INFORME DE PRÁCTICA # 04

SEPARACION DE COLORANTES POR CROMATOGRAFIA DE COLUMNA

Ronald Cadavid1; Isabella Valencia2; Yulis Elena Zuñiga3; David Alfredo

Burbano Vargas; Ingrid Catalina Jimenez5.
Universidad Nacional Abierta y a Distancia. Escuela de Ciencias Básicas,
Tecnología e Ingeniería – ECBTI. Cromatografía. Grupo # 1 CEAD: Palmira.
Palmira- Colombia.
Sesión 2:
Entrega Informe: xxxxxx

Estudiante Correo electrónico Código

Ronald
Ronal.cadavid@gmail.com 94480490
Cadavid1
Isabella
ivalenciapr@unadvirtual.edu.co 1113680055
Valencia2
Yulis Elena
yezunigab@unadvirtual.edu.co 1192895026
Zúñiga 3
David Alfredo
Daburbanov@unadvirtual.edo.c
Burbano 1130640632
o
Vargas 4
Ingrid
catalinajimenezlar@hotmail.co
catalina 1116273529
m
Jimenez 5

RESUMEN
En esta práctica se elabora la empaquetadura de la columna cromatografica,
la cual será necesaria para realizar la separación de colorantes por el método
de cromatografía de columna. En el proceso de separación se emplean
diferentes solventes en variadas proporciones y momentos, con el fin de,
lograr que los pigmentos presentes en la muestra problema sean arrastrados
por toda la columna y finalmente obtenidos.
Palabras claves: Cromatografía de
separación, columna cromatográfica
OBJETIVOS
GENERAL
 Determinar las caracteristicas de
separacion de colorantes por
cromatografía de columna.
ESPECÍFICOS
 Identificar diferentes solventes
orgánicos como fase móvil en
la cromatografía de columna.
 Reconocer las características
de separación en
cromatografía de columna.
CONCEPTOS TEÓRICOS
CROMATOGRAFIA DE COLUMA:
Los compuestos que se encuentran
disueltos en la fase móvil, poco a
poco saldrán de la columna
cromatográfica, y se recogen en
fracciones. Las fracciones menos
polares, que son por lo general las
que se retienen poco o nada en el
absorbente, serán las primeras en
salir de la columna. En cambio, las
sustancias más polares, quedan
retenidas por más tiempo en el
columna, pigmentos, colorantes,
absorbente, y a menudo es
necesario el uso de diferentes
disolventes con la finalidad de
incrementar su polaridad para que
sean arrastradas por estos.
El tiempo que se necesita para
hacer fluir un compuesto por la
columna, se conoce con el nombre
de tiempo de retención. Este tiempo
varía, siendo característico de cada
compuesto en una condiciones
cromatográficas determinadas, que
varían según el absorbente usado, el
disolvente, la presión, el diámetro
que tenga la columna utilizada, etc.
El absorbente mayormente utilizado
para las cromatografías en columna,
es el gel de sílice. A veces, en
sustitución del gel de sílice, cuando
éste es incompatible con la mezcla a
cromatografiar, se utilizan
la alúmina o el florisil (silicato
magnésico). La cromatografía en
columna puede realizarse por
gravedad o a media presión. Cuando
se realiza a media presión, se
conecta la cabeza de la columna a
un compresor o a una línea de aire
comprimido.
Para elegir el disolvente, primero se
lleva a cabo una cromatografía en
capa fina de la muestra a analizar.
El disolvente debe producir una
buena separación de los
componentes de la mezcla en la
placa, colocando el componente
menos polar a un Rf cercano a 0.3.
En el caso de columnas pequeñas, lo
ideal es usar un eluyente menos
polar que el conseguido en el
resultado de la cromatografía en
placa.
A veces se utilizan mezclas de
disolventes y se hace una elución en
gradiente. Para esto, la
cromatografía se inicia con una
mezcla de disolventes de polaridad
adecuada para poder separar el
componente que posea mayor Rf, y
así, una vez recogido, se aumentará
poco a poco la polaridad para poder
ir separando los componentes más
polares. Si cuando se empieza la
cromatografía se usa un disolvente
excesivamente polar, los
componentes de la mezcla eluirán
conjuntamente, lo que llevaría a que
la separación no tenga lugar. Una de
las mezclas de disolventes más
utilizadas es hexano/acetato de
etilo.
COLUMNA CROMATOGRAFICA: Es
una columna de vidrio vertical que
se llena con un soporte sólido
adsorbente (fase estacionaria: los
más utilizados son gel de sílice
(SiO2) y alúmina (Al2O3)). La
muestra que se quiere separar se
deposita en la parte superior de este
soporte. El resto de la columna se
llena con el eluyente (disolvente que
constituye la fase móvil) que, por
efecto de la gravedad, hace mover
la muestra a través de la columna.
Se establece un equilibrio entre el
soluto adsorbido en la fase
estacionaria y el disolvente eluyente
que fluye por la columna.
COLORANTE: El colorante es un
término genérico para
toda sustancia química capaz de
producir toda gama de tinte para
dar color a productos de la industria
textil, cosmética y alimentaria.
CLOROFILAS: Las clorofilas son una
familia de pigmentos de color verde
que se encuentran en las
cianobacterias y en todos aquellos
organismos que contienen
cloroplastos en sus células (plantas
y protistas), es crítica en la
fotosíntesis, proceso que permite a
los organismos absorber energía a
partir de la luz solar y transformarla
en compuestos orgánicos y oxígeno.
Las clorofilas tienen típicamente dos
grupos de absorción en el espectro
visible:
En la zona de la luz azul (400-500
nm) (clorofila b)
En la zona roja del espectro (600-
700 nm). (clorofila a)
Las clorofilas reflejan la parte media
de color verde (500-600 nm)
CAROTENOS: Sustancia amarilla,
roja o naranja del grupo carotenoide
con función antioxidante, que se
encuentra principalmente en las
plantas, como la zanahoria,
el boniato, los vegetales de hojas
verde oscuro y en muchas frutas,
granos y aceites. Algunos
carotenoides se transforman en
vitamina A en el cuerpo y algunos
están en estudio para prevenir el
cáncer. El carotenoide es un tipo de
antioxidante y de provitamina.
Poseen una coloración rojiza y
anaranjada. Dentro de estos
contamos con:
 Beta carotenos (ß-caroteno):
son precursores de la vitamina
A. Se trata de un pigmento
vegetal que, una vez ingerido,
se transforma en el hígado y
en el intestino delgado en
vitamina A. Es un componente
antioxidante que favorece la
no aparición del cáncer,
especialmente el de pulmón,
boca y estómago. También se
ha demostrado que previene
la aparición de enfermedades
del corazón.
 Alfa caroteno (α-caroteno):
mejor antioxidante que el ß-
caroteno, aparece en los
mismos alimentos que este
aunque en una proporción
menor.
 El licopeno: El licopeno, un
compuesto presente en el
tomate de ahí su coloración
roja. Sus propiedades son
similares a los ß-carotenos de
las zanahorias, son
anticancerígenos. El licopeno
parece reducir las
probabilidades de cáncer de
próstata, pulmón, estómago,
vejiga, pulmón, estómago y
cuello del útero. Tiene además
las propiedades de disminuir
el colesterol en la sangre y
prevenir las inflamaciones de
la próstata.
  La cripto xantina: también es capsorubina. También tiene
mejor antioxidante que los ß- propiedades antioxidantes.
carotenos, aparece en los
mismos alimentos que este
aunque en una proporción PARTE EXPERIENTAL
menor.
MATERIALES

