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Inmovilización de levaduras por encapsulación para la fermentación de


mostos

Conference Paper · November 2008

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5 authors, including:

Izaskun Marañón Edurne Elejalde


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Maria Chavarri Maria Carmen Villarán


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II Congreso Iberoamericano sobre Seguridad Alimentaria
V Congreso Español de Ingeniería de Alimentos
Barcelona, 5 a 7 de Noviembre de 2008
© CIMNE, España 2008

INMOVILIZACIÓN DE LEVADURAS POR


MICROENCAPSULACIÓN
PARA LA FERMENTACIÓN DE MOSTOS -
V CONGRESO DE INGENIERÍA Y TECNOLOGÍA DE ALIMENTOS
Izaskun Marañón*, Edurne Elejalde, María Chavarri,
Iratxe López de Armentia y María del Carmen Villarán

Unidad Alimentaria
Fundación LEIA C.D.T., Parque Tecnológico de Álava,
c/Leonardo da Vinci nº11, 01510 Miñano (Álava)
e-mail: izaskunm@leia.es, web: http://www.leia.es

Palabras clave: microencapsulación; inmovilización; alginato; levaduras; fermentaión; vino


Resumen. El vino es un producto obtenido de la fermentación alcohólica, proceso mediante el
cual los azúcares de la uva se transforman en etanol debido a la acción de las levaduras, que
además están implicadas en la generación de numerosos compuestos secundarios que
determinan la tipicidad y calidad del vino elaborado. La aplicación de tecnologías de
extrusión para la inmovilización de levaduras en una matriz de alginato cálcico ofrece
resultados de viabilidad celular superiores al 90% y buenos rendimientos de producción. El
resultado es un producto más fácilmente manejable que las levaduras frescas, con respecto a
las levaduras secas activas presentan la ventaja de no necesitar etapas de aclimatación, son
fáciles de retirar del medio, presentan muy buenas características de conservación, etc.

1. INTRODUCCIÓN
El vino es un producto obtenido de la fermentación alcohólica, proceso mediante el cual los
azúcares de la uva se transforman en etanol debido a la acción de las levaduras. Sin embargo, su
verdadera importancia no radica únicamente en la producción del grado alcohólico del vino
obtenido, sino que además en el transcurso del proceso fermentativo las levaduras están
implicadas en la generación de numerosos compuestos secundarios que determinan la calidad
final del vino elaborado, así como su tipicidad.
Existe una gran diversidad en cuanto a la tecnología de biorreactores dirigida a la producción
del vino, permitiendo alcanzar así una amplia variedad de vinos fermentados. Durante siglos los
enólogos han acumulado numerosos actos pragmáticos que no siempre han coincidido con una
optimización del proceso de fermentación del vino o de su tipicidad. En los últimos 20 años, las
levaduras inmovilizadas han comenzado a ser exploradas como una alternativa para reducir
I. Marañón, E.Elejalde y M. Chavarri

procedimientos laboriosos, simplificar tiempos, y con ello reducir costes.


La bioencapsulación se define como la inmovilización de componentes biológicamente
activos en hidrogeles o microcápsulas. En este caso, las microcápsulas son definidas como
pequeñas partículas esféricas que contienen las levaduras inmovilizadas en una matriz de
material encapsulante [1]. A la hora de considerar la inmovilización de las levaduras, el
primer paso consiste en la selección de la tecnología y la matriz. Debido a que las
microcápsulas se encontrarán en contacto con la matriz, esta debe estar compuesta por un
material no tóxico, reconocido como seguro y con posibilidad de ser empleado por la
industria alimentaria [2]. El material más frecuentemente utilizado y que cuenta con mayor
número de referencias bibliográficas es el alginato [3, 4].
En cuanto a la tecnología, debe seleccionarse un proceso que en modo alguno provoque la
pérdida de viabilidad de las células. Existen numerosas referencias de empleo de tecnologías
de formación de gota para alcanzar la inmovilización de células con alta viabilidad tras el
proceso. Existen numerosas variantes para lograr la formación de gotas de alginato que
contengan las levaduras y entre estas la más adecuada debe ser seleccionada atendiendo a
parámetros tales como la capacidad de producción, tamaño de gota obtenible, etc. [5-7].
Dentro de las posibilidades existentes en el campo de las tecnologías de extrusión para la
formación de gotas, para la producción de los volúmenes necesarios para la fermentación a
escala industrial de una barrica, es necesario seleccionar aquella técnica que permita obtener
una elevada velocidad de producción de microcápsulas y con una gran uniformidad de tamaño
de las mismas. En este sentido, la rotura de un chorro capilar mediante corte mecánico es una
técnica que cumple con todos los requisitos establecidos en el proceso [8].
La inmovilización celular de un producto utilizable en un periodo de tiempo posterior al
proceso entre medio y prolongado, requiere el secado parcial o total de las microcápsulas para
detener el crecimiento de las células contenidas en la matriz. Posteriormente las levaduras son
rehidratadas e introducidas en el medio a fermentar [9, 10].

