Fermentación en un tanque agitado para la producción de

compuestos con actividad antimicrobiana a partir de Bacillus

sp.

Diego Carmona R1, Arys Leudo1, Santiago López R1, Laura Montoya M1, Carolina
Pilonieta U1, Deisy Andrea Posada1, Maria Camila Toro T1 & Víctor Osorio E2

1. Estudiantes de Biotecnología. Institución Universitaria Colegio Mayor de Antioquia.

2. Docente de Biotecnología. Institución Universitaria Colegio Mayor de Antioquia.
victor.osorio@colmayor.edu.co

Resumen. Una de las necesidades actuales de la industria farmacéutica es

la búsqueda de nuevos compuestos antibióticos, debido a que los
compuestos de uso más común están presentando menor actividad y
eficiencia en el momento de usarlos. Uno de los géneros bacterianos
reportados como productores de metabolitos secundarios con actividad
antimicrobiana, es Bacillus. El objetivo de este proyecto fue evaluar la
actividad antimicrobiana de un extracto obtenido mediante fermentación
sumergida en erlenmeyer evaluando dos sustratos no convencionales de
bajo costo (avena en polvo y harina de yuca) y uno convencional (almidón
soluble) a diferentes concentraciones (5g/L, 10g/L, y 20g/L). Una vez
obtenidas las mejores condiciones de crecimiento celular y actividad
antimicrobiana de los extractos producidos por Bacillus sp., se realizó el
montaje en biorreactor donde se evaluaron velocidades de aireación (0,5,
1,0 y 2,0 vvm). El mejor sustrato para la actividad antimicrobiana de
extractos producidos en erlenmeyer fue el almidón aunque en reactor se
evaluó la producción usando harina de yuca en el cual se alcanzó un mayor
crecimiento celular con una aireación de 1.0 vvm.

Palabras clave: Bacillus sp., actividad antimicrobiana, metabolitos secundarios

crecimiento celular, sustrato no convencional.
2014).
La producción de metabolitos secundarios
1. INTRODUCCIÓN biológicamente activos se le atribuye a diversos
microorganismos (Negrón et al., 2013), estos al
Los productos naturales juegan un papel igual que otros organismos vivos, han
importante a la hora de descubrir compuestos desarrollado una capacidad de supervivencia y
con un alto potencial de curar enfermedades. sostenibilidad, que, debido a una selección
Los recursos naturales son una fuente de evolutiva, han obligado al predominio de unas
metabolitos secundarios y constituyen un especies y la desaparición de otras. Muchas
recurso económico importante para la especies permiten la obtención de metabolitos
búsqueda de nuevos compuestos con secundarios, importantes para la industria
diferentes capacidades bioactivas que farmacéutica como las penicilinas,
favorecen a industrias farmacéuticas, aminoglicósidos, tetraciclinas, cefalosporinas,
cosméticas y alimentarias (Devi & Prabakaran, entre otros antibióticos (Cruz & Díaz 2010).

