Manual Bioquimica Clinica (1) Corregido

Código FGA-73 v.
00
Manual de Practicas
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MANUAL DE LABORATORIO DE
BIOQUIMICA CLINICA
María del Pilar Trujillo

Bacterióloga y Laboratorista Clínico U. Javeriana
Maestría en Biología U. Javeriana
pilartrujillo@unipamplona.edu.co
CARMEN ROSA CONTRERAS MONTAÑEZ

Química Farmacéutica U. Nacional
Especialista Administración de Servicios de Salud U. de Antioquia
Magíster en Salud Pública U. de Antioquia
carmenrcontrerasm@unipamplona.edu.co
UNIVERSIDAD DE PAMPLONA
FACULTAD DE SALUD
DEPARTAMENTO DE BACTERIOLOGIA Y LABORATORIO CLINICO
PAMPLONA
DEPARTAMENTO NORTE DE SANTANDER
COLOMBIA
2012
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INDICE DE CONTENIDO
Introducción
Normas de seguridad
Pág.
Practica 1: Bioseguridad 5
Practica 2: Soluciones Buffer 9
Practica 3: Precipitación diferencial de Proteínas 12
Practica 4: Reacciones Enzimáticas 16
Practica 5: Factores que afectan las reacciones Enzimáticas 18
Practica 6: Fermentación Alcohólica 22
Practica 7: Soluciones y diluciones 26
Practica 8: Diluciones en serie 37
Practica 9: Diluciones no seriadas 41
Practica 10: Preparación de estándares de trabajo 43
Practica 11: Espectroscopía y elaboración de una curva espectral 45
Practica 12: Elaboración de una curva de calibración 61
Practica 13: Separación de lípidos por cromatografía en capa fina 67

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INTRODUCCION
En este manual se ha querido recopilar las principales pruebas y las de mayor utilidad
en el campo de la Bioquímica.
Los conocimientos aportados por la Bioquímica Clínica no sólo permiten entender
mejor la manera en la que están estructuradas las células y los tejidos, el
funcionamiento del organismo y cuáles son las fundamentos de la patogénesis
existente, sino que proporcionan las bases para el uso racional de las estrategias
terapéuticas, principalmente en el campo del descubrimiento de fármacos efectivos
con un mínimo de efectos indeseables.
Esperamos que estos ensayos básicos aporten al desarrollo de la Bioquímica Clínica
en nuestro país, pues se han escogido ensayos muy sencillos y de fácil realización en
cualquier laboratorio.
NORMAS DE SEGURIDAD
Normas sobre el manejo de reactivos químicos:
 Leer atentamente la etiqueta de identificación del reactivo.
 Verificar que se esté empleando la sustancia indicada.
 Verificar el grado de peligrosidad.
 Conocer como va a reaccionar (al diluir ácidos fuertes, añadir siempre el ácido
al agua, nunca lo contrario, y hacerlo lentamente).
 No pipetear con la boca. Usar dispensadores o pipetas automáticas.
 Medir solo las cantidades de reactivos necesarios para el trabajo experimental
y depositarlos en material de vidrio limpio y seco.
 No dejar los frascos destapados o abandonados sobre las mesas de trabajo.
Una vez utilizados taparlos y guardarlos o dejarlos en el lugar indicado.
 No coger los frascos de los reactivos por el cuello.
En general, los productos que no lleven señalización de seguridad no quiere decir que
no sean peligrosos, pregunte a su profesor antes de usarlos.
Normas de bioseguridad en el laboratorio:
 Se exige puntual asistencia.

 Usar gafas de protección.
 Usar guantes.
 Evitar el uso de joyas (anillos y colgantes).
 Atarse el pelo largo para evitar accidentes con la llama del mechero.
 Usar encendedores de chispa por fricción y no fósforos.
 No cambiar de lugar equipos, materiales y reactivos.
 No comer, beber, fumar, almacenar alimentos, aplicar cosméticos, ni recibir
visitas.
 Realizar todos los procedimientos técnicos en la forma indicada.
 Usar los gabinetes de seguridad biológica, como son las campanas de
extracción cuando se realizan procedimientos que pueden formar aerosoles
infecciosos.
 Descontaminar las superficies de los mesones de trabajo inmediatamente
después de derrames de material infeccioso.
 Desechar los productos químicos, desechos biológicos y otros desperdicios en
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los lugares indicados.

 Secar bien las manos antes de iniciar el trabajo.
 No trabajar con equipos eléctricos defectuosos, o si se ha derramado un
reactivo sobre ellos.
 Lavar y secar el material antes y después de ser empleado.
 Leer la guía de trabajo correspondiente y seguir sus instrucciones
estrictamente.
 Llevar a la práctica: MANUAL DE TRABAJO, CUADERNO DE
LABORATORIO, EQUIPO DE BIOSEGURIDAD, UNA TOALLA O PAÑOS
DESECHABLES, PIPETEADOR, CINTA DE ENMASCARAR, O MARCADOR
DE VIDRIO, DETERGENTE LÍQUIDO Y DEMÁS MATERIALES QUE SE LES
SOLICITEN EN CADA PRÁCTICA. Los alumnos son responsables del
material de laboratorio que se les entregue.
 Si durante el período de prácticas, algún material es dañado por éste, se
exigirá la reposición del mismo para el siguiente período de práctica. En este
sentido el estudiante deberá llenar una planilla de Control de Material Roto.
 Una vez concluido el trabajo experimental, todo el material de vidrio utilizado
debe regresarse, limpio y seco a sus respectivos lugares.
 Usar los implementos de bioseguridad de acuerdo al riesgo de cada practica:
Niveles De Riesgo:
 Nivel 1: Riesgo Bajo (Bata de Laboratorio Manga Larga, Zapato Cerrado

Bajo, Pantalón Largo).
 Nivel 2: Riesgo Medio (Bata de Laboratorio, Guantes, Cofia, Tapabocas,

Zapato Cerrado Bajo, Pantalón Largo).
 Nivel 3: Riesgo Alto (Bata, Mascara Respiratorias, Guantes, Cofia, Gafas

de Seguridad, Zapato Cerrado Bajo, Pantalón Largo).
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PRACTICAS:
PRACTICA Nº 1
1. BIOSEGURIDAD
2. Objetivos:
 Conocer las medidas preventivas para controlar los factores de riesgo procedentes
de los agentes biológicos, físicos o químicos.
 Aplicar el concepto de bioseguridad en el laboratorio.
 Identificar las señales y símbolos relacionados con la seguridad en el laboratorio.
 Reconocer las medidas generales de seguridad en el laboratorio.
3.Marco Teórico
La Bioseguridad, se define como el conjunto de medidas preventivas, destinadas a
mantener el control de factores de riesgo laborales procedentes de agentes biológicos,
físicos o químicos, logrando la prevención de impactos nocivos, asegurando que el
desarrollo o producto final de dichos procedimientos no atenten contra la salud y
seguridad de trabajadores de la salud, pacientes, visitantes y el medio ambiente.
Sistema de precauciones universales.
Este sistema fue establecido por el Centro de Control de Enfermedades (C.D.C) de

Atlanta, en 1987, a través de un grupo de expertos quienes desarrollaron guías para
prevenir la transmisión y control de la infección por VIH y otros patógenos
provenientes de la sangre hacia los trabajadores de la salud y sus pacientes. En el
cual se recomendó que todas las Instituciones de Salud adoptaran una política de
control de la infección, que denominaron “Precauciones Universales”. Se entienden
como Precauciones Universales al conjunto de técnicas y procedimientos destinados a
proteger al personal que conforma el equipo de salud de la posible infección con
ciertos agentes, principalmente Virus de la Inmunodeficiencia Humana, Virus de la
Hepatitis B, Virus de la Hepatitis C, entre otros, durante las actividades de atención a
pacientes o durante el trabajo con sus fluidos o tejidos corporales.
Las precauciones universales parten del siguiente principio:
“Todos los pacientes y sus fluidos corporales independientemente del

diagnóstico de ingreso o motivo por el cual haya entrado al hospital o clínica,
deberán ser considerados como potencialmente infectantes y se debe tomar las
precauciones necesarias para prevenir que ocurra transmisión.” Es así que el
trabajador de la salud debe asumir que cualquier paciente puede estar infectado por
algún agente transmisible por sangre y que, por tanto, debe protegerse con los medios
adecuados.
Líquidos de precaución universal