2. MATERIALES Y MÉTODOS

2.1. Materiales
El estudio ha sido realizado utilizando una levadura comercial Saccharomyces cerevisiae y la
matriz de encapsulación se forma mediante la gelificación del alginato sódico (W201502, de
SIGMA) con una solución de cloruro de calcio (211221, de Panreac). Para llevar a cabo las
pruebas de fermentación se ha preparado una solución de mosto sintético estándar, además de
haber realizado algunas pruebas sobre mosto comercial clarificado. El recuento de las
levaduras y la determinación de su viabilidad requiere el empleo de citrato de sodio (S1804,
de SIGMA) para romper las cápsulas y azul de metileno para la tinción (4159, de SIGMA).

2.2. Métodos de inmovilización


Una cantidad deseada de levadura se introduce en una solución de alginato sódico de
concentración conocida y se somete agitación hasta la completa hidratación de la levadura y

2
I. Marañón, E.Elejalde y M. Chavarri

su suspensión homogénea en la solución.


El proceso seleccionado de inmovilización consiste en la extrusión de la mezcla de solución
encapsulante y levaduras, en forma de un chorro capilar de diámetro deseado. Posteriormente,
este chorro es cortado a la salida de la boquilla mediante una herramienta de corte giratoria.
El proceso recibe el nombre de Jet-Cutting y se lleva a cabo mediante equipos comerciales de
diferentes escalas de producción.

2.3. Métodos de caracterización


La concentración y viabilidad de las levaduras en las distintas etapas del proceso se determina
mediante su tinción y recuento en una cámara de recuento Neubauer. En el caso de las
levaduras inmovilizadas es necesario disolver primeramente la matriz encapsulante mediante
una solución de citrato 0,1M. Las muestras más diluidas en las cuales no es posible obtener
una muestra representativa a emplear en la cámara de recuento, se recurre a la determinación
de la concentración por espectrofotometría UV-Vis a 600nm [11].
El seguimiento de la etapa de fermentación se realiza a través de medidas directas del
contenido en glucosa del medio, a través del grado Brix de la solución.

3. DESARROLLO EXPERIMENTAL

3.1. Inmovilización
El proceso de inmovilización de las levaduras requiere la optimización de las
concentraciones relativas de matriz encapsulante y levaduras para obtener una buena
proporción entre ambas que garantice el buen funcionamiento del sistema, que sea
extruible, que forme una suspensión estable, etc.
En este sentido se realizaron pruebas con pequeños dispositivos de extrusión de
laboratorio y distintas proporciones de levaduras y alginato. En primer lugar teniendo en
cuenta las condiciones del proceso de obtención de las microcápsulas y la dispersión final
de tamaños del producto obtenido.
La concentración de levaduras no tenía un efecto relevante sobre la distribución de
tamaños de partícula ni sobre la retención de las levaduras por parte de la matriz, por lo
que esta se maximizó en la medida de las posibilidades de extrusión que ofrecía la técnica
seleccionada para el escalado del proceso.
Puesto que el calcio puede tener un efecto negativo en la calidad del vino, es importante
que en las cápsulas exista la mínima cantidad posible del mismo, y que este se encuentre
perfectamente integrado en la matriz de alginato, por lo que también fue necesario
optimizar la concentración de cloruro de calcio en el baño de gelificación. Es necesario
trabajar con una concentración tal que minimice la concentración de cationes de calcio
libres, pero que garantice la integridad de la cápsula.
Una vez optimizadas las características de los medios de trabajo, se procedió al escalado
del proceso (figura 1).

3
I. Marañón, E.Elejalde y M. Chavarri

Figura 1. Muestra del resultado obtenido en las pruebas a escala piloto del proceso

3.2. Secado de las cápsulas


Se ha puesto a punto el método de secado de las cápsulas obtenidas utilizando un secador
en lecho fluido a baja temperatura para evitar la pérdida de viabilidad celular. Deben ser
optimizados los tiempos y temperaturas de secado. En esta etapa la concentración de
alginato también resulta tener una gran importancia en la viabilidad de las levaduras
inmovilizadas (tabla 1).

Levaduras (nº/ml) Viabilidad (%)


Alginato Pérdida de
Cápsulas Cápsulas Cápsulas Cápsulas
(%) viabilidad (%)
hidratadas secas hidratadas secas
8
1,5 3·10 3·108 96,0 81,0 15
8
2,0 2·10 2·108 89,1 85,9 3,2
8
3,0 3·10 3·108 94,6 91,8 2,8
3,5 2·108 2·108 90,1 87,0 3,1
Tabla 1. Resultados del recuento de levaduras inmovilizadas y determinación de su viabilidad

3.3. Conservación
Las cápsulas secas deben ser conservadas hasta la fermentación de los mostos, por lo que
hay que encontrar las mejores condiciones de atmósfera y temperatura para maximizar la
viabilidad tras periodos prolongados de tiempo.
Las medidas de viabilidad se efectúan semanalmente sobre lotes de cápsulas conservados a
temperatura ambiente y refrigeradas, y en atmósfera normal o modificada. Las cápsulas se
mantienen hasta dos meses en tales condiciones para comparar los resultados obtenidos.

