (dari bahasa Yunani: genno yang berarti "melahirkan") merupakan
cabang biologi yang penting saat ini. Ilmu ini mempelajari berbagai aspek yang
menyangkut pewarisan sifat dan variasi sifat pada organisme maupun sub organisme
(seperti virus dan prion). Ada pula yang dengan singkat mengatakan, genetika adalah
ilmu tentang gen. Nama "genetika" diperkenalkan oleh William Bateson pada suatu
surat pribadi kepada Adam Chadwick dan ia menggunakannya pada Konferensi
Internasional tentang Genetika ke-3 pada tahun 1906.
 24

Pengertian genetika saat ini berdasarkan perkembangan genetika molekuler.

Genetika adalah ilmu yang menganalisis unit keturunan dan perubahan pengaturan dari
berbagai fungsi fisiologis yang membentuk karakter organisme. Unit keturunan disebut
gen yang merupakan suatu segmen DNA yang nukleotidanya membawa informasi
karakter biokimia atau fisiologis tertentu. Pengertian genetika ini sesuai dengan
pengertian genetika yang dikemukakan para ahli yakni:
1. Genetika adalah cabang biologi yang mengacu (denoted) kepada studi tentang
gen (Brown 1989).
2. Genetika adalah ilmu tentang pewarisan sifat yang mencakup struktur dan
fungsi gen, serta cara pewarisan gen-gen dari satu generasi ke generasi
berikutnya (Russel 1992).
3. Genetika mempelajari tentang gen. Gen adalah konsep dasar yang akan
digunakan dalam komunikasi ilmu pengetahuan secara umum pada saat ini dan
masa yang akan datang (Venville 2002).
4. Genetika diartikan sebagai ilmu cabang biologi yang mengkaji materi genetik
tentang strukturnya, reproduksinya, kerjanya (ekspresi), perubahan dan
rekombinasinya, keberadaannya dalam populasi, serta perekayasaannya
(Corebima 2010).
Konsep Genetika berkembang dari ilmu yang membahas tentang bagaimana
sifat diturunkan menjadi lebih luas lagi yakni ilmu yang mempelajari tentang materi
genetik. Secara luas genetika membahas:
1. Struktur materi genetik, meliputi: gen, kromosom, DNA, RNA, plasmid,
episom, dan elemen tranposabel,
2. Reproduksi materi genetik, meliputi: reproduksi sel, replikasi DNA, reverse
transcription, rolling circle replication, cytoplasmic inheritance, dan
Mendelian inheritance,
3. Kerja materi genetik, meliputi: ruang lingkup materi genetik, transkripsi,
modifikasi pasca transkripsi, kode genetik, translasi, konsep one gen one
 25

enzyme, interaksi kerja gen, kontrol kerja gen pada prokariotik, kontrol kerja
gen pada eukariotik, kontrol genetik terhadap respon imun, kontrol genetik
terhadap pembelahan sel, ekspresi kelamin, perubahan materi genetik,
4. Perubahan materi genetik, meliputi: mutasi, dan rekombinasi,
5. Genetika dalam populasi, dan
6. Perekayasaan materi genetik. (Corebima 2010).
Pengertian genetika yang dikemukakan oleh Corebima (2010) dirumuskan atas
dasar hasil pengelompokan substansi kajian genetika semenjak era J.G. Mendel hingga
era masa kini. Pengertian genetika ini mengikuti pendekatan konsep atau substansi atau
pendekatan material, dan bukan pendekatan sejarah yang dianut oleh banyak buku-
buku genetika, baik terbitan asing maupun dalam negeri. Pengertian genetika ini yang
menjadi substansi kajian utama adalah gen; walaupun pewarisan sifat juga menjadi
substansi kajian, tetapi bukanlah yang utama.
DNA merupakan molekul hereditas yang terdapat di semua organisme baik
prokariot maupun eukariot. Dalam virus, bahan genetik terdiri dari DNA atau RNA.
Semua DNA sel terdiri dari dua rantai polinukleotida berbentuk heliks ganda yang
sangat panjang dan melilit mengelilingi sumbu yang sama. Kedua untai heliks ganda
itu berjalan dalam arah berlawanan. Tulang punggung gula fosfat setiap untai terdapat
dibagian luar heliks ganda, sedangkan basa-basa purin dan pirimidin terdapat dibagian
dalam. Hubungan kedua rantai itu dipertahankan oleh ikatan hidrogen antara pasangan-
pasangan basanya. Adenin (A) selalu berpasangan dengan timin (T) dan guanin (G)
selalu berpasangan dengan sitosin (C) dengan demikian, satu untai heliks ganda
merupakan komplemen terhadap untai lain. Informasi genetik disandi dalam urutan
basa sepanjang suatu untai. Kebanyakan molekul DNA berbentuk sirkular. Sumbu
heliks ganda pada DNA sirkular dapat bergelung sendiri membentuk superheliks. DNA
supercoiled ini lebih kompak daripada DNA kendur (Lubert 2000) .
 26

2.3 Isolasi DNA

Isolasi DNA/RNA merupakan langkah awal yang harus dikerjakan dalam
rekayasa genetika sebelum melangkah ke proses selanjutnya. Prinsip dasar isolasi total
DNA/RNA dari jaringan adalah dengan memecah dan mengekstraksi jaringan tersebut
sehingga akan terbentuk ekstraksel yang terdiri atas sel-sel jaringan, DNA dan RNA.
Kemudian ekstrak sel dipurifikasi sehingga dihasilkan pelet sel yang mengandung
DNA/RNA total. Prinsip-prinsip isolasi DNA plasmid hampir sama dengan isolasi total
DNA/RNA dari jaringan.
Tahap pertama dalam isolasi DNA adalah proses perusakan atau penghancuran
membran dan dinding sel. Pemecahan sel (lisis) merupakan tahapan dari awal isolasi
DNA yang bertujuan untuk mengeluarkan isi sel (Holme dan Hazel 1998). Tahap
penghancuran sel atau jaringan memiliki beberapa cara yakni dengan cara fisik seperti
menggerus sampel dengan menggunakan mortar dan pestle dalam nitrogen cair atau
dengan menggunakan metode freezing-thawing dan iradiasi (Giacomazzi et al. 2005).
Cara lain yakni dengan menggunakan kimiawi maupun enzimatik. Penghancuran
dengan menggunakan kimiawi seperti penggunaan detergen yang dapat melarutkan
lipid pada membran sel sehingga terjadi destabilisasi membran sel (Surzycki 2000).
Sementara cara enzimatik seperti menggunakan proteinase K seperti untuk melisiskan
membran pada sel darah (Khosravinia et al. 2007) serta mendegradasi protein globular
maupun rantai polipeptida dalam komponen sel (Brown 2010; Surzycki 2000).
Pada proses lisis dengan menggunakan detergen, sering digunakan sodium
dodecyl sulphate (SDS) sebagai tahap pelisisan membran sel. Detergen tersebut selain
berperan dalam melisiskan membran sel juga dapat berperan dalam mengurangi
aktivitas enzim nuklease yang merupakan enzim pendegradasi DNA (Switzer 1999).
Selain digunakan SDS, detergen yang lain seperti cetyl trimethylammonium bromide
(CTAB) juga sering dipakai untuk melisiskan membran sel pada isolasi DNA
tumbuhan (Bettelheim dan Landesberg 2007). Parameter keberhasilan dalam
penggunaan CTAB bergantung pada beberapa hal. Pertama, Konsentrasi NaCl harus
 27

di atas 1.0 M untuk mencegah terbentuknya kompleks CTAB-DNA. Karena jumlah air
dalam pelet sel sulit diprediksi, maka penggunaan CTAB sebagai pemecah larutan
harus dengan NaCl dengan konsentrasi minimal 1.4 M. Kedua, ekstrak dan larutan sel
yang mengandung CTAB harus disimpan pada suhu ruang karena kompleks CTAB-
DNA bersifatinsolublepada suhu di bawah 15°C. Ketiga, penggunaan CTAB dengan
kemurnian yang baik akan menentukan kemurnian DNA yang didapatkan dan dengan
sedikit sekali kontaminasi polisakarida. Setelah ditambahkan CTAB, sampel
diinkubasikan pada suhu kamar. Tujuan inkubasi ini adalah untuk mencegah
pengendapan CTAB karena CTAB akan mengendap pada suhu 15°C. Karena
efektivitasnya dalam menghilangkan polisakarida, CTAB banyak digunakan untuk
purifikasi DNA pada sel yang mengandung banyak polisakarida seperti terdapat pada
sel tanaman dan bakteri gram negatif seperti Pseudomonas, Agrobacterium, dan
Rhizobium (Surzycki 2000).
Dalam penggunaan buffer CTAB seringkali ditambahkan reagen-reagen lain
seperti NaCl, EDTA, Tris-HCl, dan 2-mercaptoethanol. NaCl berfungsi untuk
menghilangkan polisakarida sementara 2-mercaptoethanol befungsi untuk
menghilangkan kandungan senyawa polifenol dalam sel tumbuhan (Ranjan et al.
2010). 2-mercaptoethanol dapat menghilangkan polifenol dalam sel tanaman dengan
cara membentuk ikatan hidrogen dengan senyawa polifenol yang kemudian akan
terpisah dengan DNA (Lodhi et al. 1994). Senyawa polifenol perlu dihilangkan agar
diperoleh kualitas DNA yang baik (Moyo et al. 2008). Polifenol juga dapat
menghambat reaksi dari enzim Taq polimerase pada saat dilakukan amplifikasi.
Disamping itu polifenol akan mengurangi hasil ektraksi DNA serta mengurangi tingkat
kemurnian DNA (Porebski et al. 1997). Penggunaan 2-mercaptoethanol dengan
pemanasan juga dapat mendenaturasi protein yang mengkontaminasi DNA (Walker
dan Rapley 2008).
Konsentrasi dan pH dari bufer yang digunakan harus berada dalam rentang pH
5 sampai 12. Larutan buffer dengan pH rendah akan mengkibatkan depurifikasi dan
 28

mengakibatkan DNA terdistribusi ke fase fenol selama proses deproteinisasi.

Sedangkan pH larutan yang tinggi di atas 12 akan mengakibatkan pemisahan untai
ganda DNA. Fungsi larutan buffer adalah untuk menjaga struktur DNA selama proses
penghancuran dan purifikasi sehingga memudahkan dalam menghilangkan protein dan
RNA serta mencegah aktivitas enzim pendegradasi DNA dan mencegah perubahan
pada molekul DNA. Untuk mengoptimalkan fungsi larutan buffer, dibutuhkan
konsentrasi, pH, kekuatan ion, dan penambahan inhibitor DNAase dan detergen
(Surzycki 2000).
Pada tahapan ekstraksi DNA, seringkali digunakan chelating agent seperti
ethylenediamine tetraacetic acid (EDTA) yang berperan menginaktivasi enzim DNase
yang dapat mendenaturasi DNA yang diisolasi, EDTA menginaktivasi enzim nuklease
dengan cara mengikat ion magnesium dan kalsium yang dibutuhkan sebagai kofaktor
enzim DNAse (Corkill dan Rapley 2008). DNA yang telah diekstraksi dari dalam sel
selanjutnya perlu dipisahkan dari kontaminan komponen penyusun sel lainnya seperti
polisakarida dan protein agar DNA yang didapatkan memiliki kemurnian yang tinggi.
Fenol seringkali digunakan sebagai pendenaturasi protein, ekstraksi dengan
menggunakan fenol menyebabkan protein kehilangan kelarutannya dan mengalami
presipitasi yang selanjutnya dapat dipisahkan dari DNA melalui sentrifugasi (Karp
2008).
Bettelheim dan Landesberg (2007) menyebutkan bahwa setelah sentrifugasi
akan terbentuk 2 fase yang terpisah yakni fase organik pada lapisan bawah dan fase
aquoeus (air) pada lapisan atas sedangkan DNA dan RNA akan berada pada fase
aquoeus setelah sentrifugasi sedangkan protein yang terdenaturasi akan berada pada
interfase dan lipid akan berada pada fase organik. Selain fenol, dapat pula digunakan
campuran fenol dan kloroform atau campuran fenol, kloroform, dan isoamil alkohol
untuk mendenaturasi protein. Ekstrak DNA yang didapat seringkali juga
terkontaminasi oleh RNA sehingga RNA dapat dipisahkan dari DNA ekstrak dengan
cara pemberian RNAse (Birren et al. 1997; Clark 2010).
 29