Los líquidos que se consideran como potencialmente infectantes son:
· Sangre.
· Semen.
· Secreción vaginal.
· Leche materna.
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· Líquido cefalorraquídeo.
· Líquido sinovial.
· Líquido pleural.
· Líquido amniótico.
· Líquido peritoneal.
· Líquido pericárdico.
· Cualquier otro líquido contaminado con sangre.
Las heces, orina, secreción nasal, esputo, vómito y saliva, no se consideran líquidos
potencialmente infectantes, excepto si están visiblemente contaminados con sangre.
Para que la transmisión del VIH pueda ser efectiva es necesario que el virus viable,
procedente de un individuo infectado, atraviese las barreras naturales, la piel o las
mucosas. Esto ocurre cuando las secreciones contaminadas con una cantidad
suficiente de partículas virales libres y de células infectadas, entran en contacto con
los tejidos de una persona a través de una solución de continuidad de la piel (cómo
úlceras, dermatitis, escoriaciones y traumatismos con elementos cortopunzantes) o
contacto directo con las mucosas.
El Virus de la Hepatitis B posee una mayor capacidad de infección que el VIH; se
estima que un contacto con el virus a través de los mecanismos de transmisión
ocupacional, pinchazos con agujas contaminadas con sangre de pacientes portadores,
desarrollan la infección hasta un 30 - 40% de los individuos expuestos, mientras que
con el VIH es menor del 1% el riesgo ocupacional. Sin embargo, el riesgo de adquirir
accidentalmente y desarrollar la enfermedad con el VIH y el VHB existe.1
Bioseguridad en el laboratorio
La bioseguridad en el laboratorio se refiere a un conjunto de protocolos de trabajo que

suministra el conocimiento del riesgo, las normas de prevención y las indicaciones
de actuación para cuando ocurra un accidente. La seguridad incluye dos factores
determinantes: el factor objetivo relativo al riesgo y el factor humano, quien es el que lo
maneja y toma las respectivas precauciones.
Tipos de daños o lesiones

Los daños que se pueden presentar incluyen, los de efecto inmediato, por ejemplo, la
quemadura por un ácido y los indirectos, es decir, que no se manifiestan en el
momento; por ejemplo, la exposición a una sustancia tóxica, la contaminación por mal
manejo de material biológico.
Señalización, signos y recomendaciones

La señalización normalizada es necesaria para la seguridad, pues indica de manera
inmediata los posibles peligros de carácter general. Existen múltiples señales
reconocidas internacionalmente que informan aspectos diferentes:
 Riesgos para la salud-color azul.
 Inflamable-color rojo.
 Grado de inestabilidad de compuestos-color amarillo.
Algunos símbolos designan peligros:

 Atención a sustancias explosivas.
 Materias que aumentan la combustibilidad.
1
MINISTERIO DE SALUD. Conductas Básicas En Bioseguridad: Manejo Integral. Santa Fe de Bogotá. 1997. P. 8-9.
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 Atención a sustancias inflamables.

 Veneno.
 Sustancias agresivas.
 Perjudicial para la salud.
 Atención sustancias radiactivas.
Precauciones de importancia
Llevar guantes puestos.
Uso de máscaras antigas.
Señales de salvamento
 Se deben colocar en las salidas de emergencia.
 Productos que no llevan señalización de seguridad, no quiere decir que no sean
peligrosos.
 Normas de seguridad para el personal de laboratorio.
 La seguridad como prevención viene definida por una serie de barreras:
Primarias: Localizadas en torno al origen del riesgo. Ejemplo, hacer la práctica

adecuadamente.
Secundarias: Localizadas en el círculo del practicante. Ejemplo, la relacionada con la

higiene personal (pelo recogido para evitar que se queme con los mecheros, o que
provoque la caída de tubos de ensayo y reactivos).
Terciarias: Localizadas alrededor del laboratorio. Ejemplo, material tóxico del

laboratorio.2
4.Materiales
No aplica.
5. Reactivos
No aplica.
6.Procedimiento
1. Organice grupos de trabajo.
2. Lea detenidamente las normas de seguridad escritas en la guía e información
anexa y socialice las normas.
Cuestionario
 Dibuje los símbolos que indican peligros, señales de prohibición y precauciones
importantes.
 Consulte cuál es la utilidad de las claves R-S.
 Consulte los riesgos relativos al manejo de los siguientes equipos:
1. Centrífugas.
2. Espectrofotómetros.
3. Baños serológicos.
4. Campanas extractoras.
5. Balanzas.
7. Nivel de Riesgo:
2
Disponible en Internet: http://www.ecomed.org.ar/notas/articulos/varios/down/articulos_bioseguridad.pdf
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 Nivel 1: Riesgo Bajo (Bata de Laboratorio Manga Larga, Zapato Cerrado Bajo,
Pantalón Largo).
Manejo de residuos:
 No aplica
8. Bibliografías
MINISTERIO DE SALUD. Conductas Básicas En Bioseguridad: Manejo Integral.
Bogotá D.C. 1997. P. 8-9.
Disponible en Internet:
http://www.ecomed.org.ar/notas/articulos/varios/down/articulos_bioseguridad.pdf
Disponible en Internet: http://www.qo.fcen.uba.ar/normas.htm.
PRACTICA Nº 2
1. SOLUCIONES BUFFER
2.Objetivos
 Determinar la capacidad amortiguadora de una solución buffer.
 Analizar la importancia de las soluciones buffer en diversos sistemas biológicos
3.Marco Teórico
Sistemas de Tampón - Soluciones Buffer – Sistemas Amortiguadores
Una solución amortiguadora consiste en una mezcla de un ácido débil y su base

conjugada. Las soluciones amortiguadoras tienden a resistir cambios de pH cuando se
agregan cantidades moderadas de ácidos o bases fuertes.
Las soluciones amortiguadoras pueden mantener el pH en un valor relativamente

constante gracias a la presencia de cantidades considerables tanto del ácido como de
su base conjugada. Esta condición se satisface a valores de pH cercanos al pKa del
ácido. Si se añade OH-, estará presente en solución una cantidad apreciable de la
forma ácida del amortiguador que puede reaccionar con la base agregada. Si se
añade H+ también habrá una cantidad apreciable de la forma básica del amortiguador
que puede reaccionar con el ácido añadido. 3
Tenemos el ejemplo del ácido fosfórico, un ácido débil (H2PO4-) que al disociarse
forma su base conjugada (HPO4-) el pH al cual este ácido comienza a disociarse es de
7.2, es decir este es su pKa, por lo tanto las dos formas ácido débil como base
conjugada se mantienen a concentraciones adecuadas para amortiguar soluciones a
este pH. A valores de pH por debajo del pKa predomina la forma ácida, y a valores de
3
MATHEWS, et al. Bioquímica. 3a. Editorial Mac Graw Hill. 2000. P.50-53.
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pH por arriba del pKa predomina la forma básica.
La condición de que un amortiguador contenga cantidades apreciables tanto de ácido

débil como de base conjugada aplica tanto a la proporción de las dos formas como a la
cantidad absoluta de cada una presente en la solución. Un amortiguador que
contienen cantidades más altas tanto de ácido como de base tiene una mayor
capacidad amortiguadora.
Elaboración de Amortiguadores:
Cuando estudiamos los amortiguadores en teoría, es común usar la ecuación de

