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La hidrodifusión por microondas y la gravedad, una nueva técnica


para la extracción de aceites esenciales
Maryline Abert Viana,∗ , Xavier Fernandezb, Franco Visinonic, Farid Chemata,∗
a
Universidad de Avignon y Pays de Vaucluse, UMR A 408 INRA - UAPV, S´ ecurit´e y Qualit´e de los Productos Originales V´ eg´ etale, F-
84029 Avignon, France´ b LCMBA, UMR CNRS 6001, University of Nice-Sophia Antipolis, F-06108 Nice, France´ c MILESTONE srl, Via Fatebenefratelli, 1/5, I-
26010 Sorisole, Bergamo, Italy

a r t i c l ei nformación abstractt

Historial del artículo: Se desarrolló un nuevo proceso de diseño y operación para la extracción de aceites esenciales. La hidrodifusión por
Recibido el 2 de enero de 2018 microondas y gravedad (MHG) es una combinación de microondas para la hidrodifusión de aceites esenciales desde el interior
Recibido en forma revisada el 25 de febrero de 2018 hacia el exterior de material biológico y la gravedad de la tierra para recoger y separar. El MHG se realiza a presión
Aceptada el 26 de febrero de 2018
atmosférica sin añadir ningún disolvente o agua. El MHG se ha comparado con una técnica convencional, la hidrodestilación
Disponible en línea el 2 de marzo de 2018
(HD), para la extracción de aceite esencial de dos hierbas aromáticas: la hierbabuena (Mentha spicata L.) y el pennyroyal
(Mentha pulegium L.) pertenecientes a la familia de las Labiatae. Los aceites esenciales extraídos por MHG durante 15
Palabras clave: minutos fueron cuantitativa (rendimiento) y cualitativamente (perfil aromático) similares a los obtenidos por hidrodestilación
Microondas convencional durante 90 minutos. MHG también previene la contaminación a través de un potencial del 90% de la energía
Hidrodifusión ahorrada, lo que puede conducir a beneficios en la emisión de gases de efecto invernadero.
Gravedad terrestre 2018 Elsevier B.V. Todos los derechos reservados.
Aceite esencial
Extracción
Mentha spicata
Mentha pulegium

1. Introducción extracción por solvente asistida por microondas (MASE)[3,7-


10], la hidrodestilación por microondas al vacío
El uso de energía de microondas en el laboratorio químico (VMHD)[11,12], la hidrodestilación por microondas
fue descrito por primera vez en 1986 simultáneamente por (MWHD)[13,14], la destilación por microondas con aire
Gedye et al.[1] y Giguerre et al.[2] en síntesis orgánica y por comprimido (CAMD)[15] y la hidrodestilación por microondas
Ganzler et al.[3] y Lane y Jenkins[4] en extracción de muestras sin solventes (SFME)[16,17]. Sobre el
biológicas para el análisis de compuestos orgánicos. Desde
entonces, numerosos laboratorios han estudiado las
posibilidades sintéticas y analíticas de las microondas como ∗ Autores correspondientes. Tel..: +33 490144432; fax: +33 490144441. Correo
fuente de energía no clásica. Hoy en día, se han publicado más
electrónico: maryline.vian@univ-avignon.fr (M.A. Vian).
de 1000 y 500 artículos, respectivamente, sobre el tema de la
síntesis y extracción por microondas. 0021-9673/$ - ver portada © 2018 Elsevier B.V. Todos los derechos reservados.
[5,6]. doi:10.1016/j.chroma.2008.02.086
En la última década ha habido una creciente demanda de años de procedimientos basados en la extracción por
nuevas técnicas de extracción, susceptibles de automatización, microondas han reemplazado algunos de los procesos
con tiempos de extracción más cortos y un menor consumo de convencionales y otras técnicas de extracción térmica que se
disolventes orgánicos, previniendo la contaminación y han utilizado durante décadas en los laboratorios químicos.
reduciendo los costes de preparación de las muestras. El objetivo de este trabajo fue desarrollar una nueva
Impulsados por estos objetivos, los avances en la extracción por técnica ecológica para la extracción de aceites esenciales
microondas han dado lugar a una serie de técnicas tales como la mediante hidrodifusión por microondas y gravedad (MHG)
que fue diseñada y desarrollada (Fig. 1). Esta técnica de En este trabajo, el potencial del MHG ha sido comparado
extracción verde es un original alambique de microondas con un método convencional de hidrodestilación. Hemos
"invertido" que combina el calentamiento por microondas y aplicado técnicas de MHG e hidrodestilación para extraer
la gravedad de la tierra a presión atmosférica. MHG fue aceites esenciales de las partes aéreas de dos hierbas
concebido para aplicaciones de laboratorio y a escala aromáticas: la hierbabuena (Mentha spicata L.) y el
industrial para la extracción de aceites esenciales de pennyroyal (Mentha pulegium L.) pertenecientes a la familia
diferentes tipos de plantas aromáticas. Basado en un de las Labiatae, que es una familia muy avanzada y
principio relativamente simple, este método consiste en homogénea, muy utilizada en la preparación de alimentos,
colocar el material vegetal en un reactor de microondas, sin perfumería y medicina.
adición de disolvente o agua. El calentamiento interno del
agua in situ dentro del material vegetal distiende las células
vegetales y provoca la ruptura de glándulas y receptáculos
oleíferos. La acción de calentamiento de las microondas
libera así el aceite esencial y el agua in situ que se transfieren
desde el interior hacia el exterior del material vegetal.
Este fenómeno físico, conocido como hidrodifusión,
permite que el extracto (agua y aceite esencial), difundido
fuera del material vegetal, caiga por gravedad de la tierra
fuera del reactor de microondas y caiga a través del disco
perforado de Pyrex. Un sistema de enfriamiento fuera del
horno de microondas enfriaba el extracto continuamente. El
agua y el aceite esencial se recogen y separan en un
recipiente tradicionalmente llamado "frasco florentino". El
aceite esencial, al ser más ligero que