XANTOFILAS:  Espinaca
Los carotenoides se dividen en  Columna cromatografica
carotenos que son hidrocarburos  Balanza analítica
insaturados y en xantofilas que son  Espátula
derivados oxigenados de los  Mortero
anteriores.  Pinzas
Las Xantofilas Poseen una de  Embudo
coloración amarillenta y parda.  Papel filtro
Dentro de las xantofilas más  Pipeta aforada de 5 y 10 mL
importantes son:  Pipeteador
 Vasos de precipitado
 La luteína: Pigmento
 Probeta de 50 mL
liposoluble de color
 Erlenmeyer
amarillento que aparece
en algas, bacterias y plantas  Tubos de ensayo
superiores. Su función sería la  Gradilla
de proteger la planta contra la  Algodón
radiación solar. Esta misma
propiedad resulta eficaz para REACTIVOS
proteger la retina humana de
las radiaciones UV del sol.  Alumina
 Acetona
 Zeaxantina: Sus propiedades
 Éter de petróleo
son similares a la luteína.
 La capsantina: Es un pigmento
que se encuentra en PROCEDIMIENTO
los pimientos rojos junto con
otros carotenoides como la
PARTE I: EXTRACCION
PIGMENTOS NATURALES:
1. Se pesaron 5 g de espinaca.
2. Se macero la espinaca en un
mortero.
3. Se adicionaron 10 mL de eter
de petroleo y acetona en
relacion 8:2.
DE 4. Se continuo macerando hasta
que las hojas de espinaca
persieron su color y la mezcla
de solventes tomo un color
verde intenso.
5. Se filtro el solvente.
6. Se guardo la muestra filtrada
en un tubo de ensayo.