Henderson- Hasselbalch y efectuar muchos cálculos de proporciones base
conjugada: ácido. En la práctica, preparar un amortiguador es mucho más sencillo.
Para tener un amortiguador, lo único que se necesita es incluir cantidades razonables
de las dos formas del amortiguador en la solución. Esto puede lograrse añadiendo
cantidades predeterminadas de la forma básica conjugada(A-) a la forma ácida (HA), o
bien, podríamos partir de una y crear la otra.. Para hacer un amortiguador podríamos
partir de la forma HA y añadir NAOH hasta tener el pH correcto, lo que se determina
con un medidor de pH también podríamos partir de la forma A- y añadir HCl hasta
llegar al pH correcto. Dependiendo de la relación entre el pH deseado y el pKa del
amortiguador, podría ser más conveniente partir de una forma o de la otra. Por
ejemplo, si vamos a hacer un amortiguador de ácido acético/acetato a pH 5.7, sería
más lógico partir de la forma A- y añadir un poco HCl para bajar el pH a 5.7, que a
partir de HA y tener que añadir mucho más NaOH para subirle pH hasta rebasar el
Pka. 4
Desde otro punto de vista supóngase que un bioquímico desea estudiar una reacción
de pH 4.0, puede tratarse de una reacción que genere o consuma protones. Para
evitar que el pH se modifique demasiado durante la reacción, el investigador debe
utilizar una solución amortiguadora consiste en una mezcla determinada de un ácido
débil y su base conjugada. En este ejemplo, una selección sería utilizar un
amortiguador ácido fórmico/formiato, puesto que su el pKa del ácido fórmico es de 3.75
está cerca del valor de pH requerido. Una mezcla de ácido acético/acetato no sería tan
adecuada porque el pKa del ácido acético que es de 4.6. 5
La proporción de ácido fórmico/formiato necesaria para mantener el ph de 4.0 se

puede calcular a partir de la ecuación de Henderson- Hasselbalch así:
Ph= pka+log base conjugada/ácido débil.
4.0=3.75 +log  HCOO / HCOOH .
Para calcular la proporción base/ácido, restamos 3.75 de 4.0, y tomamos el

antilogaritmo de ambos lados de la ecuación (1):
 HCOO / HCOOH = 100.25= 1.78 6
4
CAMPBELL, M. K, Farell, S. O. Bioquímica.4ª Ed .México. Thomson. 2004. P. -53-55.
5
MATHEWS, et al. Bioquímica. 3a. Editorial Mac Graw Hill. 2000. Pág.:50-53.
6
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Este amortiguador puede obtenerse, por ejemplo, mezclando volúmenes iguales de

ácido fórmico 0.1 M y formiato 0.178 M. También se puede prepararse una solución
amortiguadora titulando una solución de 0.1 M de ácido fórmico hasta pH 4.0 con
hidróxido de sodio. 7
Selección de amortiguadores
Una buena parte de la bioquímica se estudia efectuando reacciones enzimáticas en un

tubo de ensayo (in Vitro) o, sea en vidrio. Tales reacciones suelen amortiguarse para
mantener un pH constante pues las enzimas al ser proteínas con grupos ionizables
necesitan mantenerlos en determinadas formas (ionizados o no) para su correcta y
eficaz función. Debido a que esta ionización depende del pH celular, es importante que
existan compuestos que ayuden a amortiguarlo. Así mismo, prácticamente todos los
métodos para aislar enzimas y otras proteínas e incluso para cultivar tejidos utilizan
soluciones amortiguadoras. 8
Los criterios siguientes se aplican por lo común al seleccionar un amortiguador para
una reacción bioquímica:
1. pka apropiado para el amortiguador
2. Ninguna interferencia con la reacción o la detección del ensayo
3. Concentración iónica apropiada del amortiguador
4. Aspectos de solubilidad
5. Naturaleza no biológica del amortiguador.
4.Materiales
 1 Vidrio de reloj.
 1 Espátula.
 4 vasos de precipitado de 100 ml.
 1 pipeta graduada de 25ml.
 1 pipeta graduada de 1ml.
 1 Balón aforado de 100 ml.
 1 frasco lavador.
 1 churrusco.
Equipos
 Balanza.
 Potenciómetro.
5. Reactivos
 K2HPO4.
 KH2PO4.
 Na2HPO4.
 NaH2PO4.
 Agua destilada.
 HCl 1 M.
 NaOH 1M.
6. Procedimiento
7
MATHEWS, et al. Bioquímica. 3a. Editorial Mac Graw Hill. 2000. P.50-53.
8
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A. Cálculos para preparar la siguiente solución amortiguadora

Prepare 100ml de una solución amortiguadora de:
 Fosfatos (Na2HPO4 NaH2PO4) 0.25 M a pH 7.30 Tenga en cuenta que el pKa de
este ácido es de 7.21.
 Fosfatos (k2HPO4 kH2PO) 0.25 M a pH 7.30 Tenga en cuenta que el pKa de este
ácido es de 6.80.
Ecuación de Henderson Hasselbalch
pH = pKa + log A-/AH
B. Medición de pH de las soluciones sin ácido y sin base

En dos vasos por separado mida 50 ml de la solución de fosfatos que usted preparó y
en otros dos vasos mida 50 ml de agua desionizada en cada uno. Luego mida en el
potenciómetro el pH de cada una de las soluciones.
C. Medición de pH de las soluciones con ácido

Con una pipeta graduada de 1 ml mida 0.5 ml de HCl 1M agregue en cada uno de los
vasos (agua y solución amortiguadora) esta cantidad de ácido. Mida el pH de cada
solución. Anote los resultados.
D. Medición de pH de las soluciones con base

Con una pipeta graduada de 1 ml mida 0.5 ml de NaOH 1M agregue en cada uno de
los vasos (agua y solución amortiguadora) esta cantidad de base. Mida el pH de cada
solución. Anote los resultados.
E. Análisis de Resultados
Compare los resultados de las mediciones y explique brevemente.
Preguntas de consulta
1. Defina solución amortiguadora y sus componentes
2. ¿Qué se entiende por ácido y su base conjugada?
3. Consulte la fórmula química o molecular del sistema amortiguador ácido carbónico
en la célula.
4. Identifique: ¿cuál es el ácido y la base conjugada? Y ¿por qué?
5. Escriba la ecuación de equilibrio para el sistema buffer anterior.
6. ¿Cuál es el pKa de este sistema buffer? Defina que es Pka y qué importancia
tiene.
7. Explique por qué es importante para la célula la existencia de sistemas
amortiguadores.
8. Cite ejemplos en donde se ponga en evidencia la importancia biológica de las
soluciones amortiguadoras a nivel celular.
9. ¿Cómo participan el aparato respiratorio y el riñón en el control del pH sanguíneo?
10. Consulte cuales sistemas amortiguadores comúnmente utilizados en el laboratorio
de bioquímica
7. Nivel de Riesgo:
 Nivel 2: Riesgo Medio (Bata de Laboratorio, Guantes, Cofia, Tapabocas, Zapato

Cerrado Bajo, Pantalón Largo).
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Manejo de residuos:
 Línea 8
8. Bibliografías
MATHEWS, et al. Bioquímica. 3a. Editorial Mac Graw Hill. 2000. P. 50-53.
PRACTICA Nº 3
1. PRECIPITACIÓN DIFERENCIAL DE PROTEÍNAS
2.Objetivos
 Reconocer la importancia de la fuerza iónica como método de separación de
proteínas.
 Separar proteínas de una mezcla mediante precipitación diferencial con sulfato de
amonio.
 Observar las proteínas totales de la mezcla y de las fracciones mediante método
cualitativo colorimétrico de Biuret.
3.Marco Teórico
Las proteínas biológicamente activas son polímeros formados por aminoácidos que se
eslabonan mediante enlaces peptídicos covalentes.
Proteínas plasmáticas
La sangre está constituida por formas celulares en suspensión (eritrocitos, leucocitos y

plaquetas) en un medio líquido llamado plasma. El plasma se obtiene cuando,
inmediatamente después de extraer la sangre, se le agregan anticoagulantes como
oxalato, citrato, EDTA o heparina y se centrifuga. Si se recoge sangre sin
anticoagulante y se deja que ésta coagule, el líquido que se separa se llama suero. El
suero carece de células y de factores de la coagulación incluyendo la proteína
fibrinógeno, pues ésta ha sido transformada en fibrina insoluble en el proceso de la
coagulación. El fibrinógeno constituye sólo de 3 a 6% del total de las proteínas en
plasma.
El agua constituye 92 a 93% del plasma o suero y en ella encontramos electrolitos,
metabolitos, nutrientes, hormonas y proteínas en una proporción de 7 a 8%; de estos
solutos presentes, las proteínas son las que están en máxima proporción,
aproximadamente 6 a 8 g/dl de suero y este valor es 0.2 a 0.4 g/dl mayor en plasma
por la presencia de fibrinógeno.
Las proteínas plasmáticas son un grupo de más de 100 moléculas distintas con
características y funciones muy diversas, aunque para fines prácticos el término
"proteína plasmática" se usa para todas aquellas proteínas cuya concentración en el
plasma sea mayor a 10 mg/dl y que cumplan con alguna función específica dentro de
él. Aproximadamente son 20 las proteínas que cumplen con ambas definiciones.
Todas estas proteínas, a excepción del fibrinógeno, se encuentran tanto en plasma
como en suero.
Precipitación con fuerza iónica