Fig. 2. Perfil de rendimiento del aceite esencial de pennyroyal obtenido por

MHG () y HD () en función del tiempo de extracción.

Cuadro 1
Hidrodifusión y gravedad por microondas vs. hidrodestilación
Mentha spicata L. Mentha pulegium L.

MHG HD
MHG HD
Tiempo de extracción (min) 20 90 20 90
Rendimiento (%) 0.60 0.59 0.95 0.90
Impacto ambiental 160 2400 160 2400
(gCO2 rechazado)

2. Experimental

2.1. Material vegetal

Se compró material vegetal fresco en el mercado local. La


humedad inicial de cada planta fue, respectivamente, del 78%
para la hierbabuena (M. spicata L.) y del 82,3% para el
pennyroyal (M. pulegium L.).

M.A. Vian et al. / J. Chromatogr. A 1190 (2018) 14–17 2.2. Aparato y procedimiento de MHG
15
Fig. 1. Hidrodifusión y gravedad por microondas.

La hidrodifusión por microondas y la gravedad se ha


realizado en un horno de laboratorio de microondas de
agua, flota en la parte superior mientras que el agua va hacia Milestone Ethos ilustrado en la Fig. 1. Se trata de un reactor
el fondo y puede separarse fácilmente. Es importante multimodo de microondas de 2,45 GHz con una potencia
destacar que este método verde permite extraer aceites máxima de 1000 W variable en incrementos de 10 W. La
esenciales sin destilación ni evaporación, que son los temperatura fue monitoreada por un sensor infrarrojo (IR)
procesos que más energía consumen entre las operaciones de externo. En un procedimiento típico de MHG realizado a
la unidad. El MHG no es una extracción modificada asistida presión atmosférica, se calentaron 500 g de material vegetal
por microondas (MAE) que utiliza disolventes orgánicos, ni fresco utilizando una densidad de potencia fija de 1 W g-1
una SFME que evapora el aceite esencial con el agua in situ, durante 15 minutos sin añadir disolventes ni agua.
ni una hidrodestilación modificada que utiliza una gran La interacción directa de las microondas con el agua
cantidad de agua en el consumo de energía. biológica (es decir, el vapor producido a partir del agua presente
en el material vegetal fresco) favorece la liberación de aceites 2.4. Análisis de cromatografía de gases
esenciales atrapados dentro de las células de los tejidos
vegetales. Una mezcla de "jugo crudo" caliente y vapor (agua in El análisis de GC se llevó a cabo utilizando un cromatógrafo
situ) se mueve naturalmente hacia abajo por gravedad terrestre de gases Hewlett-Packard 6890N equipado con un sistema de
en un condensador espiral fuera de la cavidad del microondas detección de ionización de llama (FID), bajo las siguientes
donde se condensa. El condensado oleoso se recoge condiciones de funcionamiento: gas vector, helio; temperaturas
continuamente en un matraz receptor (similar a un embudo del inyector y del detector, 250 ◦C; volumen inyectado, 0,4 l;
separador) donde el aceite esencial forma una película en la ración dividida 1/50; columna HP1 (J&W Scientific),
superficie del agua y la película se extrae de la parte superior. polidimetilsiloxano (50 m × 0,20 mm de diámetro interior)..,
Al final se recoge el aceite esencial, se seca con sulfato de sodio espesor de la película 0,5 m; flujo constante 1 mL/min) e
anhidro y se almacena en el 4 ◦C hasta su utilización. Innowax (Interchim, Montluc¸ on, Francia) poli(etilenglicol) (50
m × 0,20 mm I.D., espesor de la película 0,4 m). Programa de
2.3. Aparato y procedimiento de hidrodestilación temperatura 40-250 ◦C a 2 ◦C/min y 250 ◦C durante 60 min. Los
índices de retención se determinaron con los estándares de
500 g de cada hierba aromática se sometieron a alcano C5-C26 como referencia. Las cantidades relativas de los
hidrodestilación con un aparato de tipo clevenger según la componentes individuales se basan en las áreas de pico
Farmacopea Europea[18] y se extrajeron con 3 L de agua obtenidas sin la corrección del factor de respuesta FID. Se
durante 90 minutos (hasta que no se obtuvo más aceite realizaron tres réplicas para cada muestra. El promedio de estos
esencial). El aceite esencial se recogió, se secó bajo sulfato tres valores y la desviación estándar se determinaron para cada
anhidro y se almacenó en 4 ◦C hasta el análisis de GC y GC- componente identificado.
MS.

16 M.A. Vian et al. / J. Chromatogr. A 1190 (2018) 14–17

Cuadro 2
Composiciones químicas de los aceites esenciales de Mentha pulegium L. y Mentha spicata L. obtenidos por MHG y HD
Compuesto Ib Mentha pulegium L. %. ±Sesenta y cinco Mentha spicata L. %±SDc

MHG HD
HP-1 Innowax HD
MHG
-Pineno 9281025 0.5±0.1 0.4±0.1 0.6±0.1 0.4±0.1

Sabinene 9681125 0.1 0.1 0.5±0.1 0.4±0.1


-Pineno 9721113 0.5±0.1 0.4 0.8±0.1 0.6±0.1
Oct-1-en-3-olt 9761461 –

0.1 0.1
Octan-3-uno 9791259 0.2 0.2±0.1 tr tr
Mirceno 9841166 0.1 0.4±0.1 0.1 1.7±0.2 1.5±0.1
Octan-3-olt 9921394 0.4
0.5±0.1 0.5±0.1
Limoneno 10241205 0.9±0.1 0.8 10.3±0.3 10.6±0.2
1,8-Cineole 10281214 0.1 0.2±0.1 0.8±0.2 1.3±0.2
(Z)--Ocimeno (E)-- 10311238 -––
tr 0.6±0.1 0.6±0.1 0.2±0.1
Ocimeno trans- 10401254 tr
tr tr
Sabineno hidratado 10651469 0.2

0.1
Terpinoleno 10801285 tr tr 0.1 0.1
Linalool 10951550 tr 3.3±0.2 0.4±0.1 0.4
trans-Limoneno oxidet 11311467 – 0.1
– 0.1
Mentonada 11511473 0.1 0.1 – –
Mentonada 11601502 3.1±0.4 2.8±0.3 tr tr
Borneol 11641712 – tr 0.6±0.1 0.7±0.1
trans-Isopulegonet 11671587 1.9±0.1 2.1
– –
Terpinen-4-ol 11781610 tr
– tr 0.2
Neomentholt 11891653 0.1 0.1 – –
cis-Dihidrocarvonet 11901620 – – 0.9±0.2 0.9±0.1
Neodihidrocarburo de 11961737 – – 0.4±0.1 0,5±0,2 tr
hidrógeno 11921706 0.1 0.1
tr
-Terpineol
cis-Carveol 12301842 – – 15.3±0.5 16.9±0.8
Pulegona 12341670 87.8±1.3 83.7±1.1 – –
Carvona 12451750 tr tr 40.5±0.9 45.5±1.1
geranial 12611730 – tr 0.1 0.7±0.2
Piperitonet 12781742 tr 0,1 –