1
Estos compuestos pueden actuar bajo
diferentes mecanismos, por ejemplo: inhibiendo
la síntesis de la pared celular como los de
grupo de penicilinas; inhibiendo la síntesis de
proteínas como las tetraciclinas y también
causan mala lectura de código de m-ARN
(Abdeen et al., 2016).
A esta búsqueda de nuevos compuestos
provenientes de microorganismos, se suma el
desarrollo de cepas más eficientes con mayor
capacidad de crecer sobre sustratos
alternativos económicos para lograr la
producción de antibióticos de manera rentable
(Faes et al., 2005). De hecho el desarrollo de
nuevas tecnologías para obtener productos
químicos de gran volumen está basado en el
uso de sustratos abundantes y económicos,
tales como los residuos agroindustriales y otros
sustratos no convencionales (Osorio, 2009).
Algunos microorganismos con propiedades
patógenas pertenecen al género Bacillus, este
género de bacterias de la familia Bacillaceae,
comprenden más de 50 especies y está
subdividido en seis grupos, considerando la
variedad morfológica y metabólica de cada
especie. Por la capacidad que posee este
género para la síntesis de metabolitos con
actividad antifúngica y antibacteriana ha sido
utilizado en control biológico de fitopatógenos.
(Ragazzo-Sánchez et al., 2011).
Partiendo de este punto, el interés de esta
investigación se centrará en evaluar la
actividad antimicrobiana de un extracto
obtenido mediante fermentación sumergida en
erlenmeyer y en biorreactor empleando una
cepa de Bacillus sp, ya que éste es un agente
de biocontrol con alta capacidad de producción
de lipopeptidos, metabolitos primarios y
secundarios con amplio espectro antibiótico y
poder supresor frente algunos patógenos (Ariza
& Sánchez, 2007), ya que algunos compuestos
producidos por Bacillus sp., como lo son la
surfactina, fengicina, iturina, bacilomicinas y
biosurfactantes activos cuentan con potentes
actividades antimicrobianas (Muaaz et al.,
2007).
2
2. METODOLOGÍA
Microorganismos
Este proyecto se llevó a cabo en diferentes
etapas en un primer momento para las pruebas
de antagonismo se trabajó con seis aislados
consistentes con Bacillus sp nombrados de la
siguiente manera: B.subtilis, B.subtilis A, B.
subtilis B, D4, P23 Y P23*. Como testigos se
utilizaron tres microorganismos de interés
clínico: Staphylococcus aureus ATCC 29213,
Escherichia coli ATCC 700891 y Candida
albicans ATCC 90028. Tanto para la etapa de
Erlenmeyer como en Biorreactor se trabajó con
el aislado P23 y con el testigo S. aureus .Todos
los microorganismos mencionados fueron
donados por la Institución Universitaria Colegio
Mayor de Antioquia.
Reactivación de Bacillus sp., y
Staphylococcus aureus
Este se encontraba a -20°C en caldo BHI con
glicerol. Dicha bacteria se reactivó en agar LB y
se incubó a 37 °C por 24h.
Pruebas de antagonismo
Se evaluó la actividad antagónica de seis
aislados consistentes con Bacillus sp. Las
cuales fueron: B. subtilis, B. subtilis A, B.
subtilis B, D4, P23 y P23*. Como testigo se
utilizó: Staphylococcus aureus ATCC 29213.
Las bacterias mencionadas anteriormente
fueron donadas por la institución Universitaria
Colegio Mayor de Antioquia. Para la prueba de
antagonismo las bacterias se reactivaron en
agar LB para las bacterias 24h horas.
Se evaluaron dos técnicas: difusión en disco y
estrías. Para ambas, se preparó una
suspensión bacteriana de cada aislado y del
microorganismo testigo en agua peptonada al
0.1% estéril, hasta alcanzar una concentración
celular correspondiente a un patrón McFarland
0.5.
Para el método de difusión en disco, se
inocularon 8µl de la suspensión bacteriana en
discos de papel filtro de 5 mm de diámetro, por
duplicado, ubicados en la superficie de un agar
Muller Hinton. Se incubaron a 37 °C por 48
horas y posteriormente se sembró el testigo por
extensión alrededor de los discos, incubando
nuevamente por 24 horas. Como control
positivo se utilizó una solución de 30mg de
tetraciclina en 10ml de agua destilada y como
control negativo se utilizó agua peptonada.
Para el método de estrías, se inocularon 8µl de
los aislados de Bacillus sp., en agar Mueller
Hinton realizando una estría con una extensión
en el diámetro de la caja y se incubaron a 37oC
por 48 horas. Posteriormente se sembraron
10µl del microorganismo testigo sobre la
superficie del agar haciendo una estría
perpendicular a la del Bacillus sp., reincubando
a 37oC durante 24 h.
Los resultados de ambos métodos se evaluaron
de manera cualitativa.
Montaje en erlenmeyer
Se utilizaron erlenmeyer de 100ml con tapones
de gasa y 20 ml de medio esterilizados a 121°C
por 20 minutos. La composición del medio de
cultivo fue en: extracto de levadura 1, CaCl 2
0.03, K2HPO4 3, KH2PO4 6, MgSO4 7H2O 0.2,
NaNO3 1.2, MnSO 4 0.01. Se ajustó el pH de 7.0
con HCl y NaOH al 0.1M.
Se evaluaron tres fuentes comerciales de
carbono diferentes: avena en polvo, harina de
yuca y almidón soluble. Cada una se añadió en
3 diferentes concentraciones (5g/L, 10g/L, y
20g/L), con un control negativo correspondiente
al medio sin inocular.
Para estos ensayos se utilizó una suspensión
del aislado P23 preparada en agua peptonada
hasta alcanzar un 2% v/v. Se incubaron los
medios a una temperatura ambiente por 48
horas a 150 rpm.
Se hizo un diseño experimental completamente
aleatorio con un arreglo factorial, con dos
factores y tres niveles cada uno, con tres
repeticiones de cada tratamiento, para un total
de 36 unidades experimentales.
Ensayos de actividad
Se centrifugo 1ml de cada uno de los medios a
3
12000rpm por 10 minutos a 4°C, el
sobrenadante se utilizó para realizar las
pruebas de inhibición.
Dichas pruebas se realizaron en placas de 96
pozos usando como testigo una suspensión de
Staphylococcus aureus preparada como se
mencionó anteriormente, siguiendo las
indicaciones de la CLSI. Para la verificación de
la actividad a cada pozo se agregaron 10µl del
extracto, 10µl del testigo y 80µl de caldo
triptona soya (TSB), se tuvo como control
negativo 90µl de medio TSB y 10µl de testigo,
como control positivo 10µl de tetraciclina, 80µl
de medio TSB y 10µl de testigo y como control
de pureza 10µl de extracto y 90µl de medio
TSB, se utilizó como blanco 100µl de medio
TSB. Cada extracto se evaluó por triplicado. La
absorbancia se determinó a una longitud de
onda de 600nm en un lector de microplacas.
Montaje en biorreactor
Se utilizaron tres Biorreactores de tanque
agitado con una capacidad de 10L y una turbina
de disco. Se trabajó al 50% de su capacidad
volumétrica. El inoculo correspondió a un 4%
del volumen total; este fue preparado por
suspensión de colonias del aislado P23
obtenidas en agar LB con 24 horas de
incubación, hasta alcanzar una concentración
correspondiente con un patrón McFarland de
1.0.
Los Biorreactores fueron desinfectados con
jabón líquido, hipoclorito de sodio, etanol al
96% y agua destilada. Cada reactivo se aplicó
por duplicado y posteriormente se removieron
los restos químicos con agua destilada. Estos
fueron llevados a cámara de flujo laminar
durante 20 minutos con luz UV. Para este
ensayo se mantuvieron las variables evaluadas
a nivel de erlenmeyer, con la incorporación de
la variable de aireación, que se evaluó de la
siguiente manera: Tanque 1 (0,5 vvm), tanque 2
(1,0 vvm) y tanque 3 (2 vvm), los ensayos se
realizaron a una temperatura de 37°C, con una
velocidad de agitación de 400 rpm y la adición
de un agente antiespumante (Antifoam ®) al
0.1% v/v en la misma proporción para cada
tanque.
Se tomaron muestras después de 0, 13, 17, 21,
25, 37, 43, y 49 horas de incubación para la
determinación de la actividad antimicrobiana y
el crecimiento celular.
La actividad antimicrobiana de los extractos se
determinó en placa de 96 pozos como se
definió previamente.
el tipo de sustrato se muestran en la Figura 1.
Se puede determinar que el tipo de sustrato
influye sobre la producción de compuestos
antimicrobianos contra el microorganismo
testigo.