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Dado que una célula contiene miles de proteínas distintas la tares de separarlas y
determinar la estructura de una sola proteína es en extremo difícil pero no imposible. 9
Para separar las moléculas el bioquímico aprovecha las diferencias que existen entre
ellas. Tales diferencias pueden ser solubilidad, tamaño, masa, carga eléctrica o
afinidad por otras moléculas. 10
Para pasar desde los tejidos a un material purificado, solemos utilizar diversas
técnicas distintas de modo secuencial. Una de las formas más antigua, más simple u
aun bastante eficaz para llevar a cabo la separación de una mezcla de proteínas es
utilizar la solubilidad diferente en disoluciones salinas concentradas.
Las proteínas se hacen insolubles en presencia de concentraciones elevadas de sales
y esta solubilidad varía mucho entre una proteína y otra y en disoluciones
concentradas varía rápidamente con la fuerza iónica.
Unas proteínas por ser un anfolito tienen muchos grupos ionizables ácidos y básicos;
las moléculas pueden tener una carga positiva, cero o negativa, dependiendo del pH
de la solución.
Por otro lado, al ser un polieléctrolito tienen múltiples grupos ionizables con una sola
clase de carga. Es decir, al comportarse como un anfólito o polieléctrolito depende del
pH y de la presencia de pequeños iones, que apantallan los macro iones de las otras
cargas. 11
Las proteínas se mantienen disueltas gracias a las interacciones no covalentes

(puentes de hidrógeno) con el agua. Al agregar a una solución de proteínas una sal
esta se disocia formando iones, estos iones hacen una fuerza que puede ser débil o
fuerte. Cuando la fuerza iónica es débil, la atmósfera contra iónica es muy extensa o
grande, (en este caso el de las proteínas) y el apantallamiento de la sal es ineficaz, la
fuerza iónica aumenta, la atmósfera contra iónica se contrae y se concentra alrededor
del macroión, y las interacciones de los grupos negativos y positivos se apantallan con
eficacia.
El aumento de la fuerza iónica hasta un determinado punto aumenta la solubilidad de

las proteínas. Este efecto de disolver las proteínas incrementando la concentración
salina se denomina “saltin in”. Si este nivel se sobrepasa causa el efecto opuesto, en
soluciones salinas muy concentradas, gran parte del agua que normalmente solvata a
la proteína y ayuda a solubilizarlas está enlazada a los iones de la sal, impidiendo una
hidratación suficiente de la proteína y precipitan. Este efecto se denomina “saltin
out”.12. Estas proteínas se separan posteriormente por centrifugación.
El sulfato de amonio se emplea con frecuencia para estas precipitaciones selectivas o
diferenciales debido a que pueden conseguirse fuerzas iónicas bastantes altas sin
dañar las proteínas
A partir de una mezcla de proteínas, en esta práctica se harán precipitaciones al 40%

y al 70% de saturación con sulfato de amonio y se cuantificará la concentración de
proteínas de la mezcla y de cada uno de los sobrenadantes obtenidos después de
efectuada la precipitación.
El volumen de la solución saturada de sulfato de amonio necesario para una

determinada saturación se calcula mediante la siguiente ecuación:
9
CAMPBELL, M. K, Farell, S. O. Bioquímica.4ª Ed .México. Thomson. 2004. P. 116 -119.
10
MATHEWS, et al. Bioquímica. 3a. Editorial Mac Graw Hill. 2.000. P. 54-57; 166-167.
11
12
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Vs = Vp (S2-S1)
(1-S2)
En donde:
Vs = volumen de la solución saturada de sulfato de amonio
Vp= Volumen de la mezcla de proteínas
S1= Saturación inicial expresada como fracción
S2 = Saturación final expresada como fracción.
Identificación de proteínas mediante la reacción con el reactivo de Biuret
La presencia de proteínas en una mezcla se puede determinar mediante la reacción

del Biuret. El reactivo de Biuret contiene CuSO4 en solución acuosa alcalina (gracias a
la presencia de NaOH o KOH). La reacción se basa en la formación de un compuesto
de color violeta, debido a la formación de un complejo de coordinación entre los iones
Cu2+ y los pares de electrones no compartidos del nitrógeno que forma parte de los
enlaces peptídicos.
O C C O
HN NH
R CH HC R
Cu2+
O C C O
HN NH
R CH HC R
La reacción debe su nombre al biuret, una molécula formada a partir de dos de urea
(H2N-CO-NH-CO-NH2), que es la más sencilla que da positiva esta reacción, común a
todos los compuestos que tengan dos o más enlaces peptídicos consecutivos en sus
moléculas.13
4. Materiales
 1 vaso de precipitados de 250 ml.
 2 tubos de centrífuga plásticos.
 8 tubos de ensayo.
 3 pipetas de 5 ml.
 3 pipetas de 1 ml.
Equipos
 Centrífuga.
13
http://www.uam.es/personal_pdi/ciencias/bolarios/BiologiaCCAA/Guiones/Practica1.htm
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5. Reactivos
 Solución de proteínas plasmáticas.
 Sulfato de amonio saturado al 50%.
 Reactivo de Biuret.
 Hielo.
6. Procedimiento
A. Cálculos del volumen de la solución saturante:

Aplique la ecuación para el cálculo del volumen de la sustancia saturante, calcule el
volumen del sulfato de amonio necesario para precipitar el 40% y el 70% de proteínas.
B. Precipitación al 40 %:
Coloque en un tubo de ensayo 3 ml de solución de proteínas de saturación inicial S1

(0%) en el vaso de precipitado grande y que contenga hielo. Agregue lentamente la
solución de sulfato de amonio necesaria para precipitar proteínas al 40% de saturación
(S2). Deje en reposos durante 10 minutos y centrifugue por 10 minutos a 3.500 rpm. Si
el sobrenadante no es claro, repita el procedimiento. Obtenga de éste 1 ml y
deposítelo en un tubo marcado como 40% y añádale 2 ml de reactivo de Biuret.
(Márquelo como 40%).
En otro tubo coloque 1 ml de la solución de proteínas al 100% y añádale 2ml de
reactivo de Biuret. (Márquelo como 100%).
C. Precipitación al 70 %:
Obtenga del sobrenadante anterior 1 ml en un tubo y márquelo como 40 %, mida el

volumen restante, deposítelo en un tubo de centrífuga mantenido en hielo y agregue
lentamente el volumen de sulfato de amonio necesario para precipitar proteínas al
70% de saturación. Deje en reposo durante 10 minutos y centrifugue por 10 minutos a
3.500 rpm. Si el sobrenadante no es claro no siga el procedimiento con este. Separe el
sobrenadante deposítelo en otro tubo y añádale 2ml de reactivo de Biuret y márquelo
como 70%.
D. Interpretación de resultados
¿Qué porcentaje de proteína se encuentra en el sobrenadante de cada tubo?
¿A que porcentaje de precipitación corresponde cada tubo?
¿Represente con un dibujo como la fuerza iónica esta afectando la solubilidad de las
proteínas en cada tubo?
Cuestionario
1. ¿Cómo se clasifican las proteínas según su solubilidad?
2. ¿Qué se entiende por fuerza iónica? Indique con un dibujo.
3. ¿Qué se entiende por electroforesis?
4. Consulte como se separan electroforéticamente las proteínas del plasma
sanguíneo. Realice un dibujo.
5. Que importancia tiene este examen a nivel clínico.
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7. Nivel de Riesgo:

Cerrado Bajo, Pantalón Largo)
Manejo de residuos:
 Línea 8
8.Bibliografías
CAMPBELL, M. K, Farell, S. O. Bioquímica.4ª Ed .México. Thomson. 2004. P. 116 -
119.
PRACTICA Nº 4
1. REACCIONES ENZIMÁTICAS
2.Objetivos
 Reconocer a las enzimas como proteínas que aceleran y controlan las reacciones
químicas en los seres vivos.
 Identificar la presencia de diversas clases de enzimas en tejidos animales y
vegetales.
 Aplicar los componentes teóricos en las reacciones enzimáticas observadas.
 Discutir la presencia de inhibidores enzimáticos que pueden preservar algunos
alimentos.
3.Marco Teórico
Un automóvil obtiene su energía de la oxidación del hidrocarburo gasolina a dióxido de
carbono y agua en una explosión controlada dentro de un motor en el que los gases
pueden alcanzar temperaturas de 2200 ºC. En contraste, la célula viva obtiene energía
oxidando el carbohidrato glucosa a dióxido de carbono y agua a una temperatura (en
el ser humano) de 37ºC.14
El ingrediente secreto en los organismos vivos es la catálisis, un proceso llevado a