PARTE II: COLUMNA 4. Se adiciono en la columna

CROMATOGRAFICA PARA
PIGMENTOS NATURALES:
1. Se adicionaron 5 mL de eter de
petrleo en un vaso de
precipitado.
2. Se coloco la columna en un
soporte universal. Se ubico el
vaso debajo de la columna.
3. Se abrio la llave de la columna
cromatográfica y se humedecio
un pedazo de algodón con éter
de petróleo y se introdujo en la
columna, hasta que cubrio
aproximadamente 1.5 cm de la
punta de la columna, dejando
la parte más delgada de la
columna libre, con el fin de
evitar obstruir su
funcionamiento y el paso del
eluyente.
arena de mar hasta que se
tuvo una capa aproximada de
1 cm o menos. Se cerro la
llave de la columna
cromatográfica.
5. Se mezclo en un vaso de
precipitado 20 g de alúmina
con 30 mL de éter de petróleo.
Se agito la mezcla hasta que
se obtuvo una suspensión.
6. Se llevo la mezcla del numeral
5 a la columna con ayuda de
un embudo y varilla de
agitación, evitando la
formación de espacios de aire,
con el fin de tener una buena
empaquetadura.
7. Se abrio la llave de la columna
cromatográfica y se recogio el
exceso de éter de petróleo a
medida que atravesaba la
columna. Se enrasó la columna
 con el disolvente (éter de
petróleo) y se paso
nuevamente con el fin de
limpiar las paredes. se evito
que la fase estacionaria de la
columna quedara seca cuando
se recogia el exceso de éter de
petróleo, ya que la
empaquetadura se puede
obstruir por acción del aire.
8. Se adicionó en la columna
arena de mar hasta que se
tuvo una capa aproximada de
1 cm o menos.
9. Se aseguró que el éter de
petróleo estuviera por encima
de la última capa que se
adicionó de arena de mar y se
cierró la llave de la columna
cromatográfica.
de arena de mar que se empaquetó
en la columna, se adicionó éter de
petróleo hasta observar una
separación completa.
3. se recogió en tubos de ensayo el
pigmento
separado(aproximadamente 10 mL).
4. se adicionó acetona y se esperó
que se presentara la separación de
las clorofilas.
5. Cuando el segundo pigmento
atraveso la primera capa de arena de
mar que se empaquetó en la
columna, se adicionó acetona hasta
observar una separación completa.
ANEXAR FOTOS

PARTE III: SEPARACIÓN

CROMATOGRÁFICA DE PIGMENTOS
NATURALES

1. se adicionó la muestra (extracto

de espinaca) a la columna, se abrio
la
llave y se observó el desplazamiento
de los pigmentos a través de la
columna.
Fase movil y fase estacionaria:
2. Cuando el primer pigmento
atravesó la primera capa
Es el momento en el que se adiciona
el analito en este caso espinaca y se
empieza a separar.