Acetato de metilo 12811592 0.2±0.1 0.3±0.1 1.1±0.3 - -
Acetato de 1306– – –
– 0.3±0.1
neoisomentilo acetato 13241776 – –
trans-carvilo – 0.2 0.1
Eucarvonet 13311932 2.3±0.2 1.4±0.2 0,1 0.1
Eugenol 13442155 – 0.1
– –
acetato de cis-carvilo 13501820 – – 0.1 0.1
-Copeno 13701496 tr tr 0.2 0.1
-Bourbonenet - 13791533 tr tr 0,1 2.1±0.3 1.3±0.2
Elemenet cis- 13871596 – tr
0.2±0.1 0.2
Jasmonet 13841955 tr
0.3±0.1
tr 0.3±0.1
Metil eugenol 13951989 – 0.4±0.2 – –
-Gurjunenet 14011536 – – 0.3 tr
-Cariofileno 14151606 0.2±0.1 0.2 3.6±0.5 1.9±0.3
Calarenet 14301652 –
– 0.3±0.1 0.2
Acetona de geranilo 14381859 –
– 0.1
tr
-Farnesenet 14481670 – 0.3±0.1 0.1 1.0±0.3 0.6±0.2
-...Humulene. t
14501680 – 0.2 0.6±0.2 0,8±0.2 0.3±0.1
-Selinenet 14591715 –