Asam nukleat adalah molekul hidrofilik dan bersifat larut dalam air. Disamping
itu, protein juga mengandung residu hidrofobik yang mengakibatkan protein larut
dalam pelarut organik. Berdasarkan sifat ini, terdapat beberapa metode deproteinisasi
berdasarkan pemilihan pelarut organik. Biasanya pelarut organik yang digunakan
adalah fenol atau kloroform yang mengandung 4% isoamil alkohol. Penggunaan
kloroform isoamil alkohol (CIA) berdasarkan perbedaan sifat pelarut organik.
Kloroform tidak dapat bercampur dengan air dan kemampuannya untuk
mendeproteinisasi berdasarkan kemampuan rantai polipeptida yang terdenaturasi
untuk masuk atau termobilisasi ke dalam fase antara kloroform – air. Konsentrasi
protein yang tinggi pada fase antara tersebut dapat menyebabkan protein mengalami
presipitasi. Sedangkan lipid dan senyawa organik lain akan terpisah pada lapisan
kloroform (Clark 1997).
Proses deproteinisasi yang efektif bergantung pada besarnya fase antara
kloroform-air. Proses ini dapat dilakukan dengan membentuk emulsi dari air dan
kloroform. Hal ini hanya dapat dilakukan dengan penggojogan atau sentrifugasi yang
kuat karena kloroform tidak dapat bercampur dengan air. Isoamil alkohol berfungsi
sebagai emulsifier dapat ditambahkan ke kloroform untuk membantu pembentukan
emulsi dan meningkatkan luas permukaan kloroform-air yang mana protein akan
mengalami presipitasi. Penggunaan kloroform isoamil alkohol ini memungkinkan
untuk didapatkan DNA yang sangat murni, namun dengan ukuran yang terbatas
(20.000–50.000 bp). Fungsi lain dari penambahan CIA ini adalah untuk
menghilangkan kompleks CTAB dan meninggalkan DNA pada fase aquoeus. DNA
kemudian diikat dari faseaquoeus dengan presipitasi etanol (Surzycki 2000).
Setelah proses ekstraksi, DNA yang didapat dapat dipekatkan melalui
presipitasi. Pada umumnya digunakan etanol atau isopropanol dalam tahapan
presipitasi. Kedua senyawa tersebut akan mempresipitasi DNA pada fase aquoeus
sehingga DNA menggumpal membentuk struktur fiber dan terbentuk pellet setelah
dilakukan sentrifugasi (Switzer 1999). Hoelzel (1992) juga menambahkan bahwa
 30

presipitasi juga berfungsi untuk menghilangkan residu-residu kloroform yang berasal

dari tahapan ekstraksi.
Menurut Surzycki (2000), prinsip-prinsip presipitasi antara lain pertama,
menurunkan kelarutan asam nukleat dalam air. Hal ini dikarenakan molekul air yang
polar mengelilingi molekul DNA di larutan aquoeus. Muatan dipole positif dari air
berinteraksi dengan muatan negatif pada gugus fosfodiester DNA. Interaksi ini
meningkatkan kelarutan DNA dalam air. Isopropanol dapat bercampur dengan air,
namun kurang polar dibandingkan air. Molekul isopropanol tidak dapat berinteraksi
dengan gugus polar dari asam nukleat sehingga isopropanol adalah pelarut yang lemah
bagi asam nukleat; kedua, penambahan isopropanol akan menghilangkan molekul air
dalam larutan DNA sehingga DNA akan terpresipitasi; ketiga, penggunaan isopropanol
dingin akan menurunkan aktivitas molekul air sehingga memudahkan presipitasi
DNA.
Pada tahapan presipitasi ini, DNA yang terpresipitasi akan terpisah dari residu-
residu RNA dan protein yang masih tersisa. Residu tersebut juga mengalami
koagulasinamun tidak membentuk struktur fiber dan berada dalam bentuk presipitat
granular. Pada saat etanol atau isopropanol dibuang dan pellet dikeringanginkan dalam
tabung, maka pellet yang tersisa dalam tabung adalah DNA pekat. Proses presipitasi
kembali dengan etanol atau isopropanol sebelum pellet dikering anginkan dapat
meningkatkan derajat kemurnian DNA yang diisolasi (Bettelheim dan Landesberg
2007).
Keller dan Mark (1989) menerangkan bahwa pencucian kembali pellet yang
dipresipitasi oleh isopropanol dengan menggunakan etanol bertujuan untuk
menghilangkan residu-residu garam yang masih tersisa. Garam-garam yang terlibat
dalam proses ekstraksi bersifat kurang larut dalam isopropanol sehingga dapat
terpresipitasi bersama DNA, oleh sebab itu dibutuhkan presipitasi kembali dengan
etanol setelah presipitasi dengan isopropanol untuk menghilangkan residu garam
(Ausubel et al. 2003).
 31

Setelah dilakukan proses presipitasi dan dilakukan pencucian dengan etanol,

maka etanol kemudian dibuang dan pellet dikeringanginkan, perlakuan tersebut
bertujuan untuk menghilangkan residu etanol dari pelet DNA. Penghilangan residu
etanol dilakukan dengan cara evaporasi karena etanol mudah menguap (Surzycki
2000). Pada tahap pencucian biasanya etanol dicampur dengan ammonium asetat yang
bertujuan untuk membantu memisahkan kontaminan yang tidak diinginkan seperti
dNTP dan oligosakarida yang terikat pada asam nukleat (Sambrook et al. 2001).
Setelah pellet DNA dikeringanginkan, tahap selanjutnya adalah penambahan
buffer TE ke dalam tabung yang berisi pellet dan kemudian disimpan di dalam freezer
dengan suhu sekitar -20ºC. Verkuil et al. (2008) menyatakan bahwa buffer TE dan
penyimpanan suhu pada -20ºC bertujuan agar sampel DNA yang telah diekstraksi dapat
disimpan hingga waktu berminggu-minggu. Keller dan Mark (1989) juga menjelaskan
bahwa pelarutan kembali dengan buffer TE juga dapat memisahkan antara RNA yang
mempunyai berat molekul lebih rendah dibandingkan DNA sehingga DNA yang
didapatkan tidak terkontaminasi oleh RNA dan DNA sangat stabil ketika disimpan
dalam keadaan terpresipitasi pada suhu -20ºC.

2.4 Elektroforesis
Elektroforesis adalah suatu cara analisis kimiawi yang didasarkan pada
pergerakan molekul-molekul protein bermuatan di dalam medan listrik (titik
isoelektrik). Pergerakan molekul dalam medan listrik dipengaruhi oleh bentuk, ukuran,
besar muatan dan sifat kimia dari molekul (Titrawani 1996). Pemisahan dilakukan
berdasarkan perbedaan ukuran berat molekul dan muatan listrik yang dikandung oleh
makro-molekul tersebut. Bila arus listrik dialirkan pada suatu medium penyangga yang
telah berisi protein plasma maka komponen-komponen protein tersebut akan mulai
bermigrasi (Ricardson dkk. 1986).
Menurut Stenesh dalam Titrawani (1996) teknik elektroforesis dapat dibedakan
menjadi dua cara, yaitu: elektroforesis larutan (moving boundary electrophoresis) dan
elektroforesis daerah (zone electrophoresis). Pada teknik elektroforesis larutan, larutan
 32

penyangga yang mengandung makro-molekul ditempatkan dalam suatu kamar tertutup

dan dialiri arus listrik. Kecepatan migrasi dari makro-molekul diukur dengan jalan
melihat terjadinya pemisahan dari molekul (terlihat seperti pita) di dalam pelarut.
Sedangkan teknik elektroforesis daerah adalah menggunakan suatu bahan padat yang
berfungsi sebagai media penunjang yang berisi (diberi) larutan penyangga. Media
penunjang yang biasa dipakai adalah gel agarose, gel pati, gel poliakrilamida dan kertas
sellulose poliasetat. Adapun menurut Sargent dan George (1975) elektroforesis daerah
disebut sebagai elektroforesis gel dengan dua buah model yaitu horizontal dan vertikal.
Metode yang biasa digunakan adalah model horizontal, karena mempunyai beberapa
keuntungan yaitu peralatan yang digunakan sangat sederhana, relatif murah dan
pemisahan untuk enzim tertentu dapat menghasilkan pemisahan yang lebih baik.
Menurut Harahap (2018) proses pemisahan dengan elektroforesis sangat
dipengaruhi oleh teknik pengerjaan dalam pengoperasian alat, ada beberapa faktor
penentu lainnya yang dapat mempengaruhi proses pemisahan yaitu:
a. Sampel
Sampel yang akan dipisahkan sangat memungkinkan memberi pengaruh laju
perpindahan ditinjau dari muatan, ukuran, dan bentuk molekul. Jumlah muatan
total akan berbanding lurus dengan laju perpindahan, konsentrasi muatan yang
bermigrasi tergantung pada pH. Untuk ukuran molekul apabila yang diperoleh
lebih besar menyebabkan perpindahan molekul menurun dan membutuhkan
energi perpindahan yang cukup besar dibandingkan dengan bentuk molekul
yang berbeda dengan ukuran yang sama.
b. Larutan Buffer
Larutan buffer berfungsi untuk mempertahankan pH di dalam medium
pemisah, dan berfungsi sebagai media penyedia elektrolit pada proses
pergerakan aliran listrik. Larutan buffer harus memiliki interkasi dengan
molekul yang dipisahkan, dan pH yang digunakan menjadi perhatian sehingga
 33

kumpulan molekul dapat dipisahkan satu sama lain tetapi tidak mengalami
perubahan struktur.
c. Medan listrik
Sumber suatu listik yang stabil sangat diperlukan untuk menghasilkan aliran
listrik dengan tegangan yang konstan. Kekuatan ionik medan listrik pada
kisaran 2-8 V/cm sesuai pada suhu ruang. Kekuatan medan magnet yang
dihasilkan jika lebih besar dari 10 V/cm, maka dapat memberikan efek
pemanasan yang dapat menyebabkan pada media penyangga terjadi kehilangan
air yang diakibatkan proses penguapan. Hal tersebut juga mengakibatkan
pergeseran hasil fragmen-fragmen.