las clorofilas son los pigmentos

responsables de la función
fotosintética que realizan las plantas,
las algas y muchos protistas. La
la clorofila b que caracteriza a los
clorofila a tiene su máximo
plastos de las algas verdes y de sus
deabsorción de la luz a 420 nm y
descendientes las plantas terrestres
690 nm.
(Viridiplantae). Esos plastos, y los
organismos que los portan, son de
color verde
Las xantófilas son derivados las células macerando los pigmentos
oxigenados de los carotenoides, que se hallan en los cloroplastos
usualmente sin ninguna actividad dentro de ellas, logramos obtener
clorofila a y b que por ser pigmentos
como vitamina A. La criptoxantina es
primarios presentan una absorción
una excepción, ya que tiene una superior a los demás pigmentos, los
actividad como vitamina A algo carotenos y xantofilas por ser
superior a la mitad de la del beta- pigmento accesorio (absorben
caroteno. energía que la clorofila es incapaz de
absorber)no tiene una participación
RESULTADOS muy importante en e proceso de a
fotosíntesis pero si son vitales para
Al observar las diferentes resultados la protección de las clorofilas por
de la cromatografia en columna tener mayor resistencia a la
vemos cuatro resultados que fotoxidación
corresponden a los distintos
pigmentos fotosinteticos presentes Las clorofilas y carotenos presentan
en las hojas de espinaca, según su una absorción baja que es donde se
grado de solubilidad con eter de presenta el color verde cuando las
petroleo y acetona clorofilas se descomponen,
comienzan a verse los carotenos y
Se logro la extracción de pigmentos xantofilas que se ven de color
de acuerdo al nivel de color así: amarillos y verdes.
Verde claro: colofia a
Verde oscuro sedimento scuro: CUESTIONARIO
clorofila b con caroteno
¿Qué características debe tener la
Amarillo claro: xantofila fase móvil y la fase estacionaria para
que se presente una correcta
elución?
La cromatografía en columna utiliza
ANALISIS DE RESULTADOS una columna de vidrio vertical que se
llena con un soporte sólido
adsorbente (fase estacionaria: los
Esta técnica se basa en las diferentes más utilizados son gel de sílice
polaridades de los pigmentos (SiO2) y alúmina (Al2O3)). La
contenidos en la espinaca, al romper muestra que se quiere separar se
deposita en la parte superior de este
soporte. El resto de la columna se
llena con el eluyente (disolvente que
constituye la fase móvil) que, por
efecto de la gravedad, hace mover la
muestra a través de la columna. Se
establece un equilibrio entre el
soluto adsorbido en la fase
estacionaria y el disolvente eluyente
que fluye por la columna. Debido a
que cada uno de los componentes de
una mezcla establecerá interacciones
diferentes con la fase estacionaria y
la móvil, serán transportados a
diferentes velocidades y se
conseguirá su separación. Así, de
manera similar a otros tipos de
cromatografía, las diferencias en las
velocidades de desplazamiento a
través del medio sólido se
corresponden con diferencias en los
tiempos de elución por la parte
inferior de la columna para cada uno
de los componentes de la muestra
original, que se recogerán en
fracciones diferentes.
La polaridad del eluyente afecta las
velocidades relativas con las que los
diferentes componentes de la mezcla
se mueven en la columna. Los
disolventes polares compiten más
eficientemente con las moléculas
polares de una mezcla por los
lugares polares del adsorbente. Por
lo tanto, un disolvente polar
desplazará las moléculas, incluyendo
las más polares, rápidamente a
través de la columna. Si el disolvente
es muy polar la elución será muy
rápida y generalmente habrá poca
separación de los componentes de la
mezcla. Si por el contrario el
disolvente es muy apolar, no
eludirán los compuestos de la
columna. Por lo tanto, la elección del
eluyente es crucial para el éxito de la
cromatografía en columna. A
menudo se utiliza un gradiente
creciente de polaridad para la
elución. La CCF se utiliza para
determinar y elegir el sistema
solvente adecuado para cada
separación.
En 1978 se introdujo una versión
modificada denominada
cromatografía en columna rápida. La
diferencia con la cromatografía en
columna tradicional es que en la
técnica rápida el disolvente se hace
atravesar la fase estacionaria
aplicando una presión positiva. Esto
hace que las separaciones mejoren
en resolución y se pueda disminuir el
tiempo de elución, por lo cual
constituye un método de elección.
¿Los experimentos realizados, se
pueden replicar para cromatografía
de capa fina y de papel? Justifique su
respuesta.
No porque la cromatografía de papel
es un método cualitativo mientras
que con la cromatografía de columna
obtenemos un método cuantitativo.
CONCLUSIONES

En esta practica se aprendio

que los vegetales tienen
diferentes tipos de pigmentos
qu lo conforman del mismo se
aprendio a utilizar aspectos
importantes en el laboratorio.

Debido a la polaridad de los

pigmentos es posible su
separacion con disolventes
apolares con los pigmentos.

Los pigmentos primarios tienen

el mayor indice fotosintetico en
la espinaca mientraas que los
pigmentos accesorio
mantienen y estabilizan los
pigmentos primarios
BIBLIOGRAFÍA

 Cromatografía en columna | La Guía de Química. (2019). Retrieved

from https://quimica.laguia2000.com/general/cromatografia-en-
columna
 Operaciones Básicas en el Laboratorio de Química. Cromatografía.
Cromatografía en Capa Fina y en Columna. (2019). Retrieved from
http://www.ub.edu/oblq/oblq%20castellano/cromatografia_tipus.html
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