tr 0,2±0,1 0.4±0.1
-Cadinenet 14681765 – –
-Muurolenet - 14831686 – – 6,5±0,5 0.1
– 4.1±0.3
Farnesenet 15011740 – tr 0,1
1503– –
-Bisabolenet tr 0.3±0.1 0.5±0.2
0,1
-Cadinenet 15101769 –
tr 0.2 0.3±0.1
-Cadinenet 15151765
tr 0.2
15201927 0.1
-Calacorenet tr
0.2±0.1
0.2
-Sesquiphellandrenet 15201768 -–– – – 0.5±0.2
Nerolidolt 15482012 tr tr tr – 0.1±0.1
Spathulenolt 15672135 0,1 –
tr tr 0.3±0.1
Caryophylene oxidet 15721997
0.1
-Cadinolt 16422135 tr 0.1 0,1 0.5±0.2
-Bisabolt 16752217 – – tr
0.3
Fitol n- 2106– – tr – 0.2±0.1
tetracosano 23972401 – – 0.1 –
n-Pentacosano 24992500 – tr 0.2±0.1 tr
n-Hexacosano 26002602 – tr 0.8±0.2 tr
n-Octacosano n- 2800– – – 1.5±0.2 –
Triacosanet –– – – –
1.9±0.1
a
Los compuestos se enumeran en orden de tiempo de elución en una columna HP-1. Los valores de composición inferiores al
0,1% se indican como trazas (tr). La presencia de un compuesto es
indicado por su porcentaje de GC-FID con SD, la ausencia se indica con "-".
b
I = índices de retención, determinados en una columna HP-1 e Innowax utilizando la serie homóloga de n-alcanos (C6-C26). c
SD=desviación estándar calculada mediante tres réplicas.
d
Isómero correcto no caracterizado. tentativamente
identificado por MS e I sin coinyección de
compuestos estándar.
M.A. Vian et al. / J. Chromatogr. A 1190 (2018) 14–17 17
2.5. Cromatografía de gases - Análisis de espectrometría de sustancias puras, y datos de la literatura de EM[19-24]
masas combinados con la comparación de los índices de retención de
GC (I) en la columna apolar y polar. Los valores de I se
El análisis GC-MS se realizó utilizando un sistema Agilent calcularon con la ayuda de una serie de alcanos lineales C6-C26
6890N acoplado a un instrumento Agilent 5973 MS (Agilent, en columna apolar y polar (HP-1 y HP-Innowax). Los
Massy, Francia). Las muestras se analizaron en una columna compuestos disponibles en el laboratorio se confirmaron
capilar de sílice fundida HP-1 (Interchim) polidimetilsiloxano mediante coinyección de compuestos estándar externos.
(50 m × 0,20 mm I.D., espesor de la película 0,50 m) e Innowax
(Interchim) poli(etilenglicol) (50 m × 0,20 mm I.D., espesor de 3. Resultados y discusión
la película 0,4 m). Gas portador, helio, flujo constante 1 ml/min,
temperatura del inyector, 250 ◦C, relación de división, 1:50, 3.1. Rendimiento y tiempo de extracción
programa de temperatura, 45 ◦C a 250 ◦C o 230 ◦C, en 2 ◦C/min
y luego se mantiene isotérmico (20 min) en 250 ◦C (columna Los rendimientos de aceite esencial extraído de menta (M.
apolar) o 230 ◦C (columna polar), temperatura de la fuente de spicata L.) y pennyroyal (M. pulegium L.) con los diferentes
iones, 230 ◦C; temperatura de la línea de transferencia, 250 ◦C procesos se reportan en la Tabla 1. No se encontraron
(columna apolar) o 230 ◦C (columna polar); energía de diferencias notables en el rendimiento de aceite con las
ionización, 70 eV; los espectros de masas de ionizantes de diferentes técnicas. Como se muestra en la Fig. 2, un tiempo de
electrones se adquirieron en el rango de masas de 35-400 U. extracción de 20 minutos con MHG proporciona rendimientos
comparables a los obtenidos después de 90 minutos mediante
2.6. Identificación de los componentes HD, que es el método de referencia en la extracción de aceites
esenciales. Los rendimientos finales de los aceites esenciales
La identificación de los componentes se basó en la obtenidos por MHG a partir de las dos plantas aromáticas fueron
comparación de ordenadores con bibliotecas comerciales del 0,6% para la hierbabuena y del 0,95% para el pennyroyal.
(Wiley, MassFinder 2.1 Library, NIST98), bibliotecas de Los rendimientos finales obtenidos por HD fueron del 0,59%
espectros de masas de laboratorio construidas a partir de para la hierbabuena y del 0,90% para el pennyroyal.
3.2. Composición de los aceites esenciales [5] L. Perreux, A. Loupy, Tetraedro 57 (2001) 9199.
[6] M. Lettelier, H. Budzinski, Analusis 27 (1999) 259.
[7] J.R.J. Pare, Microwave assisted process for extraction and apparatus