2.5 Polymerase Chain Reaction (PCR)

Reaksi berantai polimerase atau lebih umum dikenal sebagai PCR (Polymerase
Chain Reaction) merupakan suatu teknik atau metode perbanyakan (replikasi) DNA
secara enzimatik tanpa menggunakan organisme. Dengan teknik ini, DNA dapat
dihasilkan dalam jumlah besar dengan waktu relatif singkat sehingga memudahkan
berbagai teknik lain yang menggunakan DNA. Teknik ini dirintis oleh Kary Mullis
pada tahun 1983 dan ia memperoleh hadiah Nobel pada tahun 1994 berkat temuannya
tersebut. Penerapan PCR banyak dilakukan di bidang biokimia dan biologi molekular
karena relatif murah dan hanya memerlukan jumlah sampel yang kecil. Polymerase
Chain Reaction (PCR), merupakan suatu proses sintesis enzimatik untuk
mengamplifikasi nukleotida secara in vitro. Metode PCR dapat meningkatkan jumlah
urutan DNA ribuan bahkan jutaan kali dari jumlah semula. Setiap urutan basa
nukleotida yang diamplifikasi akan menjadi dua kali jumlahnya. Kunci utama
pengembangan PCR adalah menemukan bagaimana cara amplifikasi hanya pada
urutan DNA target dan meminimalkan amplifikasi urutan non-target (Fatchiyah 2006).
Pada dasarnya reaksi PCR adalah tiruan dari proses replikasi DNA in vivo,
yaitu dengan adanya pembukaan rantai DNA (denaturasi) utas ganda, penempelan
primer (annealing) dan perpanjangan rantai DNA baru (extension) oleh DNA
 34

polimerase dari arah terminal 5’ ke 3’. Hanya saja pada teknik PCR tidak menggunakan
enzim ligase dan primer RNA. Secara singkat, teknik PCR dilakukan dengan cara
mencampurkan sampel DNA dengan primer oligonukleotida, deoksiribonukleotida
trifosfat (dNTP), enzim termostabil Taq DNA polimerase dalam larutan DNA yang
sesuai, kemudian menaikkan dan menurunkan suhu campuran secara berulang
beberapa puluh siklus sampai diperoleh jumlah sekuens DNA yang diinginkan.
Menurut Erlich (1989) PCR adalah suatu metode in vitro yang digunakan untuk
mensintesis sekuens tertentu DNA dengan menggunakan dua primer oligonukleotida
yang menghibridisasi pita yang berlawanan dan mengapit dua target DNA.
Kesederhanaan dan tingginya tingkat kesuksesan amplifikasi sekuens DNA yang
diperoleh menyebabkan teknik ini semakin luas penggunaannya (Saiki et al. 1988).
PCR didasarkan pada amplifikasi enzimatik fragmen DNA dengan
menggunakan dua oligonukleotida primer yaitu komplementer dengan ujung 5’dari
dua untaian skuen target. Oligonukleotida ini digunakan sebagai primer (primer PCR)
untuk memungkikan DNA template dikopi oleh DNA polimerase. Untuk mendukung
terjadinya annealing primer ini pada template pertama kali diperlukan untuk
memisahkan untaian DNA substrat melalui pemanasan.

2.5.1 Teknik PCR

Teknik PCR dapat dimodifikasi ke dalam beberapa jenis diantaranya (Yusuf
2010):
1. Restriction Fragment Length Polymorphism (RFLP)
Metode ini digunakan untuk membedakan organisme berdasarkan analisis
model derifat dari perbedaan DNA.
2. Inverse-PCR,
Metode ini digunakan ketika hanya satu sekuen internal yang diketahui.
Template didigesti dengan enzim restriksi yang memotong bagian luar daerah
yang akan diamplifikasi, fragmen restriksi yang dihasilkan ditempelkan dengan
ligasi dan diamplifikasi dengan menggunakan sekuen primer yang memiliki
 35

titik ujung yang memiliki jarak yang jauh satu sama lain dengan segmen
eksternal yang telah tergabung. Metode ini khusus digunakan untuk
mengidentifikasi ”sekuen antara” dari beragam gen.
3. Nested-PCR,
Proses ini memungkinkan untuk mengurangi kontaminasi pada produk selama
amplifikasi dari penyatuan primer yang tidak diperlukan. Dua set primer
digunakan untuk mendukung metode ini, set kedua mengamplifikasi target
kedua selama proses pertama berlangsung. Sekuens DNA target dari satu set
primer yang disebut primer inner disimpan di antara sekuens target set kedua
dari primer yang disebut sebagai outer primer. Pada prakteknya, reaksi pertama
dari PCR menggunakan outer primer, lalu reaksi PCR kedua dilakukan dengan
inner primer atau nested primer menggunakan hasil dari produk reaksi yang
pertama sebagai target amplifikasi. Nested primer akan menyatu dengan produk
PCR yang pertama dan menghasilkan produk yang lebih pendek daripada
produk yang pertama.
4. Quantitative-PCR
Teknik ini digunakan untuk pengukuran berulang dari hasil produk PCR.
Metode ini secara tidak langsung digunakan untuk mengukur kuantitas, dimulai
dari jumlah DNA, cDNA, atau RNA. Hasil dari metode ini juga menampilkan
copy dari sampel
5. Reverse Transcriptase (RT-PCR)
Metode ini digunakan untuk amplifikasi, isolasi atau identifikasi sekuen dari
sel atau jaringan RNA. Metode ini dibantu oleh reverse transcriptase
(mengubah RNA menjadi cDNA), mencakup pemetaan, menggambarkan
kapan dan dimana gen diekspresikan.
6. Random Amplified Polymorphic DNA ( RAPD )
Teknik ini bertujuan untuk mendeteksi polimorfisme pada tingkat DNA.
Metode ini dikembangkan oleh Welsh and Mc Clelland (1990) dengan cara
 36

mengkombinasikan teknik PCR menggunakan primer-primer dengan sequens

acak untuk keperluan amplifikasi lokus acak dari genom.

2.5.2 Prinsip Kerja PCR

Polymerase Chain Reaction (PCR) adalah metode untuk amplifikasi
(perbanyakan) primer oligonukleotida diarahkan secara enzimatik urutan DNA
spesifik. Teknik ini mampu memperbanyak sebuah urutan 105-106-kali lipat dari
jumlah nanogram DNA template dalam latar belakang besar pada sequence yang tidak
relevan (misalnya dari total DNA genomik). Sebuah prasyarat untuk memperbanyak
urutan menggunakan PCR adalah memiliki pengetahuan, urutan segmen unik yang
mengapit DNA yang akan diamplifikasi, sehingga oligonucleotides tertentu dapat
diperoleh. Hal ini tidak perlu tahu apa-apa tentang urutan intervening antara primer.
Produk PCR diamplifikasi dari template DNA menggunakan DNA polimerase stabil-
panas dari Thermus aquaticus (Taq DNA polimerase) dan menggunakan pengatur
siklus termal otomatis (Perkin Elmer/Cetus) untuk menempatkan reaksi sampai 30 atau
lebih siklus denaturasi, anil primer, dan polimerisasi. Setelah amplifikasi dengan PCR,
produk ini dipisahkan dengan elektroforesis gel poliakrilamida dan secara langsung
divisualisasikan setelah pewarnaan dengan bromida etidium.
PCR (Polymerase Chain Reaction) merupakan suatu teknik perbanyakan
(amplifikasi) potongan DNA secara in vitro pada daerah spesifik yang dibatasi oleh
dua buah primer oligonukleotida. Primer yang digunakan sebagai pembatas daerah
yang diperbanyak adalah DNA untai tunggal yang urutannya komplemen dengan DNA
templatnya. Proses tersebut mirip dengan proses replikasi DNA secara in vivo yang
bersifat semi konservatif.
PCR memungkinkan adanya perbanyakan DNA antara dua primer, hanya di
dalam tabung reaksi, tanpa perlu memasukkannya ke dalam sel (in vivo). Pada proses
PCR dibutuhkan DNA untai ganda yang berfungsi sebagai cetakan (templat) yang
mengandung DNA-target (yang akan diamplifikasi) untuk pembentukan molekul DNA
baru, enzim DNA polimerase, deoksinukleosida trifosfat (dNTP), dan sepasang primer
 37

oligonukleotida. Pada kondisi tertentu, kedua primer akan mengenali dan berikatan
dengan untaian DNA komplemennya yang terletak pada awal dan akhir fragmen DNA
target, sehingga kedua primer tersebut akan menyediakan gugus hidroksil bebas pada
karbon 3’. Setelah kedua primer menempel pada DNA templat, DNA polimerase
mengkatalisis proses pemanjangan kedua primer dengan menambahkan nukleotida
yang komplemen dengan urutan nukleotida templat. DNA polimerase mengkatalisis
pembentukan ikatan fosfodiester antara OH pada karbon 3’ dengan gugus 5’ fosfat
dNTP yang ditambahkan. Sehingga proses penambahan dNTP yang dikatalisis oleh
enzim DNA polimerase ini berlangsung dengan arah 5’→3’ dan disebut reaksi
polimerisasi. Enzim DNA polimerase hanya akan menambahkan dNTP yang
komplemen dengan nukleotida yang terdapat pada rantai DNA templat.

2.6 Marka DNA

Dalam dunia biologi molekular terdapat istilah “marka molekuler” (molecular
marker) atau dapat juga diartikan penanda molekuler. Pembahasan molekular dalam
biologi yang dimaksud adalah mengacu pada materi asam nukleat terutama DNA.
Seperti yang kita ketahui, DNA memiliki sekuens yang terdiri dari empat huruf yakni
A, T, G, dan C yang memiliki pola tertentu dalam urutannya. Pola-pola sekuens itulah
yang nantinya akan menjadi suatu marka atau penanda dengan ciri khas dari suatu
sekuens DNA. Untuk lebih gampangya adalah contoh marka jalan raya ada yang
berupa garis putus-putus dan garis yang tidak putus-putus. Garis itu memiliki ciri khas
tersendiri bagi suatu jalan raya begitu pula dengan marka molekular pada sekuens
DNA.
Pengertian marka molekuler juga disebut marka fenotipik adalah sekuen DNA
yang dapat diidentifikasi dengan suatu metode tertentu yang terdapat pada lokasi
tertentu dalam suatu genom serta dapat diwariskan dari satu generasi ke generasi
berikutnya. Kalau masih bingung, maka secara ringkas marka molekular yakni berupa
urutan DNA. Dengan berbagai metode identifikasi tertentu, maka urutan DNA itulah
yang nantinya akan menjadi suatu ciri khas dari pola urutan DNA.
 38

Namun ada juga yang mengatakan dengan lebih spesifik bahwa marka
molekular adalah suatu metode yang bertujuan untuk menunjukkan keberadaan suatu
urutan DNA pada suatu genom tertentu. Marka molekular pada umumnya berupa
daerah yang conserve alias daerah yang perubahannya sangat sedikit atau tidak
mengalami perubahan akibat berbagai faktor seperti mutasi, insersi, dan seleksi alam.
Karena marka molekular adalah urutan DNA yang bersifat conserve, maka daerah
tersebut juga diwariskan kepada keturunannya. Dengan adanya daerah conserve inilah
dapat dilakukan berbagai macam analisis untuk mengetahui karakter suatu DNA pada
mahkluk hidup.
Marka molekuler juga dikatakan marka genetik atau penanda molekular adalah
sekuens DNA yang dapat diidentifikasi dalam suatu genom pada lokasi tertentu serta
dapat diwariskan dari satu generasi ke generasi berikutnya. Penanda molekular juga
dapat diekspresikan serta dapat membentuk karakter fenotip sehingga dapat digunakan
untuk mengidentifikasi individu atau sel yang membawa informasi genetik tersebut.
Aplikasi dari penanda molekular sangat beragam sehingga pemilihan penanda
molekular harus disesuaikan dengan organisme yang akan diteliti dan jenis DNA yang
akan dianalisis sekuensnya. Penanda molekular dapat digunakan untuk analisis genom
DNA yang terdapat di nukleus, mitokondria, kloroplas, atau plasmid (Semagn et al.
2006).
Menurut Mondini et al. (2009), penggunaan penanda molekular memiliki
kelebihan yakni bersifat aplikatif karena dapat mendeteksi bagian genom baik berupa
intron, ekson, maupun daerah regulasi yang lain; tidak dipengaruhi oleh efek epistatis;
mampu mendeteksi adanya polimorfisme; dan beberapa diantaranya bersifat ko-
dominan yakni mampu mendeteksi alel pada lokus tertentu.
Azrai (2005) menyebutkan bahwa pemanfaatan penanda molekular sebagai alat
bantu seleksi Marker Assisted Selection (MAS) memiliki banyak keuntungan jika
dibandingkan dengan menggunakan seleksi secara fenotipik yang merupakan produk
kumulatif dari genotip dan lingkungan. Seleksi dengan cara menggunakan penanda
 39

molekular didasarkan pada sifat genetik saja yang tidak dipengaruhi oleh faktor
lingkungan.
Untuk mendeteksi adanya marka molekular, berikut adalah beberapa metode
atau teknik yang digunakan untuk mendeteksi keberadaan jenis marka molekuler
berbasis PCR antara lain:
1. RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphisms)
2. SSRs (Simple Sequence Repeats-SSRs)
3. AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphisms)
4. RAPD (Random Amplified Polymorphisms DNA)
5. STS (Sequence-Tagged Sites)
6. SCAR (Sequence Characterized Amplified Regions)
7. ISSR (Inter-Simple Sequence Repeat)
8. ESTs (Expressed Sequence Tags)
9. CAPs (Cleaved Amplified Polymorphic Sequences)
10. dCAPS (Derived Cleaved Amplified Polymorphic Sequences)
11. MPSS (Massively Parallel Signature Sequencing

