CUESTIONARIO PARA DISCUSIÓN

EXTRACCIÓN ADN PLASMIDICO

1. ¿Qué fenómenos químicos y biológicos ocurren cuando se adiciona cada una de las
soluciones de lisis alcalina?
Sol 1: la glucosa y el tris se encargan de estabilizar el material genético y protegerlo
mientras que el EDTA se encarga de desestabilizar la pared celular bacteriana
uniéndose a cationes divalentes como Mg2+y Ca2+, debilitando la pared celular
Sol 2: El SDS provoca lisis celular, “disuelve” los fosfolípidos de las membranas
celulares y desnaturaliza las proteínas. Mientras que el NaOH desnaturaliza el DNA
plasmídico y cromosomal
Sol 3: El medio es neutralizado con el ácido acético glacial bajo condiciones con alta
concentración salina (acetato de potasio) las el DNA cromosomal se re-naturaliza
parcialmente ya que es muy largo y por tanto no logra establecer bien sus puentes de
hidrógeno y forma un agregado junto con el SDS, las proteínas, los lípidos y otros
componentes celulares (se “atrapa” en el precipitado SDS/proteínas/lípidos). Al
centrifugar, solo el DNA plasmídico y moléculas de RNA se encuentran en el
sobrenadante.
2. ¿Por qué se prefiere hacer la extracción con Fenol : Cloroformo:ISOAMILICO, y qué
pasaría si se omitiera este paso?
Esta sustancia es la que se encarga de precipitar las proteínas a la fase orgánica
separando el DNAp y si no se ocupara el DNAp no seria separado en su totalidad
teniendo una importante contaminación en la extracción.
3. ¿Cuáles son los elementos básicos de un plásmido?

4. ¿Qué tipo de plásmidos existen?

• Propiedades de Transferencia
o Conjugativos
o Non conjugativos
• Efectos fenotípicos
o F + : Fertilidad
o Col: Bacteriocinas
o R: Resistencia
o Ent: Enterotoxinas
o Vir: Virulencia
o Productores tumores en plantas
Clonacion y expresion y 3 más cosmidos, bacteriofagos etc.
5. ¿Qué otro tipo de vectores existen?
http://www.ibiantech.com/vectores-de-clonacion/
6. ¿A que se debe la presencia de múltiples bandas correspondientes al plásmido? ¿Cómo
puede saberse el tamaño real del plásmido?
7. ¿Qué es una mini, midi y maxiprep?
8. ¿Por que 260, 280 en cada una que estoy leyendo y 230 (compuestos fenolicos)?

A 230 nm absorben contaminantes como sales caotrópicas, fenoles o carbohidratos.

Los ácidos nucleicos absorben eficientemente luz a 260 nm debido a la presencia de
bases nitrogenadas. Las proteinas tienen un máximo de absorción a 280 nm.
9. Discutir el plásmido que extrajeron en la sesion de laboratorio...pBluescript...
http://tesis.ipn.mx/bitstream/handle/123456789/18662/TESISDOCTORADO.pdf?
sequence=1

10.HISTORIA Plásmido pBR322, pUC18 y TOPO...alguno nuevo para usar en

aplicaciones farmacéuticas, ambientales o de alimentos

11. TIPOS DE VECTORRES...CLONACION Y EXPRESION

http://sgpwe.izt.uam.mx/files/users/uami/pacopp/3-VECTORES_DE_CLONACION.pdf

12.¿Que es la alfa complementación o escrutinio blancas azules?

Cuando una bacteria tiene una deficiencia de alguna función se ingresa un plasmido para
que pueda recuperar la función
http://sgpwe.izt.uam.mx/files/users/uami/pacopp/3-VECTORES_DE_CLONACION.pdf

13.¿Qué es un vector cointegrado y uno binario...desarmados?

Los vectores co-integrados resultan de la integración de un plásmido foráneo pequeño al
plásmido TI de la cepa desarmada de Agrobacterium , mediante un proceso de
recombinación. Para obtenerlas, el plásmido residente Ti debe ser modificado mediante un
proceso de recombinación, que permite eliminar los genes responsables de la formación de
tumores en la planta. Estos vectores, se obtienen a partir de un plásmido Ti (inductor de
tumores) desarmado, que contiene el borde izquierdo y el plásmido foráneo, que contiene
el gen de interés flanqueado por el borde derecho y una región homóloga al borde
izquierdo; la recombinación se lleva a cabo por un evento de entrecruzamiento de regiones
homólogas de los dos plásmidos, dando como resultado un solo plásmido.

Los vectores binarios (sistemas en trans) es la estrategia más empleada. Estos vectores, se
derivan de plásmidos que se replican en E. coli y en A. tumefaciens, no necesitan integrarse
al plásmido Ti y se mantienen como plásmidos independientes, dentro de la célula
bacteriana.

14.¿Por que 260, 280 en cada una que estoy leyendo y 230 ?
A 230 nm absorben contaminantes como sales caotrópicas, fenoles o carbohidratos.
Los ácidos nucleicos absorben eficientemente luz a 260 nm debido a la presencia de
bases nitrogenadas. Las proteinas tienen un máximo de absorción a 280 nm.

15. ¿Cómo saber que el plásmido tiene inserto?

ELECTROFORESIS
1. fundamento de todos los reactivos
2. ¿Cuál es el principio básico de la separación por electroforesis?
3. ¿Qué colorantes pueden utilizarse para la visualización de ácidos nucleicos?
¿Cuál es el principio por el que estos colorantes funcionan?
4. ¿Existe, además de estos colorantes y la luz UV otro método para cuantificar
y analizar los ácidos nucleicos?
5. ¿Qué tipo de contaminantes es posible visualizar en el gel de agarosa?
 6. ¿Qué tipo de contaminantes es posible suponer se encuentran presentes por
medio e la relación de absorbancias 260/280?

Un valor A260/280 < 1.6 indica una posible contaminación por compuestos
aromáticos como fenoles y proteínas. Un radio A260/280 > 2.1 podría
deberse a la presencia de ARN en la muestra.

7. ¿Qué problemas generan en cuanto al uso de los ácidos nucleicos la

presencia de este tipo de contaminantes?
8. ¿Por qué es diferente el coeficiente de extinción molar para los diferentes
tipos de ácidos nucleicos (ADN, ADN de cadena sencilla, ARN) si todas
estas moléculas están compuestas por las mismas bases nitrogenadas?

ACTIVIDAD

TRAER POR EQUIPO UN MODELO DE LAS ISOFORMAS DEL ADN PLASMIDICO (

EXPRESA TU CREATIVIDAD)Y UNA IMAGEN DE COMO LO VERIAS EN EL GEL
DE LA ELECTROFORESIS.

CON REFERENCIA BIBLIOGRAFICA