3.4. Pruebas de vinificación


La fermentación de los mostos se ha realizado en el laboratorio manteniendo la proporción
de levaduras por volumen de mosto empleada a escala industrial. Estas pruebas han
servido para determinar la carga máxima efectiva de levaduras / cápsula (figura 2).
Igualmente se ha determinado la influencia del escalado del proceso de inmovilización y
secado sobre los resultados obtenidos en las vinificaciones (figura 3).

4
I. Marañón, E.Elejalde y M. Chavarri

19

17 Libres
100%
15 75%
50%

13
ºBrix

11

5
0 50 100 150 200 250
tiempo (h)

Figura 2. Evolución de la fermentación para distintas concentraciones de levaduras en las cápsulas


25,0

20,0

15,0 escala laboratorio


escala piloto
º Brix

10,0

5,0

0,0
0 50 100 150 200 250 300 350
tiempo (horas)

Figura 3. Comparación de las fermentaciones con microcápsulas obtenidas en distintas escalas de producción

4. RESULTADOS
Las pruebas realizadas muestran que los resultados obtenidos a escala de laboratorio son
escalables a escala piloto de producción y ofrecen una buena perspectiva de aplicación
industrial. Se ha puesto a punto un proceso para la obtención a escala piloto de levaduras
inmovilizadas en matrices de soluciones de alginato al 3% empleando tecnologías de
microencapsulación basadas en el corte mecánico del chorro capilar.
Estas levaduras se conservan mejor en atmósfera inerte, donde se alcanzar resultados de
viabilidad próximos al 90%, frente a los descensos en viabilidad observados en las
cápsulas conservadas en atmósferas oxidantes.
Entre las ventajas de las levaduras inmovilizadas destaca la fermentación sin necesidad de
aclimatación, lo que supone una ventaja frente a las levaduras libres. Además son más
fáciles de manejar que las levaduras frescas. Por otro lado, tal y como se observa en la

5
I. Marañón, E.Elejalde y M. Chavarri

figura 2, las cápsulas permiten logran un mayor rendimiento en la fermentación con


respecto a las levaduras libres.

6. REFERENCIAS
[1.] Dulieu, C., D. Poncelet, and R.J. Neufeld, Techniques of encapsulation and
immobilization, in Cell encapsulation technology and therapeutics, W.M. Kühtreiber, R.P.
Lanza, and W.L. Chick, Editors. 1999.
[2.] Jimoh, A., Effect of immobilized materials on Saccharomyces cerevisiae. AU J.T.,
2004. 8(2): p. 62-68.
[3.] Obradovic, B., et al., Sudies of brewing yeast cell distribution in alginate microbeads,
in XII International workshop on bioencapsulation. 2004, Vitoria-Gasteiz.
[4.] Bugarski, B., et al. Electrostatic generation of alginate microbeads as a multiphase
system with differnt initial cell concentration. in XII International workshop on
bioencapsulation. 2004. Vitoria-Gasteiz.
[5.] Nedovic, V. and R. Willaert, eds. Fundamentals of Cell Immobilisation
Biotechnology. Focus on Biotechnology, ed. M. Hofman and J. Anné. Vol. 8A. 2004, Kluwer
Academic Publishers: Dordrecht. 555.
[6.] Krasaekoopt, W., B. Bhandari, and H. Deeth, Evaluation of encapsulation techniques
of probiotics for yoghurt. International Dairy Journal, 2003. 13: p. 3-13.
[7.] Kourkoutas, Y., et al., Immobilization technologies and support materials suitable in
alcohol beverages production: a review Food Microbiology, 2004. 21: p. 377-397.
[8.] Ramon-Portugal, F., et al., Immobilized yeast: actual oenologic utilizations.
Vinidea.net, Wine Internet Tecnhical Journal 2003. 1: p. 1-8.
[9.] Cayuela, J.M., et al., Viabilidad de levaduras secas activas en distintas condiciones de
rehidratación. Tecnología del vino, 2003. 13: p. 76-78.
[10.] Divies, C., Procédé de préparation de micro-organismes inclus dans des gels
sensiblement déshydratés, gels obtenus et leur utilisation pour la préparation de boissons
fermentées. 1989, Champagne Moët & Chandon: France. p. 14.
[11.] Carvalho, W., et al., Xylitol production from sugarcane bagasse hydrolysate
Metabolic Behaviour of Candida guilliermondii cells entrapped in Ca-alginate. Biochemical
Engineering Journal, 2005. 25: p. 25-31.

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