2.7 Keragaman Genetik

Keanekaragaman genetik adalah segala perbedaan yang ditemui pada makhluk
hidup dalam satu spesie. Keanekaragaman genetik (genetic diversity) adalah suatu
tingkatan biodiversitas yang merujuk pada jumlah total variasi genetik dalam
keseluruhan spesies yang mendiami sebagian atau seluruh permukaan bumi yang dapat
didiami. Ia berbeda dari variabilitas genetik, yang menjelaskan kecenderungan
kemampuan suatu karakter/sifat untuk bervariasi yang dikendalikan secara genetik.
Keanekaragaman genetik merupakan variasi genetik dalam satu spesies baik di
antara populasi-populasi yang terpisah secara geografik maupun di antara individu-
individu dalam satu populasi. Individu dalam satu populasi memiliki perbedaan genetik
antara satu dengan lainnya. Variasi genetik timbul karena setiap individu mempunyai
bentuk-bentuk gen yang khas. Variasi genetik bertambah ketika keturunan menerima
 40

kombinasi unik gen dan kromosom dari induknya melalui rekombinasi gen yang terjadi
melalui reproduksi seksual. Proses inilah yang meningkatkan potensi variasi genetik
dengan mengatur ulang alela secara acak sehingga timbul kombinasi yang berbeda-
beda.
Keanekaragaman genetik adalah variasi karakteristik yang ada diwariskan pada
populasi spesies yang sama. Ini melayani peran penting dalam evolusi dengan
memungkinkan spesies untuk beradaptasi dengan lingkungan baru dan untuk melawan
parasit.
Terdapat beberapa cara untuk mengukur keanekaragaman genetika. Sebab-
sebab hilangnya keanekaragaman genetika pada hewan juga telah dikaji dan
diidentifikasi. Kajian tahun 2007 yang dilakukan oleh National Science Foundation
menemukan bahwa keanekaragaman genetik dan keanekaragaman hayati bergantung
satu sama lainnya, bahwa keanekaragaman dalam suatu spesies diperlukan untuk
menjaga keanekaragaman antar spesies.
 BAB III
METODOLOGI PRAKTIKUM

3.1 Waktu dan Tempat Praktikum

Praktikum bioteknologi perikanan mengenai “Pengenalan alat bahan dan
Sterilisasi Alat bahan” bertempat di Laboratorium Bioteknologi Gedung 3 Fakultas
Perikanan dan Ilmu Kelautan Universitas Padjadjaran, pada Hari Rabu tanggal 2019
pukul 13.30 – 15.30 WIB.
Praktikum bioteknologi perikanan mengenai “Isolasi DNA” bertempat di
Laboratorium Bioteknologi Gedung 3 Fakultas Perikanan dan Ilmu Kelautan
Universitas Padjadjaran, pada Hari Rabu tanggal 20 Maret 2019 pukul 13.30 – 17.00
WIB.
Praktikum bioteknologi perikanan mengenai “PCR” bertempat di Laboratorium
Bioteknologi Gedung 3 Fakultas Perikanan dan Ilmu Kelautan Universitas
Padjadjaran, pada Hari Rabu tanggal 27 Maret 2019 pukul 13.30 – 17.00 WIB.
Praktikum bioteknologi perikanan mengenai “Elektroforesis” bertempat di
Laboratorium Bioteknologi Gedung 3 Fakultas Perikanan dan Ilmu Kelautan
Universitas Padjadjaran, pada Hari Rabu tanggal 20 Maret 2019 pukul 13.30 – 17.00
WIB.

3.2 Alat dan Bahan Praktikum

3.2.1 Alat Praktikum
Alat-alat yang digunakan dalam praktikum bioteknologi perikanan adalah
sebagai berikut:
Tabel 1. Alat Praktikum
No Alat Fungsi
1. Analytical balance Menimbang sampel
2. Autoclave Sterilisasi alat dan bahan (sterilisasi)

41
 42

3. Botol Scott 100 ml Wadah dalam mencampurkan agarose dan TBE

Buffer
4. Centrifuge Memisahkan partikel-partikel berat dan ringan
pada proses ekstraksi
5. Cetakan agarose Mencetak agarose
6. Coolbox Media penyimpanan sampel
7. Corong Mempermudah memasukkan TBE Buffer kedalam
botol scott
8. Freezer dan Menyimpan sampel hasil ekstraksi dan reagen
Refrigerator ekstraksi
9. Gunting Mengambil Sampel
10. Jerigen Wada menyimpan aquades (sterilisasi)
11. Kit isolasi DNA Isoalsi DNA
12. Kuvet Meletakkan sampel dan blanko
13. Masker Melindungi wajah dari paparan bahan kimia
berbahaya (sterilisasi)
14. Microwave Menghomogenkan dan memanaskan bahan
pembuat agar
15. Mikropipet Mengambil larutan dalam satuan mikro
16. Mikrotips Menunjang mikropipet dalam mengambil larutan
17. Mikrotube 1.5 ml Wadah sampel
18. Nampan plastik Tempat memindahkan agarose dari bejana
elektroforesis ke larutan EtBr dan akuades
19. Parafilm Tempat menghomogenkan marker, loading dye,
dan sampel
20. Pinset Mengambil sampel
21. Plastic Warp Membungkus alat
 43

22. Plastik Tahan Membungkus alat saat sterilisasi (sterilisasi)

Panas
23 Power Supply Memberikan muatan pada saat running
elektroforesis
24. Rak mikrotube Tempat dudukan mikrotube
25. Sarung Tangan Mengambil sampel dan menjaga kesterilan
26. Sendok pipih Memindahkan gel agarose
27. Sisir Mencetak gel pada agarose
28. Spatula Mengambil bubuk agarose
29. Spektrofotometer Menghitung konsentrasi DNA
30. Sumpit plastik Menggerus sampel
31. Thermal Cycler Amplifikasi (penggandaan DNA)
PCR
32. Timer Penanda Waktu
33. Vortex Menghomogenkan larutan
34. Waterbath Menginkubasi sampel DNA
35. Wizard®Genomic Isolasi DNA
DNA Purification
Kit (Promega
36. Ziplock Membungkus alat dan bahan (sterilisasi)

3.2.2 Bahan Praktikum

Bahan-bahan yang digunakan dalam praktikum bioteknologi perikanan adalah
sebagai berikut:

Tabel 2. Bahan Praktikum

No Bahan Fungsi
1. Akuades Elektroforesis dan sterilisasi
 44

2. Bench Top DNA Marker (elektroforesis)

Ladder 1000 kb
3. Ethidium Bromide Memudahkan proses visualisasi dan identifikasi
(EtBr) fragmen (elektroforesis)
4. Gel agarose Media visualisasi DNA (elektroforesis)
5. Gel Red Pewarna (elektroforesis)
6. GoTaq®Green Ampilifikasi
Master Mix
(Promega)
7. Ikan Uji Sebagai sumber pembawa DNA
8. Ethanol 70%, Isolasi DNA
9. Isoprpanol Isolasi DNA
10. Larutan Tris Borate Dicampurkan dengan gel agarose (eletroforesis)
EDTA (TBE)
11. Loading dye Pemberat dan pewarna (elektroforesis)
12. Primer RAPD Amplifikasi
OPA-03 dan OPA-
16
13. Sterile Deionize Perhitungan konsentrasi DNA
Water (SDW)
14. Alumunium foil Alas saat menimbang bubuk gel agarose (sterilisasi)

3.3 Prosedur Praktikum

3.3.1 Pengambilan Sampel
Prosedur pengambilan dan persiapan sampel adalah sebagai berikut:
1. Bagian sirip ikan yang diamati diambil sebagai sampel, kemudian bagian sirip
dipotong menggunakan gunting bedah.
2. Jika sampel akan digunakan beberapa hari kemudian, sampel sirip dapat
disimpan dengan direndam pada larutan preservasi ( alcohol : gloserol = {4:1})
 45

3. Sampel disimpan pada suhu yang terjaga

4. Jika sampel akan digunakan, maka sampel ditimbang masing-masing 0.25 gr
dengan di alasi alumunium foil.

3.3.2 Proses Isolasi/Ekstraksi DNA

Prosedur proses isolasi/ekstraksi DNA adalah sebagai berikut:
1. Sebelum memulai kegiatan, buffer dipanaskan menggunakan waterbath pada
suhu 70˚C, kemudian waterbath disiapkan pada suhu 55˚C untuk tahap
selanjutnya.
2. 25 mg sampel dimasukan ke dalam mikrosentrifuge tube, kemudian ditambah
200 ml tissuelisis buffer yang digerus.
3. 40 ml protease ditambah pada sampel dan dihomogenkan.
4. Sampel di inkubasi selama 1 jam pada suhu 55˚C.
5. 200 ml poling buffer ditambah kedalam sampel lalu diinkubasi selama 10 menit
pada suhu 70˚C.
6. 100 ml isopropanol ditambah ke dalam sampel dan dihomogenkan.
7. High pute filter tube dimasukan pada collection tube, lalu cairan sampel
dipindahkan ke atas filter tube.
8. Sampel disentrifugasi selama 1 menit pada 8000 xg.
9. Cairan yang tersisa dibawahnya dibuang, kemudian ditambah 500 ml wash
buffer ke atas tube.
10. Sampel di sentrifugasi selama 1 menit pada 8000 xg.
11. Setelah disentrifugasi, cairan yang tersisa dibawahnya di buang.
12. 200 ml buffer yang sudah disimpan di waterbant pada suhu 70˚C ditambah ke
dalam microsentrifuge 1,5 ml yang baru.
13. Sampel di sentrifuge selama 10 detik pada 13.000 xg.
14. Cairan yang tersisa dibawahnya dibuang.
15. Template DNA pun sudah siap.
 46

3.3.3 Amplifikasi DNA dengan Teknik RAPD-PCR

Prosedur amplifikasi DNA dengan teknik RAPD-PCR adalah sebagai berikut:
A) Proses Amplifikasi
1) Tahap denaturasi DNA pada suhu 94 derajat selsius selama 1 menit
2) Tahap penempelan primer pada suhu 36 derajat selsius selama 1 menit
3) Tahap pemanjangan primer pada suhu 72 derajat selsius selama 2 menit
4) Proses tahapan diulang 45 siklus hingga diperoleh nukleotida
5) Suhu dan waktu pada mesin PCR diatur
6) Sampel yang sudah siap diamplifikasi dimasukakan ke dalam mesin
5) Mesin PCR dijalankan dengan suhu dan waktu yang sudah diatur
B) Penggunaan Alat PCR
1) Kabel Power supply dari alat PCR ke UPS kabel dari UPS ke stabilizer
dipasangkan ke stop kontak
2) Stabilizer – UPS - Tombol ON dialat PCR
3) Tombol Yang ada dialat PCR dibuka
4) Ditekan File - New - Program - Edit nama program - Enter
5) Menu STEPS ditekan lalu dimasukkan profile
6) Baris no 1: Pra denaturasi, temperatur 95 derajat selsius 180 detik lalu enter
7) Baris no 2: Denaturasi, temperatur 94 derajat selsius 45 detik lalu enter
8) Baris no 3: Annealing, temperatur 50 derajat selsius klik gradient ±4 lalu
enter
9) Tutup (Close)
10) Baris no 4: Extension, Temperatur 72 derajat selsius 120 detik(repeat 2)#
passes 34 lalu enter
11) Baris no 5: Final extension, temperatur 72 derajat selsius 420 detik lalu enter
12) Baris no 6: Hold, temperatur 42 derajat selsius 420 detik lalu enter
13) Save file
14) Sampel dimasukkan kedalam wheel yang akan di running
 47

15) Tekan Run – Start - pilih file yang akan dirunning - start now
16) Mesin akan running
17) Close dua kali untuk tampilan proses running dan akan terlihat fase running
18) Jika program telah selesai akan terliha pada screen mesin = Run Complete=