cabo por enzimas proteínicas. Una reacción que requiere muchas horas para
completarse no puede ser útil, desde el punto de vista metabólico, para una bacteria
que ha de reproducirse en 20 minutos, o para una célula nerviosa humana que debe
responder a un estímulo de forma instantánea.
De hecho la vida aprovecha hábilmente el hecho de que la mayoría de las reacciones

deban estar catalizadas.
Un catalizador es una sustancia que aumenta la rapidez o la velocidad de la reacción
química, sin verse alterada ella misma en el proceso global. La sustancia sobre la que
actúa una enzima se denomina sustrato de esa enzima. Y lo que se obtiene es
denominado producto de la reacción.
Podemos apreciar el poder de la catálisis enzimática con un ejemplo: la
descomposición del peroxido de hidrógeno en agua y oxígeno:
14
CAMPBELL, M. K, Farell, S. O. Bioquímica.4ª Ed .México. Thomson. 2004. P. -134-135
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2H2O2 a 2H2O +O2
Esta reacción, auque muy favorecida termodinámicamente, es muy lenta, a menos que
sea catalizada. Se puede comprar una botella de una solución de H2O2 (agua
oxigenada) y guardarla en un armario durante muchos meses antes de que se
degrade. Sin embargo, si añadiera un trocito de ión férrico, observaría que la velocidad
de la reacción aumenta unas 1000 veces. La proteína hemoglobina que contienen
hierro, es aun más eficaz para incrementar la velocidad de esta reacción. Si uno aplica
la solución de peróxido de hidrógeno a un corte de un dedo, se observa un burbujeo
inmediato del O2 liberado: la reacción se está produciendo ahora aproximadamente un
millón de veces más rápidamente que el proceso sin catalizar. Pero pueden
alcanzarse velocidades aún. La catalasa una enzima presente en muchas células,
aumenta la velocidad de descomposición del H2O2 sin catalizar aproximadamente
1000 millones de veces. Algunas reacciones celulares producen peróxido de
hidrógeno que es un oxidante peligroso, por lo que la catalasa se ha perfeccionado
para defenderse de él.
Este ejemplo muestra que la velocidad de una reacción favorable depende en gran
medida, de que exista o no un catalizador y de la naturaleza del mismo.15
4. Materiales
Papa.
Cuchillo.
Manzana.
Mortero.
Cuchara o espátula.
Portaobjetos.
Pipeta Pasteur.
1 Vaso de precipitados 50 ml.
5. Reactivos
100 ml de peróxido de hidrógeno o “agua oxigenada” comercial.
1 Pastilla de vitamina C.
6.Procedimiento
A. Presencia de polifenol oxidasa de manzana
1. Moler una pastilla de vitamina C hasta que quede un polvo fino - Cortar una
manzana por la mitad.
2. Colocar en una mitad de la manzana el polvo de la vitamina C, procurando que
quede bien esparcido.
3. Dejar ambas mitades de manzana a temperatura ambiente durante 60 minutos y
observar los cambios de coloración.
B. Presencia de catalasa de papa

1. Cortar una rebanada de papa y colocarla sobre un portaobjetos.
2. Agregar 3 gotas de agua oxigenada sobre la rebanada de papa.
3. Ver la actividad de la catalasa por el burbujeo de oxígeno que se desprende.
4. Observar el tiempo en el cual se llevan a cabo la reacción.
C. Interpretación de resultados
15
MATHEWS, et al. Bioquímica. 3a. Editorial Mac Graw Hill. 2.000. P. 404-405
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Después de efectuar todos los experimentos en cada caso:

1. ¿Cómo evidencia que se produjo una reacción enzimática?
2. ¿A qué se debe la presencia del color marrón en la manzana que no tiene vitamina
C?
3. ¿Qué papel desempeña la vitamina C sobre la manzana expuesta al oxígeno?
4. ¿A qué se debe la producción de burbujas en el experimento de la catalasa?
5. ¿Y cuando dejan de formarse?
6. ¿Qué es lo que estamos midiendo en ese caso?
7. ¿Cómo comprobar que el gas desprendido en el experimento con catalasa es
oxígeno?
Cuestionario
1. Diseñe un experimento para averiguar cómo varía la velocidad de la reacción. Y
así poder determinar que tan veloz y afín es la enzima por su sustrato en el caso de
los experimentos realizados en clase. Realice un esquema.
2. ¿Cómo calculan la velocidad total de cada una de las reacciones realizadas en el
laboratorio?
3. ¿Cuál es el efecto de agregar diferentes cantidades de sustrato sobre la velocidad
de esta reacción? Justifiquen sus conclusiones.
7. Nivel de Riesgo:

Manejo de residuos:
 Línea 19
8. Bibliografías
CAMPBELL, M. K, Farell, S. O. Bioquímica.4ª Ed .México. Thomson. 2004. P. -134-

135
MATHEWS, et al. Bioquímica. 3a. Editorial Mac Graw Hill. 2.000. P. 404-405
PRACTICA Nº 5
1. FACTORES QUE AFECTAN LAS REACCIONES ENZIMÁTICAS
2.Objetivos
 Reconocer que las reacciones enzimáticas dependen de factores como:
temperatura, pH y la presencia de sales.
 Comprobar que el pH es un factor que altera o modifica la actividad enzimática.
 Reconocer que las enzimas son catalizadores orgánicos que sólo se encuentran en
los seres vivos.
3.Marco Teórico
Las enzimas al ser proteínas contienen grupos ionizables, cuyo comportamiento
depende del pH y de las moléculas con carga que se encuentran a su alrededor. Es
bien sabido que la función biológica de las proteínas está directamente relacionada
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con su estructura y si tenemos en cuenta la influencia del medio externo sobre las
proteínas es de pensar que es necesario mantenerlas en un ambiente adecuado para
que su estructura no se modifique y por lo tanto pueden cumplir biológicamente su
función.
Otra variable que influye también sobre la estructura de las proteínas, es la
temperatura. Esta junto con el pH influyen como se describe a continuación:
Influencia de la temperatura:
La temperatura puede causar un incremento de la velocidad de la reacción o el efecto

contrario así:
 Incremento de la velocidad con la temperatura: En general, la velocidad de

la reacción se incrementa con la temperatura hasta que un punto máximo es
alcanzado. Este incremento se debe a que aumenta el número de moléculas
ricas en energía que pueden pasar la barrera energética de estado de
transición, para formar a los productos.
 Decremento de la velocidad con la temperatura: la elevación excesiva de la
temperatura del medio que contiene a las enzimas, resulta en un decremento
de la velocidad como resultado de la desnaturalización, es decir, la pérdida de
la estructura tridimensional de las enzimas.16 En este momento se rompen
enlaces de tipo no covalente como los puentes de hidrógeno que estabilizan
las estructuras secundarias e incluso terciarias.
La mayor parte de las enzimas presentan su actividad máxima en el intervalo

de 30 a 40 °C y por encima de 45°C comienzan a desnaturalizarse. La
desnaturalización de una proteína se ha definido como:
“Un cambio de importancia en la estructura original, sin rotura de ninguno de los

enlaces químicos primarios que unen entre sí a los aminoácidos “17. Es decir solo hay
rompimiento de los enlaces no covalente tipo puentes de hidrógeno.
El término inactivación de una enzima se refiere a la pérdida de la actividad. Las
temperaturas de refrigeración, congelación, escaldado, blanqueado también inactivan
a las enzimas.
Influencia del pH:
El sitio activo de la enzima puede contener aminoácidos ionizables, la concentración

de H+ afecta la velocidad de la reacción en muchas formas. Primero el proceso
catalítico usualmente requiere que la enzima y el sustrato tengan grupos químicos en
una forma iónica particular para poder interactuar. Por ejemplo la actividad catalítica
puede necesitar a un grupo amino, por ejemplo de una lisina en estado protonado (-
NH3+) o no (-NH2+), el pH modifica este estado y por tanto a la velocidad de la
reacción.18.Esto puede causar efectos como:
16
http://laguna.fmedic.unam.mx/~evazquez/0403/velocidad%20reaccion%20enzimatica.html
17
http://www.csgastronomia.edu.mx/profesores/calimentos/quimica2/Capitulo%20VI/enzimas%20siguiente.htm.
18
http://laguna.fmedic.unam.mx/~evazquez/0403/velocidad%20reaccion%20enzimatica.html
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 Desnaturalización de la enzima: pH extremos pueden ocasionar la

desnaturalización de las enzimas, debido a que la estructura con estos
cambios es posible modificar las interacciones iónicas que intervienen en la
estabilidad de la enzima en su estado nativo.
 El pH óptimo varía para las diferentes enzimas: El pH al cual las enzimas

adquieren su máxima actividad al que se le denomina “pH óptimo”. es diferente
para cada una de ellas y depende de la secuencia de aminoácidos que las
conforman, por supuesto, también está relacionado con el microambiente
celular en el cual desarrollan su catálisis. La mayor parte de las enzimas
presentan su actividad máxima a pH entre (4,5 - 8). Pero existen enzimas como
Por ejemplo la pepsina que es una enzima digestiva que actúa en el estómago,
posee un pH óptimo de alrededor de 2 unidades, por el contrario, otras
enzimas que actúan a pH neutro, o la arginasa cuyo pH es de 10 otras se
desnaturalizan a pH alcalino o ácido.
Al comprobar experimentalmente la influencia del pH y la temperatura en la velocidad

de las reacciones enzimáticas se obtienen curvas que indican que los enzimas
presentan un pH y una temperatura óptima de actividad. (Ver figura abajo).19
 En general el pH puede afectar:

 Al centro activo que puede contener aminoácidos con grupos ionizados que
pueden variar con el pH.
 La ionización de aminoácidos que no están en el centro activo puede provocar
modificaciones en la conformación de la enzima.
 El sustrato puede verse afectado por las variaciones del pH.
4.Materiales
Portaobjetos.
1 papa.
1 hoja de planta.
1 corazón de pollo.
Polvo de levadura.
1 champiñón.
Pinzas.
Vasos desechables.
Limón.
Cuchara.
Mechero.
Malla.
Trípode.
19
http://www.csgastronomia.edu.mx/profesores/calimentos/quimica2/Capitulo%20VI/enzimas%20siguiente.htm
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Equipos
Baño serológico.
5. Reactivos
100 ml de peróxido de hidrógeno.
HCl concentrado.
Papel de pH.
Azúcar .
Sal.
Limadura de hierro.
Hielo.
6.Procedimiento
A. Factores que afectan la catalasa
En una cuadrícula organiza dos portaobjetos con el material indicado, como se
muestra en el dibujo:
Azúca Sa Pap Hoj Corazó Levadur Champiñó Limadur

r l a a n a n a
SR-sin reacción L-lento R-rápido MR-muy rápido
Un portaobjetos es para evidenciar la actividad enzimática sin agregarle HCl; y el otro

para evidenciar la reacción enzimática agregando HCl:
1. Mida el pH de cada material sin agregar HCl con el papel indicador de pH.
2. Adicione una gota de peróxido de hidrógeno a cada material. Observe la presencia
de burbujas.
3. Agregue una gotica de HCl y con el papel indicador vuelva a medir el pH agregue
una gótica de peróxido de hidrógeno.
4. Observe y anote lo que ocurrió en cada uno de los portaobjetos, antes y después
de agregar el peróxido de hidrógeno, marca la reacción a “ojo” de acuerdo al pH=5
y pH=1.
B. Factores que afectan de las enzimas del metabolismo de la levadura

1. Marcar los vasos con los siguientes títulos: control, caliente, frío, ácido y sal.
2. Colocar en 5 vasos desechables transparentes una cantidad igual del polvo de
levadura, azúcar y 50 ml de agua tibia.
3. El vaso denominado control debe contener solo la mezcla anterior.
4. Mida el tiempo desde que le agregue el azúcar a la levadura y la aparición de
burbujas en el vaso control.
5. Al vaso marcado como frió colocarlo sobre el hielo. Compare con el vaso control.
6. Al vaso marcado como caliente colocarlo sobre el baño serológico. Compare con el
vaso control.
7. Al vaso marcado como ácido añadirle jugo de limón. Compare con el vaso control.
8. Al vaso marcado como sal añadirle una cucharada de sal.
9. Dejar todos los vasos durante 60 minutos y al final observar la actividad de las
enzimas por la producción de bióxido de carbono que se ve en la formación de
espuma.
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C. Interpretación de los resultados

Con base en los siguientes parámetros.
SR-sin reacción L-lento R-rápido MR-muy rápido
Cuestionario
1. ¿Cómo la temperatura el pH y las sales afectan la estructura química de las
enzimas?
2. ¿Cómo se verán afectados los parámetros cinéticos de las enzimas?
3. ¿Podrían esos factores ser inhibidores enzimáticos?
4. ¿Cuál de los materiales de la práctica se clasifican como vivos y no vivos?
Justifique su respuesta
5. Identifique la o las enzimas con las cuales usted evidenció la reacción en cada
tejido vivo. ¿En cual material de la práctica se encuentran estas enzimas?
6. Cuál es la reacción que efectúa cada enzima.
7. En la reacción bioquímica que describe cada proceso. Identifique sustrato, enzima
producto coenzima.
8. ¿Cuáles factores afectaron el metabolismo de las células de cada tejido? Dé una
explicación química.
9. ¿Qué indica el tiempo durante el cual salen burbujas? Consulte la actividad de una
enzima de la levadura, en otras frutas o verduras.
10. ¿Por qué la limadura de hierro siendo un elemento sin vida se observa la
presencia de burbujas?
7. Nivel de Riesgo:

Manejo de residuos:
 Línea 18
 Línea 1
8. Bibliografías
http://laguna.fmedic.unam.mx/~evazquez/0403/velocidad%20reaccion%20enzimatica.
html
http://www.csgastronomia.edu.mx/profesores/calimentos/quimica2/Capitulo%20VI/enzi
mas%20siguiente.htm.
PRACTICA Nº 6
1. FERMENTACIÓN ALCOHÓLICA
2.Objetivos
 Reconocer el proceso de fermentación como un procesos metabólico realizado por
diversos microorganismos a partir de compuestos orgánicos como los
carbohidratos.
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 Obtener alcohol etílico a partir de sustancias fermentables: azúcares, panela y

fruta.
 Conocer y aplicar el método de separación de compuestos llamado destilación.
 Realizar pruebas para identificación de alcoholes.
3.Marco Teórico
La mayoría de los organismos consumimos glucosa y la oxidamos para obtener
energía, un producto de esta oxidación es el piruvato, este tiene números destinos
alternativos en los microorganismos anaerobios. Por ejemplo, las bacterias del ácido
láctico reducen el piruvato a lactato en un solo paso. En cambio, las levaduras
convierten el piruvato en etanol en una ruta de dos pasos. Esta fermentación
alcohólica comienza por la piruvato decarboxilasa. Que va seguida de la reducción
del acetaldehído a etanol, que depende del NADH, catalizada por la enzima alcohol
deshidrogenasa. (Ver figura abajo).20
La primera reacción requiere la presencia como coenzima de pirofosfato de tiamina.
Esta coenzima, procedente de la vitamina B1, interviene en varias reacciones de
transferencia de grupos que implican una porción aldehído activada.
Glucosa
Pi
Gliceraldehído 1, 3 Bifosfoglicerato
ADP
NAD+ NADH+ H+ Piruvato ATP

Piruvato decarboxilasa
Etanol Acetaldehído
Alcohol deshidrogenasa
La producción industrial del etanol ha adquirido una importancia tremenda cuando la

humanidad intenta considerar dos problemas serios:
La sustitución del petróleo, no renovable, por fuentes de energía renovables; y la
utilización de los materiales biológicos de desecho. Los esfuerzos en estos campos
necesitan de la bioingeniería para generar cepas bacterianas que puedan convertir
sustancias como la celulosa de los desechos humanos a animales a hexosas.21
Los tejidos animales también tienen alcohol deshidrogenasa, a pesar de que el etanol
no es un producto metabólico importante en los animales.
Algunas de las consecuencias metabólicas importantes de la intoxicación por etanol se
deben a la oxidación del etanol a acetaldehído por esta enzima en el hígado. Primero
se reduce excesivamente el NAD+ a NADH, que agota el flujo que transcurre por la
generación de energía. En segundo lugar, el acetaldehído es bastante tóxico, y
20
MATHEWS, et al. Bioquímica. 3a. Editorial Mac Graw Hill. 2.000. P. 516-518.
21
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muchos de los efectos desagradables de las resacas son consecuencia de las

acciones del acetaldehído y sus metabolitos posteriores.22
La obtención del etanol a partir de una sustancia fermentada se realiza mediante la

técnica de destilación, que consiste en la evaporación parcial de un líquido (teniendo
en cuanta su punto de ebullición), con la transferencia de estos vapores y la
subsiguiente condensación y colección.
4.Materiales
1 Erlenmeyer de 250 ml.
6 Tubos de ensayo
1 Balón de 250 ml para destilación.
1 Gradilla.
2 pipetas graduadas de 5 ml.
1 Mechero.
2 Soportes.
2 Pinzas
1 Pera
1 Churrusco
1 Termómetro
2 Perlas de ebullición.
1 Capsula de porcelana.
1 Aro
1 Malla.
2 Mangueras
1 capsula de porcelana
1 Panela.
1 Libra de Azúcar.
22
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Cáscara de piña.
Uvas
Levadura.
Equipos
Equipo para destilación.
5. Reactivos
Etanol.
2 Propanol.
Terbutanol.
Reactivo de Lucas.
6.Procedimiento
A. Proceso de fermentación
Coloque en un recipiente de 1L una panela rallada, 2 papeletas de levadura (o pesas