Los aceites esenciales de M. spicata L. y M. pulegium L. therefore,´ CA Pat. 2,055,390, 1992.
extraídos por MHG o HD son bastante similares en su [8] J.R.J. Pare, M. Sigouin, J. Lapointe, Extracción de productos naturales
asistida by´ microondas. EP 192, Pat. 398,798, 1990.
composición. El mismo número de metabolitos secundarios
[9] J.R.J. Pare, M. Sigouin, J. Lapointe, Microwave-assisted natural product
volátiles se encuentra en los aceites esenciales aislados por extrac-´ tion, US Pat. 5,002,784, 1991.
MHG o HD, con rendimientos similares. [10] J.R.J. Pare, extracción por microondas de aceites volátiles, US Pat.
La carvona, un monoterpeno oxigenado, es el principal 5,338,557, 1994.´
[11] P. Mengal, B. Mompon, Method and plant for solvt-free microwave
componente abundante en el aceite esencial extraído de M. extraction of natural products, WO Pat. 94/26853, 1994.
spicata L. con cantidades relativas equivalentes para ambos [12] P. Mengal, B. Mompon. Método y planta para la extracción de productos
métodos de extracción: 40,5% y 45,5%, respectivamente, para naturales por microondas sin disolventes, EP Pat. 698,076 B1, 1996.
[13] E.E. Stashenko, B.E. Jaramillo, J.R. Martinez, J. Chromatogr. A 1025
MHG y HD. El limoneno, un hidrocarburo de monoterpeno, está (2004) 105.
presente en un 10,3% y un 10,6%, respectivamente, para MHG [14] E.E. Stashenko, B.E. Jaramillo, J.R. Martinez, J. Chromatogr. A 1025
y HD. Linalool, un monoterpeno oxigenado, está presente al (2004) 93.
[15] A.A. Craveiro, F.J.A. Matos, J.W. Alencar, M.M. Plumel, Flavour Frag.
3,3% y como trazas, respectivamente, para HD y MHG. J. 4 (1989) 43.
El aceite esencial de M. pulegium L. aislado por MHG y HD [16] F. Chemat, J. Smadja, M.E. Lucchesi, Solventless extraction assisted by
contiene los mismos dos compuestos oxigenados de micro´ natural product waves, EP Pat. 1,439,218 A1, 2004.
[17] F.Chemat,M.E.Lucchesi,J.Smadja,Solventfreemicrowaveextraction
monoterpenos con cantidades relativas equivalentes: pulegona
ofvolatile natural substances,US Pat. 0,187,340 A1, 2004.
(87,8% y 83,7%) y mentona (3,1% y 2,8%) (Tabla 2). [18] European Pharmacopoeia, 3ª ed., Consejo de Europa, Estrasburgo, 1997,
En esta aplicación, la irradiación por microondas aceleró p. 1.
121.
altamente el proceso de extracción, pero sin provocar cambios
[19] D. Joulain, W.A. Konig, The Atlas of Spectral Data of Sesquiterpene
considerables en la composición volátil del aceite, fenómeno Hydrocar-¨ bons, first ed., E.B.-Verlag, Hamburg, 1998, p. 658.
que ya se había descrito. [20] D. Joulain, W.A. Konig, D.H. Hochmuth, Terpenoids and related
3.3. Costo, energía y ecología ambiental constituents of¨ essential oils, Library of Mass Finder 2.1., Hamburgo,
2001.
[21] F.W. McLafferty, D.B. Stauffer, The Wiley/Nbs Registry of Mass
El coste reducido de extracción es claramente ventajoso para Spectral Data, rev. ed., Wiley, Nueva York, 1989, pág. 7872.
el método MHG propuesto en términos de tiempo y energía. La [22] R.P. Adams, Identification of Essential Oil Components by Gas
Chromatography/Mass Spectroscopy, Allured Publ., Carol Stream, IL,
energía necesaria para realizar los dos métodos de extracción 1995.
son, respectivamente, 3 kWh para HD y 0,2 kWh para MHG. El [23] B.A.C.I.S. Eso 2000 the Complete Database of Essential Oils, Boelens
consumo de energía se ha determinado con un vatímetro en la Aroma Chemical Information Service, Países Bajos, 1999.
[24] N.W. Davies, J. Chromatogr. 503 (1990) 1.
entrada del generador de microondas y la fuente de alimentación [25] J. Bernard, Sciences et Vie 21 (2001) 68.
del calentador eléctrico. En cuanto al impacto ambiental, la
cantidad calculada de dióxido de carbono rechazado en la
atmósfera es mayor en el caso de HD (2400 g CO2) que en el de
MHG (160 g CO2) (Tabla 1). Estos cálculos se han realizado de
acuerdo con la literatura[25]: para obtener 1 kWh de carbón o
combustible, se rechazarán 800 g de CO2 en la atmósfera durante
la combustión de combustibles fósiles.