3.3.4 Elektroforesis
1. Gel agarose disiapkan dengan konsentrasi 1% dengan ditimbang bubuk agarose
0,5gr dan gel red 2µm.
2. Gel agarose disiapkan dengan konsentrasi 1% dengan ditimbang bubuk agarose
0,5gr
3. Bubuk agarose dimasukan dalam erlenmeyer dan ditambah 50mL TBE larutan
TBE dipanaskan yang telah dicampur dengan bubuk agarose hingga mendidih
dengan menggunakan microwave selama satu menit. Lalu agarose didinginkan
4. Gel agarose dan sisir disiapkan kemudian agarose dituangkan ke cetakan
agarose. Didiamkan 10 menit hingga beku.
5. Gel agarose yang dibekukan dimasukan di dalam larutan running buffer TBE
secara sub marine.
6. Hasil amplifikasi DNA diisi pada setiap sumur sel agarose dengan 4µl DNA
dan 2µl DNA ladder 1kb ditambah 2µl loading dye.
7. Pastikan seluruh gel agarose terendam sempurna di dalam larutan TBE. Tangki
elektroforesis yang berisi gel agarose dan larutan TBE diberi aliran listrik.
Proses elektroforesis berlangsung 70menit dengan voltage 75.
8. Setelah running selesai, gel agarose diambil dan dimasuk ke dalam mesin UV
transilluminator. Hasil elektroforesis didokumentasi dan dianalisis

3.4 Elektroforesis
Elektroforesis merupakan suatu metode untuk memisahkan fraksi suatu zat
berdasarkan migrasi partikel bermuatan atau ion-ion makromolekul di bawah pengaruh
medan listrik dengan media gel agarose. Sekuens mtDNA merupakan partikel
bermuatan negatif yang dapat dipisahkan melalui elektroforesis pada gel Agarose. Gel
 48

Agarose merupakan campuran dari larutan TBE 1x, bubuk Agarose, dan larutan
ethidium bromida yang kemudian dituangkan ke dalam cetakan yang berlubang.
Gel Agarose kemudian diletakan pada alat elektroforesis (Bio-Rad) kemudian
tambahkan larutan TBE 50 mL pada alat elektroforesis sampai tanda batas atau sampai
gel tenggelam. Sekuens mtDNA ditambahkan larutan Loading Dye kemudian
dimasukkan ke dalam cetakan sumuran pada gel. Elektroforesis berlangsung selama
kurang lebih 70 menit pada voltase 75.

3.5 Analisis Data

Data yang diperoleh dari hasil pengamatan laboratorium dipaparkan secara
deskriptif. Analisis data hasil elektroforesis amplifikasi DNA diolah atau
menggunakan bantuan software CorelDraw X7 agar ukuran larik DNA dapat dianalisi
secara spesifik dan teliti. Analisis dilakukan mulai dari jarak sumur gel ke bawah pada
ukuran fragmen DNA standar Lalu ukuran fragmentasi DNA standar dibuat nilai
logaritma yang kemudian dijadikan sumbu Y. Dan dengan bantuan Microsoft excel
dibuat persamaan garis linier y = ax+b dari jarak migrasi DNA standar dan log pb pada
PCR marker. Ukuran larik DNA hasil amplifikasi (dalam pb) dicari dengan
memasukkan nilai jarak migrasi DNA tersebut (sebagai nilai x). Hasil dari nilai y yang
didapat kemudian diubah menjadi antilog, hasil dari antilog menunjukkan ukuran basa
dari larik tersebut. Dan terkahir dengan bantuan NTSYSpc 2.02 akan didapatkan
gambar fenogram yang selanjutnya dianalisis berdasarkan gambar.
 BAB IV
HASIL DAN PEMBAHASAN

4.1 Hasil Isolasi/Ekstraksi DNA Genom

Pada praktikum yang telah dilakukan sampel yang digunakan pada
praktikum ini adalah sampel sirip dari ikan koi tidak berwarna. Praktikum
membahas mengenai matode isolasi DNA yang digunakan pada sirip ikan koi tidak
berwarna, Metode isolasi yang digunakan mengacu pada metode Izzah (2014)
dengan modifikasi. Praktikum ini menggunakan Metode Kit Komersial High Pure
PCR Template Preparation.
Isolasi DNA metode Kit Komersial High Pure PCR Template Preparation
dilakukan melalui beberapa tahap, pertama sampel dipotong pada bagian sirip
menggunakan gunting bedah, lalu ditibang sebanyak 0,025 gr. Sampel dimasukkan
dalam mikrotube steril ukuran 1,5 mL lalu tambahkan tissue lysis buffer 200 μL ke
dalam mikrotube, sampel dipotong-potong dengan gunting atau pestel lalu
ditumbuk dalam microtube sambal didekatkan ke es agar sample dan DNA nya
tidak rusak hingga benar-benar halus. Sirip ikan yang telah ditumbuk ditambahkan
lysis buffer untuk membantu menghancurkan sel dari sirip ikan. Setelah
penambahan lysis buffer akan terlihat bagian sirip ikan yang telah ditumbuk
menjadi lebih hancur dan lebur, hal ini dikarenakan lysis buffer berfungsi untuk
memecah dinding sel sampel.
Kemudian 40 μl proteinase K ditambahkan ke dalam larutan tersebut dan
diinkubasi selama 1 jam pada suhu 55oC. penambahan Proteinase K bertujuan untuk
menghancurkan dan memisahkan DNA dari protein. Setelah di inkubasi, sampel
sirip ikan telihat terpisah dan ada bagian yang terlarut dan terdapat bagian yang
menggumpal. Proteinase K ini merupakan enzim yang bertujuan untuk melisiskan
membrane pada sel darah (Khosraviani et al 2007) serta mendegradasi protein
globular maupun rantai polipeptida dalam komponen sel (Surzycki 2000) dalam
membantu terbentuknya endapan yang mengandung DNA dngan cara mencerna
protein. Sentrifugasi menghasilkan pelet dan supernatan, supernatan dipindahkan
kedalam mikrotube baru yang steril ukuran 1,5 mL, kemudian tambahkan 200 μL

49
 50

binding buffer dan inkubasi selama 10 menit pada suhu 70oC. Tambahkan 100 μL
isopropanol dan dihomogenkan selama 20 detik hingga bagian yang terlarut dan
menggumpal terlihat semakin jelas. Lalu sampel yang terlarut dipisahkan kedalam
collection tube yang telah terdapat high pure filter untuk mendapatkan DNA yang
murni dan di sentrifugasi dengan kecepatan 8000 rpm selama 1 menit.
Setelah disentrifugasi untuk mendapatkan DNA yang murni terbebas dari
isopropanol maka ditambahkan inhibitor removal buffer dan kembali di sentrifugasi
selama 1 menit. Hasil dari sentrifugasi terdapat dua bagian yaitu pada collection
tube dan pada high pure filter. Cairan yang ada didalam collection tube dibuang,
hal tersebut diulang sebanyak 3 kali. Masing-masing tube ditambahkan 500 μl Wash
Buffer (mengandung 100% ethanol) kemudian sentrifugasi kembali dengan
kecepatan 8000 rpm selama 1 menit. Pencucian dilakukan sekali lagi dengan Wash
Buffer (mengandung 100% ethanol) seperti sebelumnya sebanyak 3 kali. Wash
buffer berguna untuk membersihkan atau mencuci DNA dari inhibitor. Selanjutnya,
filter tube dilepaskan dari collection tube dan cairan yang melewati filter dibuang.
Filter tube dipasang kembali dengan collection tube dan dilakukan setrifugasi
kembali selama 10 detik dengan kecepatan 12000 rpm diasumsikan agar tidak ada
lagi wash buffer yang tertinggal pada filter.
Tahapan selanjutnya yaitu mengelusi DNA yang terdapat pada filter tube
dengan cara pisahkan collection tube dari filter tube dan pasangkan dengan
microsentrifuge tube yang bersih dan steril. Kemudian ditambahkan 200 μl Elution

Buffer yang sebelumnya telah dihangantkan pada suhu 70oC, lalu disentrifugasi
selama 10 detik dengan kecepatan 13.000 rpm. Elution buffer berfungsi untuk
mengikat DNA-DNA dari sampel yang diperoleh, kemudian disentrifugasi
sehingga DNA tertampung di microtube yang telah dilabeli. Pada microsentrifuge
tube telah mengandung tamplate DNA terpurifikasi dan disimpan pada suhu rendah
untuk dianalisa selanjutnya.
Berbagai metode isolasi DNA yang telah dilakukan dalam berbagai
penelitian memungkinkan kualitas dan kuantitas hasil DNA yang berbeda-beda.
Hasil yang diperoleh tergantung pada jenis metode yang digunakan dan ketelitian
dalam pengerjaan isolasi DNA. Teknik molekuler bervariasi dalam cara
 51

pelaksanaan untuk mendapat data, baik tekniknya maupun tingkatan target data
yang diinginkan sesuai kemudahan pelaksanaan, ketersediaan sumber daya
manusia, fasilitas, dan dana.
DNA yang murni harus bebas dari protein dan oligopeptida. Kontaminasi
oleh protein dapat berasal dari komponen sel yang tidak lisis selama proses isolasi
atau berasal dari fenol sebagai bahan yang ditambahkan pada proses isolasi untuk
mempresipitasi DNA (Bellard et al. 1973).

Gambar 8. Elektroforesis Hasil DNA Genom

Hasil isolasi DNA menggunakan metode DNA metode Kit Komersial High
Pure PCR Template Preparation didapatkan fragmen pita pada setiap ikan uji yang
ditunjukan dengan adanya pita DNA genom seperti pada gambar diatas. Fragmen
pita dihasilkan bervariasi karena terdapat perbedaan pada urutan nukleotida tempat
penempelan primer. Pita yang teramplifikasi sangat tergangtung dari kualitas,
kuantitas, kecocokan tamplate dan primer yang digunakan. Tempat penempelan
primer terdistribusi secara random disepanjang genom dan polimerfismenya pada
daerah ini menghasilkan amplifikasi yang berbeda-beda (Harris 1995). Pada
praktikum ini menggunakan primer OPA-03 dan OPA-06.
Hasil kuantitas DNA menunjukan bahwa nilai kemurnian pada masing
masing sampel berbeda dan tingkat konsentrasi DNA yang diperoleh berbeda-beda
pula. Hal ini mengakibatkan ketebalan pita yang beragam. Perbedaan konsentrasi
DNA yang diperoleh pada masing-masing sampel dapat ditentukan oleh perlakuan
fisik yang diberikan serta kemampuan buffer ekstraksi dalam memecah sel. Proses
 52

perusakan sel secara fisik dengan cara penggerusan sampel yang sempurna dapat
mempermudah buffer ekstraksi dalam memecah sel. Namun hasil elektroforesis
juga menunjukan hasil yang adanya materi lain yang ikut terisolasi sehingga
mengakibatkan kontaminasi. Terlihat pada gambar bahwa pita DNA genom banyak
yang nampak tipis walaupun ada beberapa yang tebal. Kontaminasi tersebut bisa
disebabkan oleh kontaminan dari udara luar dan protein yang berasal dari
komponen sel yang tidak selama proses isolasi atau berasal dari fenol sebagai bahan
yang ditambahkan pada proses isolasi untuk mempresipitasi DNA (Bellard et al.
1973).
Hasil isolasi yang baik memiliki warna pita yang terang, menandakan pada
proses isolasi tidak terjadi kontaminasi seperti pada sumur C8. Sedangkan pada
sumur C10 memiliki warna yang terang tetapi tidak terlihat adanya pita pada sumur
tersebut, hal ini bisa disebabkan oleh DNA yang terkontaminasi protein yang tidak
terlisis secara sempurna sehingga menyebabkan pita DNA tertutup. Pada tahap
presipitasi protein, lemak dan polisakarida yang masih tersisa dapat dihilangkan
dengan menggunakan garam.