Determinación de biomasa en el biorreactor

Se utilizó el método de unidades formadores de

colonias (UFC). Se realizaron las diluciones
seriadas en agua peptonada al 0.1% y se
sembraron 100 µl de las ultimas diluciones en
agar LB por duplicado para cada muestra
tomada.

Análisis estadístico
Figura 1. Porcentaje de inhibición de S. aureus
para extractos obtenidos en el ensayo de
Para el procesamiento de los datos se utilizó
erlenmeyer utilizando tres tipos de fuente de
Microsoft® Excel 2013 con un nivel de
carbono. Aislad utilizando P23.
significancia de 0.05.
El porcentaje de inhibición también se vio
3. RESULTADOS Y DISCUSIÓN
afectado por las diferentes concentraciones de
sustrato como se puede ver el a figura 2, ya
3.1. Evaluación de la actividad
que el aumento de la concentración está
antagonista de Bacillus sp.
directamente relacionado con el porcentaje de
inhibición contra S. aureus y por ende hay una
La actividad antagónica de los aislados se
mejor obtención de compuestos
determinó de manera cualitativa. El único
antimicrobianos.
aislado que presentó inhibición del crecimiento
de Staphylococcus aureus fue p23, lo que
indica que este microorganismo tiene la
capacidad de producir compuestos
antimicrobianos.

Esto coincide con lo reportado por Lugioyo y

colaboradores (2003). Quienes mostraron La
actividad antimicrobiana por el método de placa
de difusión de una cepa de Bacillus sp., contra
S. aureus.