4. Conclusión

La utilización de la tecnología de microondas para la


extracción de aceites esenciales y extractos naturales es un
sistema que ha evolucionado para mantener la rueda del
desarrollo en movimiento. La extracción por microondas utiliza
fenómenos físicos y químicos fundamentalmente diferentes a los
que se aplican en las técnicas de extracción convencionales. Esta
novedosa técnica puede producir aceite esencial en forma
concentrada, libre de solventes residuales, contaminantes o
artefactos. Los nuevos sistemas desarrollados hasta la fecha
indican que la extracción por microondas en combinación con la
hidrodifusión y la gravedad ofrece ventajas netas en términos de
rendimiento y selectividad, con mejor tiempo de extracción,
composición de aceites esenciales y respeto al medio ambiente.

Referencias

[1] R.N. Gedye, F.E. Smith, K.C. Westaway, H. Ali, L. Baldisera, L.


Laberge, J. Roussel, Tetrahedron Lett. 27 (1986) 279.
[2] R.J. Giguerre, T.L. Bray, S.M. Duncan, G. Majetich, Tetrahedron Lett.
27 (1986) 4945.
[3] K. Ganzler, A. Salgo, K. Valko, J. Chromatogr. 371 (1986) 299.
[4] D. Lane, S.W.D. Jenkins, Presentado en el 9º Simposio Internacional
sobre Hidrocarburos Aromáticos Polinucleares, Columbus, OH, 1984,
Abstracts, p. 437.