4.2 Amplifikasi DNA dan Deteksi Polimorfisme

Amplifikasi DNA yang dilakukan dengan menggunakan 2 primer yang telah
diseleksi diantaranya OPA-03 (5’ -AGTCAGCCAC- 3’) dan OPA-06.
Amplifikasi DNA memerlukan banyak optimasi untuk dapat menghasilkan
hasil amplifikasi yang terbaik (semua sampel DNA ikan uji menghasilkan variasi
fragmen DNA). Optimasi dilakukan pada perancangan program mesin PCR
(Thermal Cycler) dan pemilihan primer. Perancangan program PCR dapat
dilakukan dengan menambah atau mengurangi suhu annealing (proses penempelan
primer pada DNA template) dari setiap tahap amplifikasi DNA. Selain dari suhu
annealing, waktu ekstensi pada setiap tahap amplifikasi DNA dapat ditambah atau
dikurangi untuk menghasilkan produk amplifikasi yang baik. Pemilihan primer
dilakukan dengan cara memilih primer yang menghasilkan pita polimorfik yang
tervisualisasi pada gel agarose. Pita pada gel agarose yang dihasilkan menunjukkan
bahwa urutan basa primer yang digunakan komplemen dengan DNA genon pada
 53

ikan uji. Optimasi komponen PCR dan kondisi thermal cycler akan tergantung pada
ukuran genom, kandungan basa nukleotida G C dari primer DNAN genom, dan
kualitas template (Saunders & Parkes 1999).

Gambar 9. Visualisasi Hasil PCR

Hasil amplifikasi DNA genom pada gambar diatas didapatkan fragmen pita
DNA yang dihasilkan oleh primer OPA-03 dan OPA-06 pada setiap sampel uji.
Banyak variasi dari fragmen yang dihasilkan karena terdapat perbedaan pada
ukuran nukleotida tempat penempelan primer. Kualitas, kuantitas, kecocokan
tamplate dan primer yang digunakan tergantung dari pita yang teramplifikasi. DNA
hasil ekstraksi di dalam template yang digunakan untuk PCR serta perbedaan
konsentrasi DNA yang berhasil diamplifkasi. Menurut McMillan & Palumbi (1997)
hasil amplifkasi lokus control region menunjukkan keberhasilan amplifkasi sebesar
50% dari seluruh sampel, yang dapat disebabkan karena tingginya variasi pada situs
penempelan primer dari lokus tersebut. Namun, tingginya variasi dalam lokus
tersebut diatasi dengan penggunaan primer depan yang berbeda, yaitu CRK dan
CRA. Padahasil amplifkasi lokus COI, rendahnya tingkat keberhasilan amplifikasi
dapat disebabkan karena urutan sekuen pada primer bukanmerupakan komplemen
dari situ penempelan primer (Bucklin et al. 2011).
Fragmen pita tersebut dapat dikelompokan menjadi dua ketegori yaitu pita
polimorfik dan pita monomorfik. Pita polimorfik adalah gambaran pita DNA yang
muncul pada ukuran tertentu, tetapi pada ikan uji lain tidak ditemukan pita DNA
dengan ukuran tersebut. Pita monomorfik adalah pita yang terdapat pada beberapa
 54

ikan uji dengan ukuran yang sama sehingga tidak memiliki variasi (Harris 1995).
Pita polimorfik ditentukan dengan meilhat pita DNA ukuran tertentu yang hanya
ditemukan pada ikan uji. Sedangkan pita monomorfik adalah pita yang timbul pada
beberapa ikan uji. Pita yang teramplifikasi oleh primer OPA-03 dan primer OPA-
06 berkisar antara 3,759-1.938 yang ditampilkan pada tabel.
Tabel 3. Pita Polimorfik dan Monomorfik Ikan Uji
Jarak
C1 C2 C3 C4 C5 C6 C7 C8 C9 C10
Fragmen
1,938
2,1 --*
2,238 -- -- --
2,42 -- --
2,517 -- -- -- -- --
2,674 -- -- -- --
2,78 -- --
2,923 -- -- -- --
2,978 --* --
3,108 -- -- -- -- -- --
3,234 -- --
3,354 -- --
3,478 -- -- --
3,759 --* --

Varisi pada berbagai ikan uji ditunjukan oleh pita polimorfik, sedangkan
kekerabatan antar ikan uji ditunjukan oleh pita monomorfik. Pita polimorfik dan
monomorfik yang muncul pada seluruh sampel uji yaitu sebanyak 15 pita. Ikan koi
yaitu pada kelompok C1 menunjukan jumlah pita polimorfik dan monomorfik yang
tervisualisasi paling banyak yaitu sebanyak 8 pita. Ikan dengan visualisasi pita
paling sedikit yaitu ikan komet (C4) dan ikan koki tidak warna (C10) yaitu
sebanyak 3 pita.
 55

Ada DNA ikan yang memvisualisasikan pita polimorfik yaitu ikan koi pada
jarak fragmen 2,978bp, ikan nilem pada jarak fragmen 3,759bp, dan terahir ikan
mas pada jarak fragmen 1,938bp. Hal ini menunjukan adanya variasi pada ikan koi,
ikan nilem, dan ikan mas. Pita polimorfik pada sampel ikan uji memunculkan
karakter morfometrik secara kuantitatif dan kualitatif. Perbedaan pada warna dan
sifat jinak untuk ditangkap merupakan ciri dari kualitatif, sedangkan bentuk tubuh,
pertumbuhan dan ciri fenotif lainya yaitu ciri kuantitatif. Trijoko dkk. (2013)
mengatakan bahwa sekuens nukleotida yang monomorfik ini kemungkinan
mengekspresikan kemiripan fenotip pada populasi tersebut, kemungkinan fenotip
yang sama ini dapat diketahui dari segi morfologis, anatomis, maupun fisiologis.

4.3 Analisis Kekerabatan Genetik Ikan Uji

Pohon kekerabatan didapatkan dari pita-pita yang muncul dari OPA-03 dan
OPA-06 dan diubah kedalam matrik biner kemudian diolah meggunakan program
NTSYS untuk mendapatkan fenogram atau pohon kekerabatan pada sampel ikan
uji. Berikut hasil amplifikasi yang disajikan dalam bentuk fenogram.
C1

C7

C6

C8

C2

C3

C4

C5

C9

C10

0.13 0.35 0.56 0.78 1.00

Coefficient

Gambar 10. Fenogram kekerabatan genetik ikan uji

Keterangan:
C1 : Ikan Koi C8 : Ikan Mas
C2 : Ikan Barbir C9 : Ikan Koki Berwarna
C3 : Ikan Barbir C10: Ikan Koki Tidak Berwarna
C4 : Ikan Mas Komet
C5 : Ikan Nila
C6 : Ikan Nilem
C7 : Ikan Nilem
 56

Berdasarkan fenogram hasil analisis UPGMA yang ditunjukan pada gambar

dengan menggunakan Primer OPA-3 dan OPA-6, dari 10 isolas DNA genom (ikan
koi, ikan nila, ikan nilem, ikan mas koki warna, ikan barbir, ikan mas, ikan mas
koki dan ikan komet) diperoleh 2 kelompok besar.
Berdasarkan gambar fenogram tersebut, diketahui bahwa nilai indeks
kesamaan yang tertinggi ditunjukkan oleh ikan koi dengan ikan nilem, yaitu sebesar
46%, yang artinya ikan nilem dan ikan koi memiliki tingkat kekerabatan paling
tinggi. Indeks kekerabatan tertinggi kedua adalah antara ikan koki berwarna dengan
ikan koki tidak berwarna, yaitu sebesar 44%. Sedangkan, kekerabatan antara ikan
barbir kelompok 2 dengan kelompok 3 yaitu sebesar 99%.
Ikan koi dan ikan nilem kelompok 7 dengan ikan nilem kelompok 6
memiliki tingkat perbedaan kekerabatan genetik sebesar 61%. Sementara itu, ikan
barbir kelompok 2, ikan barbir kelompok 3, dengan ikan mas komet memiliki nilai
sebesar 62%. Ikan koi, ikan nilem kelompok 7, dan ikan nilem kelompok 6 dengan
ikan mas komet memiliki tingkat perbedaan kekerabatan genetik sebesar 64%. Ikan
koi, ikan nilem kelompok 7, ikan nilem kelompok 6, dan ikan mas dengan ikan
barbir kelompok 2, ikan barbir kelompok 3, dan ikan mas komet memiliki tingkat
perbedaan kekerabatan genetik sebesar 72%. Ikan koki berwarna dan ikan koki
tidak berwarna dengan ikan nila memiliki tingkat perbedaan kekerabatan genetik
sebesar 60%. Sementara itu, ikan koi, ikan nilem kelompok 7, ikan nilem kelompok
6, ikan mas, ikan barbir kelompok 2, ikan barbir kelompok 3, dan ikan mas komet
dengan dengan ikan nila, ikan koki berwarna dan ikan koki tidak berwarna memiliki
tingkat perbedaan kekerabatan genetik sebesar 77,5%.
Nilai indeks kesamaan tertinggi didapatkan antara ikan koi dan nilem
kelompok 7 yaitu sebesar 46%. Nilai kekerabatan yang terendah ditunjukkan oleh
ikan koki berwarna dengan ikan koki tidak berwarna, yaitu sebesar 44%. Nilai
indeks perbedaan tertinggi didapatkan antara ikan koi, ikan nilem kelompok 7, ikan
nilem kelompok 6, ikan mas, ikan barbir kelompok 2, ikan barbir kelompok 3, dan
ikan mas komet dengan dengan ikan nila, ikan koki berwarna dan ikan koki tidak
berwarna yaitu sebesar 77.5%. Sedangkan, nilai indeks perbedaan terendah
 57

didapatkan dari ikan ikan koi dan nilem kelompok 7 dengan ikan nilem kelompok
6 yaitu sebesar 61%.
Nilai kekerabatan ikan yang lebih dari 50% dapat dikategorikan ke dalam
kategori yang tinggi. Artinya kedua ikan tersebut memiliki kesamaan warna, bentuk
tubuh, sirip dan ukuran kepala. Pernyataan itu menurut Mulyadi dkk (2017). Selain
itu, Kekerabatan yang tinggi kecil kemungkinan ikan tersebut memiliki perbedaan
jumlah, bentuk, dan susunan kromosom. Sedangkan nilai presentas yang kecil hal
ini menunjukan bahwa kedua ikan uji tersebut memilki kekerabatan yang jauh
dibandingkan keturunannya, namun secara fenotip kedua ikan uji tersebut dapat
memiliki kesamaan.
Mayr dan Ashlock (1991) berpendapat bahwa umumnya karakter morfologi
menggambarkan sebagian besar dari sifat genotip. Karakter morfologi sering
digunakan untuk melengkapi dan menambah luas karakter lain, untuk lebih
memperjelas sebab-sebab perbedaan pada karakter morfologi, maka perlu
digunakan karakter taksonomi lain seperti molekuler, kromosom, dan filogeni.
Hasil yang diperoleh dapat dipengaruhi oleh banyak hal, salah satunya
adalah oleh jumlah kromosom yang ada dalam individu jumlah kromosom dalam
satu set tiap spesies pada keadaan normal. Walaupun jumlah kromosom satu spesies
bisa sama dengan spesies lain. Tetapi berbeda dalam bentuk, ukuran, dan komposisi
gen – gennya. Hal ini sesuai dengan pernyataan Yatim 1991 dalam Sucipto 2012
bahwa jumlah kromosom satu spesies bisa sama dengan spesies lain tetapi berbeda
bentuk, ukuran dan komposisi gennya.
Selain itu, faktor yang mempengaruhi tinggi atau rendahnya nilai persentase
kekerabatan ikan dipengaruhi oleh habitat. Habitat yang sesuai merupakan syarat
utama bagi ikan Cyprinidae untuk hidup dan berkembang biak. Kelangsungan
hidup jenis ikan Cyprinidae tergantung dari kondisi perairan tempat hidupnya.
 BAB V
KESIMPULAN DAN SARAN

5.1 Kesimpulan
Hasil isolasi DNA menggunakan metode DNA metode Kit Komersial High
Pure PCR Template Preparation menghasilkan fragmen pita yang berbeda-beda
pada setiap sumur. Perbedaan ini terjadi karena penggunaan bahan uji yang
berbeda-beda dan juga perlakuan yang berbeda. Hasil isolasi yang baik memiliki
warna pita yang terang, menandakan pada proses isolasi tidak terjadi kontaminasi
seperti pada sumur C8. Sedangkan pada sumur C10 memiliki warna yang terang
tetapi tidak terlihat adanya pita pada sumur tersebut.
Varisi pada berbagai ikan uji ditunjukan oleh pita polimorfik. sedangkan
kekerabatan antar ikan uji ditunjukan oleh pita monomorfik. Pita polimorfik dan
monomorfik yang muncul pada seluruh sampel uji yaitu sebanyak 15 pita. Ikan koi
yaitu pada kelompok C1 menunjukan jumlah pita polimorfik dan monomorfik yang
tervisualisasi paling banyak yaitu sebanyak 8 pita. Ikan dengan visualisasi pita
paling sedikit yaitu ikan komet (C4) dan ikan koki tidak warna (C10) yaitu
sebanyak 3 pita.
Berdasarkan fenogram hasil analisis UPGMA diketahui bahwa nilai indeks
kesamaan yang tertinggi ditunjukkan oleh ikan koi dengan ikan nilem, yaitu sebesar
46%, yang artinya ikan nilem dan ikan koi memiliki tingkat kekerabatan paling
tinggi. Nilai kekerabatan yang terendah ditunjukkan oleh ikan koki berwarna
dengan ikan koki tidak berwarna, yaitu sebesar 44%.