25g), agua hasta alcanzar las ¾ partes del volumen del recipiente. Coloque en el
frasco un a tapa con un orificio por donde coloque un pitillo sin tocar la solución. (Si es
posible adicione una mínima cantidad de sulfato de amonio) deje durante
aproximadamente 8 días.
B. Destilación de alcoholes
Decante el producto fermentable y páselo a través de una gasa para filtrar, transfiera
la solución obtenida al balón o erlenmeyer del equipo de destilación y acondicione el
equipo para destilación, tal como se ilustra en la figura.
Ajuste el equipo de destilación simple e inicie el proceso prendiendo la llama en el
mechero. Controle la temperatura para que no sobrecargue los 78ºC. Recoja el
destilado que se produzca en un erlenmeyer.
C. Propiedades químicas de reconocimiento:
1 Combustibilidad: Coloque 1 ml de alcohol obtenido en una cápsula de porcelana y

acerque un fósforo encendido. Observe el tipo de combustión. Repita el procedimiento
con etanol.
2 Prueba de Lucas: tome 4 tubos de ensayo y márquelos, en el primero agregue 1 ml

de alcohol destilado, en los restantes adicione la misma cantidad de los alcoholes:
etanol, 2 propanol y terbutanol, en orden estricto agregue 2 ml del reactivo de Lucas.
Observe que sucede y en cuanto tiempo se produce la reacción. Anote los resultados
y obtenga conclusiones.
7. Nivel de Riesgo:

Manejo de residuos:
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Página
 Línea 1
 Línea 18
Cuestionario
1. ¿En el proceso de destilación para la obtención de etanol? ¿Por qué se agrega
sulfato de amonio?
2. ¿Por qué es necesario realizar un orificio a la tapa del recipiente que contiene la
mezcla fermentadora? ¿Cómo se explica?
3. ¿Por qué es necesario controlar la temperatura en el proceso de destilación? ¿Y
cuál es la razón que sea controlada entre el rango de 75-80 ºC específicamente?
4. Investigue bajo qué procesos metabólicos se puede oxidar los alcoholes y
justifíquelos.
5. Consulte qué otros estilos de destilación se conocen y en qué tipo de separación
deban ser utilizados.
8.Bibliografías
PRACTICA Nº 7
1. SOLUCIONES Y DILUCIONES
2.Objetivos
 Reproducir los conceptos teóricos de soluciones y diluciones en la vida práctica del
laboratorio.
 Identificar, seleccionar, y emplear las fórmulas adecuadas para diferentes procesos
de dilución.
 Practicar de manera hábil la preparación de soluciones y diluciones.
 Mejorar la habilidad y destreza en el manejo de las unidades de concentración
mediante la preparación de soluciones utilizado diluciones en serie.
3.Marco Teórico
Soluciones
Una solución es la mezcla homogénea de dos o más sustancias. Para que dos más
sustancias formen una solución se necesita que estas sean solubles o miscibles. La
solubilidad de un soluto o un solvente, está indicada por la máxima cantidad de soluto
que se disuelve en una determinada cantidad de solvente.
Dilución:
Proceso por el cual una solución concentrada es con vertida en una menos
concentrada (diluida), por la adición de solvente.
Unidades de concentración
Cada sustancia tiene una solubilidad que es la cantidad máxima de soluto que puede
disolverse en una disolución, y depende de condiciones como la temperatura, presión,
y otras substancias disueltas o en suspensión. 23
23
TORRENEGRA, Rubén. Introducción al Análisis Químico Moderno. Bogotá D.C. Publicaciones Universidad
Javeriana. Pontificia Universidad Javeriana.1990. P. 9-25.
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La concentración es la magnitud física que expresa la cantidad de un elemento o un

compuesto por unidad de volumen. 24
El término solubilidad se utiliza tanto para designar al fenómeno cualitativo del proceso
de dilución como para expresar cuantitativamente la concentración de las soluciones.
Puede expresarse en moles por litro, en gramos por litro, o en porcentaje de
soluto/disolvente.
En química, para expresar cuantitativamente la proporción entre un soluto y el

disolvente en una disolución se emplean distintas unidades: molaridad, normalidad,
molalidad, formalidad, porcentaje en peso, porcentaje en volumen, fracción molar,
partes por millón, partes por billón, partes por trillón, etc. También se puede expresar
cualitativamente empleando términos como diluido, para bajas concentraciones, o
concentrado, para altas.
La concentración de una solución se expresa como relaciones en peso, en volumen o

peso-volumen.
Relaciones en peso
Estas son: porcentaje en peso, partes por millón, molalidad, fracción molar. Las dos
primeras son unidades físicas y las dos últimas son relaciones entre unidades
químicas y físicas.
Las unidades físicas utilizadas son: el gramo (g) y sus múltiplos y submúltiplos:
miligramo (mg), nanogramo (ng), kilogramo (Kg), microgramo (µg).
Las unidades denominadas químicas son: la mol-gramo y sus submúltiplos mili y micro
mol (mmol, µmol respectivamente).
 Porcentaje en peso (% p/p): lo indica el número de gramos de soluto presentes

en cien gramos de la solución.
 Partes por millon (ppm): indica las partes de soluto presentes en un millón de
partes de solución (g por tonelada o mg por Kg).
Para expresar concentraciones muy pequeñas, trazas de una sustancia muy diluida en
otra, es común emplear las relaciones partes por millón (ppm), El millón equivale a 106,
el billón estadounidense, o millardo, a 109 y el trillón estadounidense a 1012.
Partes por millón (abreviado como ppm) unidad empleada usualmente para valorar la
presencia de elementos en pequeñas cantidades (traza) en una mezcla. Generalmente
suele referirse a porcentajes en peso en el caso de sólidos y en volumen en el caso de
gases. Se abrevia como ppm. También se puede definir como "la cantidad de materia
contenida en una parte sobre un total de un millón de partes."
Ejemplo: Supongamos que tenemos un cubo homogéneo de un metro de arista, cuyo
volumen es un metro cúbico (m³). Si lo dividimos en 'cubitos' de un centímetro de lado,
obtendríamos un millón de 'cubitos' de un centímetro cúbico, (cm³ o cc). Si tomamos
uno de esos 'cubitos', del millón total de 'cubitos', tendríamos una parte por millón.
24
Disponible en Internet: http://es.wikipedia.org/wiki/Concentraci%C3%B3n.
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 Molalidad (m): representa las moles de soluto en cada kilogramo de solvente.
 Fracción molar (X): relaciona las moles de soluto con las moles totales en la
solución (moles totales son las moles del soluto mas las moles del solvente). Por
ejemplo, en una mezcla binaria de 6 moles de etanol y 4 moles de agua, lo que da un
total de 10 moles, la fracción molar del etanol es de 6/10 = 0,6; mientras que la
fracción molar del agua es 4/10 = 0,4. La suma de todas las fracciones molares de una
mezcla da como resultado la unidad.
Xsoluto=nsoluto/ntotal,
Relaciones en volumen
 Porcentaje en volumen (%v/v): Indica las partes en volumen de soluto por

cada cien partes de solución. Por ejemplo, ml de soluto por cada cien mililitros de
solución.
Relaciones Peso A Volumen
Indica las partes del soluto expresadas en alguna unidad de peso entre el volumen de
la solución.
Gramos por litro (g/l): Se pueden usar también las mismas unidades que para medir
la densidad aunque no conviene confundir ambos conceptos. La densidad de la
mezcla es la masa de la solución entre el volumen de esta mientras que la
concentración en dichas unidades es la masa de soluto entre el volumen de la
disolución. Se suelen usar los gramos por litro (g/l).
Porcentaje peso a volumen (%p/v):
 Gramos por ciento (%g): Indica el número de gramos de soluto que estén
contenidos en cien mililitros de la solución.
 Miligramos por ciento (%mg): representa el número de miligramos de soluto

