ARETHA MEDIKA UTAMA

Biomolecular and Biomedical Research Center

HASIL UJI WESTERN BLOT

A. Nama Peneliti :
B. Institusi :
C. Sampel : Lisat protein dari kulit tikus
D. Parameter :
 Pengujian Western Blot untuk mendeteksi ekspresi protein XXX pada jaringan kulit

PROSEDUR

Bahan:
 Lisat protein dari jaringan kulit
 Antibodi primer anti-XXX
 Antibodi Sekunder (terkonjugasi dengan Horse Radish Peroxidase)
 Running Buffer
 Transfer Buffer
 Blocking solution
 Chemiluminescent Substrate
 RIPA Buffer
 Protease Inhibitor
 Phospatase Inhibitor
 LDS sample buffer

Alat:
 Electrophoresis dan Western Blot module
 Western Blot Scanner
 ARETHA MEDIKA UTAMA
Biomolecular and Biomedical Research Center

Cara Kerja:
Proses western blot membutuhkan beberapa langkah khusus, yaitu:
 Persiapan sampel
 Elektroforesis (SDS-PAGE)
 Transfer protein/Blotting
 Deteksi protein dengan antibodi
 Blocking membrane
 Deteksi protein target.

Prosedur
Protein dari jaringan kulit diekstraksi dengan mencampurkan jaringan kulit dengan RIPA lysis
buffer (20 mM Tris-HCl pH 7.5; 150 mM NaCl; 1 mM Na2EDTA; 1 mM EGTA; 1% NP-40; 1%
sodium deoxycholate; 2.5 mM sodium pyrophosphate; 1 mM β-glycerophosphate; 1 mM
Na3VO4; 1 ug/mL leupeptin) ditambah 1 mM protease inhibitors and 1 mM phospastase
inhibitor. Lisat jaringan disentrifugasi dengan kecepatan 15,000 x g, 4°C selama 15 menit.
Supernatan dipisahkan dan kemudian kadar protein diukur dengan metode lowry.
Sampel protein dengan kuantitas yang sama dicampurkan dengan LDS sample buffer dan di
denaturasi dengan cara dipanaskan pada suhu 100 derajat Celcius selama 5 menit. Sampel
kemudian di elektroforesis dalam gel SDS-PAGE. Protein pada gel di transfer ke membran
nitroselulosa. Kemudian membran di inkubasi dengan blocking solution (1 % susu dalam PBST)
selama 1 jam, dilanjutkan dengan inkubasi dengan antibodi primer anti-XXX selama 1 malam
pada suhu 4 derajat. Selanjutnya membran di inkubasi dengan antibodi sekunder (terkonjugasi
dengan Horse Radish Peroxidase) selama 2 jam pada suhu ruangan. Kompleks antigen-antibodi
dideteksi dengan WesternSure ECL Substrate, dan divisualiasikan dengan LICOR C-Digit
Western Blot Scanner. Analasi ketebalan pita protein dilakukan dengan bantuan perangkat lunak
Image J (NIH Image). Anti-GAPDH antibody digunakan sebagai loading control.
ARETHA MEDIKA UTAMA
Biomolecular and Biomedical Research Center

Western blot workflow

ARETHA MEDIKA UTAMA
Biomolecular and Biomedical Research Center
 ARETHA MEDIKA UTAMA
Biomolecular and Biomedical Research Center
HASIL PENELITIAN

A. Kurva standar AKT1 Total

AKT Abs abs cor

rata2 rata2
(ng/ml) 1 2 1 2
10 2.0400 2.0220 2.0310 1.9795 1.9615 1.9705
5 1.1150 1.1240 1.1195 1.0545 1.0635 1.0590
2.5 0.6380 0.6390 0.6385 0.5775 0.5785 0.5780
1.25 0.3430 0.3380 0.3405 0.2825 0.2775 0.2800
0.625 0.2150 0.2090 0.2120 0.1545 0.1485 0.1515
0.3125 0.1360 0.1390 0.1375 0.0755 0.0785 0.0770
0 0.0590 0.0620 0.0605 -0.0015 0.0015 0.0000
 ARETHA MEDIKA UTAMA
Biomolecular and Biomedical Research Center
B. Kandungan AKT1 Total pada setiap sampel

abs abs coreccted akt total (ng/ml)

treatment rata2 Rata2 SD
1 2 3 1 2 3 1 2 3
K562
kontrol 2.6110 2.7497 2.4435 2.5505 2.6892 2.3830 2.5409 12.78 13.49 11.93 12.74 0.78
k ima 10 0.9570 0.9964 0.8714 0.8965 0.9359 0.8109 0.8811 4.38 4.58 3.95 4.30 0.32
k ima 20 0.8906 0.8120 0.5923 0.8301 0.7515 0.5318 0.7045 4.04 3.64 2.53 3.40 0.79
k acu 50 1.5043 1.5012 3.6118 1.4438 1.4407 3.5513 2.1453 7.16 7.15 7.15 7.15 0.01
k acu 25 3.7932 3.5000 3.2067 3.7327 3.4395 3.1462 3.4395 16.56 17.30 15.81 16.56 0.75
K MTC4 5 0.5996 0.5645 0.5702 0.5391 0.5040 0.5097 0.5176 2.56 2.39 2.41 2.45 0.10
K MTC4 10 0.5724 0.5481 0.5901 0.5119 0.4876 0.5296 0.5097 2.43 2.30 2.52 2.41 0.11
K MTC7 5 0.5801 0.5669 0.5634 0.5196 0.5064 0.5029 0.5096 2.46 2.40 2.38 2.41 0.04
K MTC7 10 0.7092 0.6634 0.6659 0.6487 0.6029 0.6054 0.6190 3.12 2.89 2.90 2.97 0.13

AKT (A serin-Threonin Kinase) merupakan factor prognosis pada kasus leukemia. AKT
ditemukan pada sebagian besar pasien LMA (Leukemia Mieloblastik Akut). Fosforilasi AKT
menghasilkan proteksi terhadap apoptosis dan peningkatan proliferasi (Martelli etal.,2006).
Seluruh perlakuan baik control obat imatinib dan senyawa kalkon menunjukkan hasil yang
efektif dalam menghambat pertumbuhan sel leukemia K562 yaitu dengan menghambat ekspresi
AKT Total. Ekspresi AKT Total lebih rendah pada semua perlakuan jika dibandingkan dengan
control sel K562 tanpa perlakuan, namun hasil yang berbeda ditunjukkan oleh satu perlakuan
yaitu pada perlakuan acutan 25ug/ml yang menunjukkan ekspresi AKT Total yang dihasilkan
lebih tinggi dibandingkan control.