5.2 Saran
Pada saat melakukan praktikum sebaiknya dilakukan dengan serius dan
berhati-hati karena bahan yang digunakan mudah mengalami kontaminasi dan
kerusakan, sehingga dapat merusak hasil yang didapat.

58
 DAFTAR PUSTAKA

Amri, K. dan Khairuman. 2002. Buku Pintar Budidaya 15 Ikan Konsumsi.

Agromedia. Jakarta.

Amri dan Khairuman. 2003. Budidaya Ikan Nila Secara Intensif. Agromedia
Pustaka. Jakarta.

Amri, K., dan Khairuman. 2008. Buku Pintar Budidaya 15 Ikan Konsumsi. Agro
Media Pustaka. Jakarta.

Arie U. 2000. Pembenihan dan Pembesaran Nila Gift. Jakarta: Penebar

Swadaya.

Ausubel, F. M. et al. 2003. Current Protocols in Molecular Biology. USA: John

Wiley & Sons, Inc.

Azrai, M. 2005. Pemanfaatan Markah Molekuler dalam Proses Sterilisasi

Pemuliaan Tanaman. Balai Penelitian Tanaman Serealla, Jalan Dr.
Ratulangi No 247, Maros. 1(1):26-37.

Bachtiar, Y. 2002. Pembesaran Ikan Di Kolam Pekarangan. Jakarta: Agro Media

Pustaka.

Bettelheim, F. A. & Landesberg, J. M. 2007. Laboratory Experiments for

General, Organic, and Biochemistry, 6th edition. Chaput, J.C. ISBN-13:
9780495015048.

Birren, B., E.D. Green, S. Klapholz, R.M. Myers, & J. Roskams. 1997. “Genome
Analysis. A Laboratory manual”. Volume 1. Cold Spring Harbour
Laboratory Press. New York. Halaman 621.

Brown, T. A. 2002. DNA in Genomes, 2nd ed.,

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/bv.fcgi/rid=genomes.section.5 234
http://blogcalondokter.wordpress.com/2010/replikasi-dantaksonomi-virus.

Bucklin, A., D. Steinke, & L. Blanko-Bercial. 2011. DNA Barcoding of Marine

Metazoa. Annu. Rev.Mar.Sci. 3:471-508.

Campbell, Neil A. 2004. Biologi. Edisi Kelima Jilid 3. Jakarta: Erlangga.

Cholik, F. et al. 2005. Akuakultur. Masyarakat Perikanan Nusantara. Taman

Akuarium Air Tawar. Jakarta.

Clark, Melody S. 1997. Plant Molecular Biology: A laboratory manual.

Corebima. 2004. Genetika Mendel. Surabaya: Airlangga University Press

59
 60

Corkill, G., Rapley, R. 2008. The Manipulation of Nucleic Acids: Basic Tools
&Techiques in Molecular Biomethods Handbook Second Edition. Ed:
Walker, J.M., Rapley, R. Humana Press, NJ, USA.

Djarijah, S, A. 2011. Pembenihan Ikan Mas. Yogyakarta: Kanisius.

Djoko Suseno. 2000. Sistematika dan Morfologi Ikan Mas (Cyprinus

carpiolinneaus). Agromedia Pustaka. Jakarta. Hal 27-30.

Dolphin, W. D. 2008. Biological investigations. New York: The McGraw-Hill

Companies, Inc.

Erlich, H.A. 1989. PCR technology: Principles and Applications for DNA
Amplifications Using a Pseudo-Testcross: Mapping Strategy and RAPD
Markers. Genetics 137, 1121-1137. Stockton Press, NY.

Fatchiyah. 2006. Gel Elektroforesis. Ph.D. Thesis. Laboratorium Sentral Biologi

Molekuler dan Seluler, Departemen Biologi, Universitas Brawijaya,
Malang. 12-13.

Giacomazzi, S., Leroi, F. and Joffraud, J.J. 2005. Biochemistry. Thomson

BroComparison of three methods of DNA extraction from cold-smoked
salmon and impact of physical treatments. Journal of Applied
Microbiology. 98:1230.

Hardjamulia A. 1979. Budidaya Perikanan. Budidaya Ikan Mas

(Cyprinus carpio L.), Ikan Tawes (Puntius javanicus), Ikan Nilem
(Ostheochilus hasselti). Sekolah Ilmu Perikanan. SUPM. Bogor.Badan
Pendidikan, Latihan dan Penyuluhan Pertanian. Dept. Pertanian. Hal
19. Harris GP. 1986

Hoelzel, A.R, et al. 1994. “Rapid Evolution of aheteroplasmic repetitive in the

Mitochondrial DNA Control Region of Carnivores”. Microbiology
&Molecular Biology. hlm 191-199.

Holme, D. J., and P. Hazel. 1998. E-book: Analytical Biochemistry Third Edition.
Pearson Education. England.

Jose, J. and R. Usha. 2000. Extraction of geminiviral DNA from a highly

mucilaginous plant (Abelmoschus esculentus). Plant Mol. Biol. Rep. 18:
349-355.

Karp, G.2008. Cell and molecular biology, conceps and experiment. New Jersey:
John Wiley & Son, Inc.

Keller, G. H &Mark M. M. 1989. DNA Probe. Macmilan: University Michgan.

 61

Khanna DR, Yadav PR. 2004. Biology of Fishes. New delhi: Discovery
Publishing House.

Khosravinia et al. 2007. Optimazing factorsinfluencing DNA extraction from

fresh whole avian blood. African Journal of Biotechnolody, Vol. 6(4), pp.
481-486.

KKP. 2012. Keputusan Menteri Kelautan dan Perikanan Republik Indonesia

Nomor Kep.47/Men/2012 tentang Pelepasan Nila merah nilasa. Kementrian
Kelautan dan Perikanan. Jakarta.

Kesner-Reyes K. 2010. Anodontostoma chacunda / Chacunda gizzard shad

(Hamilton 1822). [terhubung berkala]. www.fishbase.org. Diakses pada
tanggal 18 Mei 2019 Pukul 21.40 WIB.

Khosravinia, H. & Ramesha, K. P. 2007. Influence of EDTA and magnesium on

DNA extraction from blood samples and specificity of polymerase chain
reaction. African Journal of Biotechnology 6 (3), pp. 184-187.

Klug, W. S. & M. R. Cummings. 1994. Concepts of genetics. 4th ed. Prentice Hall,
Englewood cliffs: xvi + 779 hlm.

Lingga, P., & Susanto, H. 2003. Ikan Hias Air Tawar. Jakarta: Penebar Swadaya.

Lodhi, M, A., G.N.YE, N.F. Weeden, and B.I. Reisch. 1994. Asimple and efficient
method for DNA extraction from grapevine cultivars, Vitisspecies and
Ampelopsis. Plant Molecular Biology Reporter.12(1):6-1.3

Lubert, Styer. 2000. Biokomia. Vol I. Edisi 4. Jakarta: Penerbit Buku Kedokteran
EGC.

McMillan, W.O., & S.R. Palumbi. 1997. Rapid rate of control-region evolution in
Pacific butterflyfishes (Chaetodontidae). Journal of Molecular Evolution.
45:473–484.

Mondini, L.; Noorani, A.; Pagnotta, M.A.2009. Assessing Plant Genetic Diversity
by Molecular Tools. Diversity, 1, 19-35.

Moyo M, Amoo SO, Bairu MW, Finnie JF, & Staden J.V. 2008. Optimising DNA
isolation for medicinal plants. South African Journal of Botany 74:771-775.

Muladno. 2002. Teknologi Rekayasa Genetika. Bogor: Pustaka Wirausaha Muda.

Mulyadi, G.K., Ibnu, D.B., & Ujang, S. 2017. Analisis Kekerabatan Genetik Hibrid
Ikan Nilem (Osteochilus hasselti) dan Ikan Mas (Cyprinus carprio L)
Mengunakan PCR-RAPD. Jurnal Perikanan dan Kelautan. Vol. VIII No. 1
(42-47).
 62

Mulyasari. 2010. Karakteristik Fenotipe Morfometrik dan Keragaman Genotipe

RAPD (Randomly Amplified Polymorphism DNA) Ikan Nilem
(Osteochilus hasselti) di Jawa Barat. Tesis Program Pasca Sarjana, Institut
Pertanian Bogor. Bogor.

Narantaka, A. 2012. Pembenihan Ikan Mas. Jaralitera. Yogyakarta.

Nuryanto, A. 2001. Morfologi, Kariotip dan Pola Protein Ikan Nilem (Osteochilus
sp.) dari Sungai Cikawung dan Kolam Budidaya Kabupaten Cilacap. Tesis.
Program Pasca Sarjana. Institut Pertanian Bogor.

Partical Fish Keeping. 2013. Biologi Ikan Hias. Agromedia: Jakarta.

Porebski, S.L., Bailey, L.G., and Baum, B.R. 1997. Modification of CTAB DNA
extraction protocol for plants containing high polysaccharide and
polyphenol components. J. Plant Moleculer Biology Reporter 15(1): 8-15.

Purwanto. 2011. Keragaan Ikan Nila Best (Oreochromis niloticus) Hasil Seleksi
di Karamba Jaring Apung Danau Lido, Bogor. Skripsi. Institut Pertanian
Bogor. Bogor.

Ranjan, S, G, Kishore, V, S., J.P. Bhatt, and S, Gupta. 2010. Standardization of

extraction of genomic DNA and PCR-RFL Pconditions of Allium
stracheyi: high altitude plant. Academia Arena. 2(7): 11-14.

Richardson, B. J, Baverstock & Adams. 1986. Allozyme Electrophoresis. A

Handbook for Animal Systematics and Population Studies. Academic
Press, Inc. San Diego: 410 pp.

Rukmana, R. 1998. Budidaya Talas. Penerbit Kanisius. Yogyakarta.

Russel. 1992. Cinical Parasitology. Tropen Company. Philadelphia.

Saanin, H. 1986. Taksonomi dan Kunci Identifikasi Ikan. Bina Cipta. Jakarta. Hal
520.

Saanin H. 1984. Taksonomi dan Kunci Identifikasi Ikan. Jakarta: Bina Cipta.

Saiki, R.K., Gelfand, D.H., Stoffel, S., Schar, S., Higushi, R., Horn, G.T., Mullis,
K.B., and Erlich H.A. 1988. Primer-direct Enzymatic Amplification of
DNA with a Thermostable DNA Polymerase. Science. 239: 487-491.

Sambrook, J., & Russel. 2001. Molecular Cloning-A Laboratory Manual. New
York: Cold Spring Harbor Laboratory Press.