3.2. Evaluación de los compuestos Figura 2. Porcentaje de inhibición de S. aureus

antimicrobianos en etapa de para extractos obtenidos en el ensayo de
Erlenmeyer erlenmeyer utilizando tres tipos de
concentraciones. Aislados utilizando P23.
Los porcentajes de inhibición contra S.aureus a
partir de los extractos obtenidos por medio del El tipo de sustrato y la concentración tuvieron
aislado P23 a escala de erlenmeyer evaluando un efecto significativo sobre la actividad como

4
 se puede ver en la tabla 1.
Tabla 1. Análisis de varianza
Origen de las variaciones Suma de cuadrados Grados de libertad Promedio de los cuadrados F Probabilidad Valor crítico para F

Sustrato 5776,070956 2 2888,035478 151,774974 5,3978E-12 3,554557146

Concentración 274,4970667 2 137,2485333 7,212824337 0,005005581 3,554557146

Interacción 62,46937778 4 15,61734444 0,820738549 0,528749097 2,927744173

Dentro del grupo 342,5112667 18 19,0284037

Total 6455,548667 26

contenido de almidón presente en este sustrato

Según Ariza y Sanchez (2012), la optimización
del crecimiento, procesamiento y producción de
compuestos con sustratos más económicos,
resulta ser más renovable y eficiente con un
efecto más rentable y viable económicamente.
Otros autores sugieren utilizar cepas
modificadas de Bacillus subtilis para tener una
mejor actividad cuando se usa el almidón como
sustrato (Hongxia et al., 2016).
Aunque el almidón soluble permitió alcanzar
mayores porcentajes de inhibición, se eligió la
harina de yuca para el ensayo en biorreactor ya
que es un sustrato más económico y no
convencional que representa alternativas con
potencial económico en la industria (Betancur-
Ancona et al., 2004), además de esto el
contenido de amilosa en almidones de
diferentes variedades de yuca esta entre el 15,9
a 22,4% y los contenidos de amilopectina son
del 83% aproximadamente, representando una
fuente apta para este ensayo (Hernández-
Medina et al., 2008).
es aproximadamente del 67% (Ayadi et al.,
2011).
3.3. Producción de extractos
antimicrobianos en reactor
En esta etapa no se detectó actividad
antimicrobiana, pese a que las condiciones eran
las mismas que fueron evaluadas con respecto
a los ensayos en erlemeyer, la única variable
que se modifico fue el caudal de oxígeno
suministrado en cada tanque, y partiendo de
este hecho se presume que éste factor resultó
determinante en el momento de la producción
del compuesto antimicrobiano, debido a que los
bajos niveles de oxígeno son requeridos para la
formación de compuestos bioactivos. De esta
manera nuestros resultados concuerdan con los
obtenidos en otros estudios en los cuales se
evidencia la formación de sustancias bioactivas
en condiciones de limitación de oxígeno
(Ramos, 2014).

Por su parte descartamos el uso de la harina de 3.3.1 Determinación de biomasa en

avena, ya que la actividad antimicrobiana con reactor
este sustrato no fue relevante con respecto a
los otros sustratos, posiblemente porque el Los resultados del crecimiento celular se
muestran en la figura 3.

5
 Figura 3 Crecimiento celular en reactores
Los ensayos a escala de reactor con diferentes
velocidades de aireación arrojaron diferentes
resultados, lo que nos indica que ésta variable
tiene un efecto directo en el crecimiento celular.
La aireación de 1vvm permitió obtener mayor
cantidad de biomasa como se observa en la
figura 3. Cuando se utilizaron 2vvm se presentó
un alto nivel de espuma, lo que llevo a que el
nivel del medio superara la capacidad del
reactor, ya que la condición de aireación es
más alta y requiere mayor adición de
antiespumante.
4. CONCLUSIONES
 El aislado P23 correspondiente a
Bacillus sp., presenta actividad
antimicrobiana contra Staphylococcus
aureus usando almidón soluble y harina
de yuca como sustrato alternativo,
cuando fueron evaluados en matraces
erlenmeyer.
 En etapa de erlenmeyer los porcentajes
de inhibición pueden ser mayores si se
realiza una concentración previa de los
extractos.
 No se pudo obtener una actividad
antimicrobiana en etapa de biorreactor
quizás por los altos niveles de
aireación.
6
5. AGRADECIMIENTOS
A la Institución Universitaria Colegio Mayor de
Antioquia por brindarnos los insumos, equipos,
reactivo e instalaciones. A la docente Elizabeth
Correa por el acompañamiento y la asesoría
durante toda la investigación.
6. REFERENCIAS
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