Santoso, B. 1993. Petunjuk Praktis Budidaya: Ikan Mas. Kanisius. Yogyakarta.

77p.
 63

Santoso, B. 1996. Budidaya Ikan Nila. Kanisius. Yogyakarta.

Santoso, R. H. 2011. Uji Coba Penggunaan Pelet yang Mengandung

Imunoglobulin-Y (Ig-Y) Anti Koi herpesvirus Sebagai Pencegah Penyakit
pada Ikan Mas (Cyprinus carpio). Skripsi. Departemen Ilmu Penyakit
Hewan dan Kesehatan Masyarakat Veteriner. Fakultas Kedokteran Hewan.
Institut Pertanian Bogor. 51 Hal.

Susanto, Heru. 2009. Pertanian dan Lingkungan Hidup. Jakarta : Penebar Swadaya.

Sarbahi DS. 1951. Studies Of The Digestive Tracts And The Digestive Enz ymes
Of The Goldfish, Carassius Auratus (Linnaeus) And The Largemouth
Black Bass, Micropterus Salmoides (Lacepede). Biological Bulletin
100:224-257.
Sargent, J. R. dan S. G. George. 1975. Methods in Zone Electrophoresis BDH
Chemical LTD. Poole England: 219 pp.

Saunders, G.C. and Parkes, H.C. 1999. Analytical Molecular Biology Quality and
Validation. Cambridge UK 29 – 80.

Sayid. 2019. Inilah 19 Umpan Ampuh Mancing Ikan Wader. http://resep-

masakan-ikanmujair.blogspot.com/2019/03/inilah-19-umpan-ampuh-
mancing-ikan-wader.html. Diakses pada tanggal 18 Mei 2019 Pukul 13.17
WIB.

Semagn, K. Bjornstad, A. Ndjiondjop, M, N. 2006. An overview of molecular

marker methods for plants. African Rice Center. 5(25). 2540-2568.

Setyo, S. 2006. Fisiologi Nila (Oreochromis niloticus). Kanisius. Jakarta.

Soewolo. 2005. Fisiologi Manusia. Malang: UM Press.

Sucipto, A. (2012). Kromosom dan Karyotipe Ikan. Melalui,

<http://www.adisucipto.com/2012/02/kromosom-dan-karyotipe-
ikan/>[07/04/13].

Surzycki, S. 2000. Basic Techniques in Molecular Biology. Spinger-Verlag.

Berlin. Heidelberg, New York.

Susanto, H. dan Rochdianto, A. 2007. Kiat Budidaya Ikan Mas di Lahan Kritis.
Penebar Swadaya. Jakarta.

Suyanto. 1993. Nila. Jakarta: Penebar Swadaya.

Suyanto, S.R. 2003. Nila. Penebar Swadaya. Jakarta.

Switzer. 1999. Experimental biochemistry. Oxford : Blackwell Scientific Pub.

 64

Titrawani. 1996. Biodiversiti Kodok Genus Rana Ditijau dari Morfologi, Kariotip
dan Pola Protein di Kodya Sawahlunto. Program Pasca Sarjana. Institut
Pertanian Bogor: 76.

Trijoko, N.S.N., Handayani, dan A. Feranisa. 2013. Karakterisasi Morfologi dan

Diversitas Genetik Hasil Persilangan Macrobrachium rosebergii (De Man,
1879) Populasi Samas, Bone dan Sintesis. Fakultas Biologi Universitas
Gadjah Mada. Yogyakarta.

Venville, G & Treagust, D. F. 2002. Teaching about the Gene in the

Genetic Information Age. Australian Science Teachers' Journal, 48 (2), pp.
20-24.

Verkuil, et al. 2008. Principles & Technicalm Aspects of PCR

Amplification. Berlin: Springer Science + Business Media.

Watson A, Craig H, Pouder EJ and Debora B. 2004. Species Profile: Koi and
Goldfish. SRAC Publication.

Walker, J. M. & Ralph R. 2008. Molecular Biomethods Handbook.

Yanong RPE. 2003. Necropsy Technique for Fish. Seminars in Avian and Exotic
Pet Medicine. Elsevier Inc; 12: 89-105.

Yusuf, Z. K. (2010). POLYMERASE CHAIN REACTION (PCR). Saintek Vol 5,

No 6, 1-6.
LAMPIRAN
 66

Lampiran 1. Alat

Autoclave
Botol Scott

Coolbox Corong

Gunting Freezer

Jerigen Kuvet

Mikrotube Parafilm
 67

Nampan Plastik Pinset

Plastik Wrap Rak Microtube

Sarung Tangan Sendok Pipih

Spatula Sumpit Plastik

Timer
Tanki Elektroforesis
 68

Ziplock Power Supply

Sisir Microwave

Waterbath Spektrofotometer

Thermal Cycler PCR Analytical Balance

Centrifuge Vortex
 69

Lampiran 2. Bahan

Ethanol 70% Ethidium Bromide (EtB

Gel Red Isopropanol

Loading Dye Parafilm

Tris Borate EDTA (TBE) Sterile Deionize Water

 70

Aquades Go Taq® Green Master Mix

Wizard® Genomic DNA Purification Kassa

Kit

Alkohol 96%
 71

Lampiran 3. Prosedur Kegiatan

 Persiapan Sampel

Bagian sirip ikan yang diamati diambil sebagai sampel, kemudian bagian sirip
dipotong menggunakan gunting bedah

Jika sampel akan digunakan beberapa hari kemudian, sampel sirip dapat
disimpan dengan direndam pada larutan preservasi ( alcohol : gloserol = {4:1} )

Sampel disimpan pada suhu yang terjaga

Jika sampel akan digunakan, maka sampel ditimbang masing-masing 0.25 gr

dengan di alasi alumunium foil.
 72

 Isolasi sampel
Sebelum memulai kegiatan, buffer dipanaskan menggunakan waterbath pada
suhu 70˚C, kemudian waterbath disiapkan pada suhu 55˚C untuk tahap
selanjutnya

25 mg sampel dimasukan ke dalam mikrosentrifuge tube, kemudian ditambah

200 ml tissue lisis buffer yang digerus

40 ml protease ditambah pada sampel dan dihomogenkan

Sampel di inkubasi selama 1 jam pada suhu 55˚C

200 ml poling buffer ditambah kedalam sampel lalu diinkubasi selama 10 menit
pada suhu 70˚C

100 ml isopropanol ditambah ke dalam sampel dan dihomogenkan

High pute filter tube dimasukan pada collection tube, lalu cairan sampel
dipindahkan ke atas filter tube.

Sampel disentrifugasi selama 1 menit pada 8000 xg

Cairan yang tersisa dibawahnya dibuang, kemudian ditambah 500 ml wash

buffer ke atas tube
 73

Sampel di sentrifugasi selama 1 menit pada 8000xg

Cairan yang tersisa dibawahnya di buang

200 ml buffer yang sudah disimpan di waterbant pada suhu 70˚C ditambah ke
dalam microsentrifuge 1,5 ml yang baru

Sampel di sentrifuge selama 10 detik pada 13.000 xg

Cairan yang tersisa dibawahnya dibuang

Template DNA sudah siap

 74

 Prosedur PCR

Go taq green master mix, NFW, primer RAPD (OPA-02 &OPA 03) serta DNA
templete dimasukan dalam tube

Sampel didenaturasi pada suhu 94˚C selama 1 menit.

Sampel memasuki proses anneling pada suhu 36˚C selama 1 menit

Sampel memasuki tahap extention pada suhu 72˚C selama 2 menit.

Sampel memasuki tahap final extention pada suhu 72˚C selama 10 menit.

Sampel yang sudah siap dimasukkan dalam mesin thermal sucker yang sudah
diatur suhu dan waktu. (4˚C dalam 1 siklus).
 75

 Prosedur Elektroforesis

Gel agarose disiapkan dengan konsentrasi 1% dengan ditimbang bubuk agarose

0,5gr dan gel red 2µm

Gel agarose disiapkan dengan konsentrasi 1% dengan ditimbang bubuk agarose

0,5gr

Bubuk agarose dimasukan dalam erlenmeyer dan ditambah 50mL TBE larutan
TBE dipanaskan yang telah dicampur dengan bubuk agarose hingga mendidih
dengan menggunakan microwave selama satu menit. Lalu agarose didinginkan

Gel agarose dan sisir disiapkan kemudian agarose dituangkan ke cetakan

agarose. Didiamkan 10 menit hingga beku.

Gel agarose yang dibekukan dimasukan di dalam larutan running buffer TBE
secara sub marine.

Hasil amplifikasi DNA diisi pada setiap sumur sel agarose dengan 4µl DNA
dan 2µl DNA ladder 1kb ditambah 2µl loading dye.

Pastikan seluruh gel agarose terendam sempurna di dalam larutan TBE. Tangki
elektroforesis yang berisi gel agarose dan larutan TBE diberi aliran listrik.
Proses elektroforesis berlangsung 70menit dengan voltage 75.

Setelah running selesai, gel agarose diambil dan dimasuk ke dalam mesin UV
transilluminator. Hasil elektroforesis didokumentasi dan dianalisis
 76

Lampiran 4. Dokumentasi Kegiatan

1) Isolasi DNA

Sampel sirip ikan Sampel sirip ditimbang 25 mg

Sirip dimasukkan kedalam

Sampel ditambahkan lysis buffer
mikrotube dan ditumbuk

Sampel dimasukkan kedalam

Sampel diinkubasi selama 1 jam
sentrifugasi dan disentrifugasi

Pemisahan sampel yang tidak

Sampel ditambahkan elution buffer
terlarut
 77

Sampel disentrifugasi Template DNA yang sudah jadi

2) PCR

Larutan my taq mix dimasukkan Larutan my taq mix dihomogenkan

Larutan ditambahkan Nuclease free Ditambahkan Primer OPA 3

water (NFW)

DNA template dimasukkan dalam

DNA template
mikrotube (2 mL)
 78

3) Dokumentasi Kegiatan Elektroforesis

Bubu agarose dan TAE dicampur Bagian atas botol scott ditutup dan
dalam botol scott dilubangi

Dimasukkan kedalam mikrowave

Sisir dipasang
selama satu menit

TAE, Agarose dan Gel red dituang Proses Elektroforesis

 79

Lampiran 5. Perhitungan hasil amplifikasi DNA

X (Jarak C C C C C C C C C C Y (Nilai Y (jarak
Fragmen) 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 Log) BP)
1,938 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 2,9430658 86,69619
2,1 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 2,87731 125,8925
2,238 0 1 1 0 0 0 0 0 1 0 2,8212958 172,9816
2,42 1 0 0 1 0 0 0 0 0 0 2,747422 263,0268
2,517 1 1 1 0 1 0 0 1 0 0 2,7080497 328,8516
2,674 1 0 0 0 0 1 1 1 0 0 2,6443234 472,063
2,78 1 0 0 0 0 0 0 1 0 0 2,601298 602,5596
2,923 1 0 0 0 1 0 1 0 1 1 2,5432543 837,5293
2,978 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 2,5209298 950,6048
3,108 1 1 1 1 0 1 1 0 0 0 2,4681628 1282,331
3,234 1 0 0 0 0 0 0 0 1 0 2,4170194 1713,957
3,354 0 0 0 0 0 1 0 1 0 1 2,3683114 2259,436
3,478 0 0 0 0 0 1 0 0 1 1 2,3179798 3006,076
3,759 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 2,2039219 5741,165

Matriks Biner
JARAK C1 C2 C3 C4 C5 C6 C7 C8 C9 C10
1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
2 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0
3 0 1 1 0 0 0 0 0 1 0
4 1 0 0 1 0 0 0 0 0 0
5 1 1 1 0 1 0 0 1 0 0
6 1 0 0 0 0 1 1 1 0 0
7 1 0 0 0 0 0 0 1 0 0
8 1 0 0 0 1 0 1 0 1 1
9 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0
10 1 1 1 1 0 1 1 0 0 0
11 1 0 0 0 0 0 0 0 1 0
12 0 0 0 0 0 1 0 1 0 1
13 0 0 0 0 0 1 0 0 1 1
14 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0