contenidos en cien mililitros de solución o los mg de soluto por decilitro (mg/dl).
 Molaridad (M)
La molaridad (M) es el número de moles de soluto contenidas en un litro de solución.
Por ejemplo, si se disuelven 0,5 moles de soluto en 100 mL de disolución, se tiene una
concentración de ese soluto de 5,0 M (5,0 molar). Para preparar una disolución de
esta concentración normalmente se disuelve primero el soluto en un volumen menor,
por ejemplo 30 mL, y se traslada esa disolución a un matraz, para después rellenarlo
con más disolvente hasta los 100 mL.
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Es el método más común de expresar la concentración en química sobretodo cuando

se trabaja con reacciones químicas y relaciones estequiométricas. Sin embargo, tiene
el inconveniente de que el volumen cambia con la temperatura
 Normalidad (N)
La normalidad (N) es el número de equivalentes (n) de soluto (es la unidad de masa
que representa a la mínima unidad que puede reaccionar) contenidas en un litro de
solución (sc). 25
Diluciones
Tanto en un laboratorio clínico como en un stand de enfermería, como en cualquier

área de la salud se presentan diariamente situaciones en que se realizan diluciones de
diferentes solucione. Frente a esto se hace necesario entender que lo que se está
diluyendo son soluciones y que estas soluciones se expresan en términos de
concentración, es por esto que es importante en primera instancia, conocer y manejar
estos dos términos; y en segundo lugar conocer que al diluir se disminuye la
concentración de una solución determinada, es decir, diluir es agregar un solvente a
una solución y así obtener una concentración menor de sólido en la solución.
Una de las soluciones que se diluyen con más frecuencia en un laboratorio clínico es
el plasma o suero o líquidos biológicos en los cuales encontramos todos los analitos a
determinar cuantitativamente, actuando estos como solutos diluidos en el agua celular.
Otras soluciones a diluir son aquellos reactivos utilizados como preservativos de
algunas de estas muestras biológicas, tales como el ácido clorhídrico o nítrico entre
otros pues sus concentraciones elevadas no los hacen aptos para cumplir su función.
Por otra parte, un enfermero(a) cuando maneja sustancias cuyas cantidades
necesarias para ver un efecto son extremadamente pequeñas (por ejemplo un fármaco
para tratar una enfermedad, una hormona para estudiar su efecto en un animal de
experimentación, etc.) y difícilmente se pueden pesar o medir en esas proporciones
tan pequeñas, también tiene que diluir.
En esas situaciones es necesario recurrir a la preparación de una solución de alta
concentración (o solución de stock o solución madre) y hacer diluciones seriadas a
partir de ésta. A continuación, realizamos un esquema que muestra el proceso de
dilución:
Vs Vd = Vs+Vc( 1)
Vc
Vd
Cc Cd
Cc=Concentración de la solución concentrada
25
Disponible en Internet: http://es.wikipedia.org/wiki/Concentraci%C3%B3n
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Cd=Concentración de la solución diluída

Vd=Volumen de la solución diluída(1)
Vc= Volumen de la alícuota de solución concentrada, es decir el volumen que se
extrae de la solución concentrada para realizar la dilución.
Como mencionamos anteriormente, dilución es el proceso por el cual una solución
concentrada es convertida en una menos concentrada (diluida), por adición de una
solvente.
En una solución la cantidad de soluto que el volumen de solución diluida (Vd); pues el
solvente añadido (Vs) no contendrá soluto alguno. Entonces si la cantidad de soluto
por unidad de volumen se puede determinar por:
Cantidad de Soluto = Volumen de la Solución x Concentración Solución.
Para la solución concentrada tenemos:

Cantidad de soluto en Vc = Vc x Cc
Para la solución diluida será:

Cantidad de soluto en Vd = Vd x Cd
Si la cantidad de soluto es igual, entonces:
Cc x Vc = Cd x Vd..............(1)
La anterior ecuación es la base para todos los cálculos que se efectúan para las
diluciones.
La concentración de la solución diluida puede ser calculada a partir de la

concentración de la solución concentrada, teniendo en cuanta el factor de dilución (fd).
Esta es una expresión que resulta de manejar la ecuación (1):
Cd = fdCc................(2)
Así que fd = Cd
Cc
Y relacionando con (1)

fd = Vc ya que Vc = Cd
Vd Vd Cc
fd también es igual a Vc , ya que Vd es igual a Vs + Vc

Vs + Vc
El factor de dilución se expresa generalmente como una relación en función del

volumen final y así un factor de dilución (fd) 1/10 indica que una solución que tenia una
determinada concentración, se ha diluido diez veces y que la relación entra el (Vc) y
(Vd) es de 1:10. De aquí también se desprende que la relación entre el (Vc) y el (Vs)
es de 1:9.
Para preparar soluciones muy diluidas se recurre a las diluciones en serie; las cuales
se hacen sacando volúmenes o alícuotas de la solución anterior para preparar la
siguiente.
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Para obtener la concentración de una solución determinada, se puede aplicar la

ecuación:
Cn = fd1 x fd2 x fd3 x fd4 x.......x fdn x Cc.........(3)
Como se puede observar, un enfermero, bacteriólogo, o cualquier profesional de la

salud se puede enfrentar a diversas situaciones en la rutina diaria en las cuales tiene
que diluir. Principalmente se puede enumerar 3 situaciones básicas tales como:
1. Concentraciones elevadas de determinado analito en una muestra biológica.
2. Diluciones de reactivos químicos con concentraciones conocidas.
3. Preparación de patrones para elaboración de curvas de calibración.
A cada una de estas situaciones debemos enfrentarnos e identificar los pasos a
seguir para desempeñarnos de una manera ágil y hábil.
1. Concentraciones elevadas de determinado analito en una muestra biológica

Cuando el equipo no reporta ningún resultado esto es debido a las altas
concentraciones del analito (sustancia a analizar en la sangre del paciente: glucosa,
triglicéridos proteínas etc) que se está determinando en la muestra, o simplemente
disminuir la concentración de alguna solución:
a. Muestra con concentraciones elevadas de analitos:

Cc = Vd / Fd
Vc
Fd
Vd
Muestra de sangre o
medicamento a diluir
¿Se tiene el tubo de la muestra a analizar experimentalmente nos preguntamos cual

es la cantidad de muestra que debo tomar y cómo voy a realizar la dilución? Para esto
se necesitan de dos datos con los cuales se pueden realizar todas las diluciones
fácilmente, primero: conocer a que volumen final al cual voy a realizar la dilución, y
segundo determinar el factor de dilución a mi criterio. En este momento somos
autónomos de elegir tanto el volumen final como el factor dilución.
Ejemplo Nº 1
Podemos escoger un factor de dilución de ½ y un volumen final de 5 ml. Aplicamos la
fórmula que nos indica que volumen de la solución concentrada en este caso de la
muestra biológica vamos a medir.
Vc = Vd x fd
Vc= 5ml x ½
Vc= 2.5 ml del suero sanguíneo o medicamento a diluir
Es decir medimos 2.5 ml de suero lo agregamos a otro tubo y adicionamos el volumen

que hace falta para completar 5ml del volumen final de la solución; es decir 2.5ml de
agua destilada u otro disolvente.
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En este momento usted puede procesar su muestra y no olvidar que el resultado que
calcule con esta dilución no es el real, es necesario multiplicar por el factor de dilución
así: la muestra diluida arrojó una concentración de 200mg/dl la verdadera
concentración es: 400mg/dl ya que se multiplica por el denominador del factor de
dilución en este caso es 2.
Se pude presentar otra situación en la que aún la muestra sigue muy concentrada y es
necesario seguir realizando diluciones en este caso acudimos a realizar diluciones en
serie.
Diluciones en serie o seriadas

Vc Vc Vc Vc
fd fd fd fd
Vd1 Vd2 Vd3 Vd4
Se denominan en serie porque la dilución anterior ahora es la solución concentrada de

la siguiente y así sucesivamente como se muestra en el esquema. Para realizar
diluciones en serie al igual que para realizar cualquier dilución se necesita conocer el
factor de dilución y el volumen final (Vd), para así conocer el volumen que debemos
extraer de la muestra concentrada (Vc). Al realizar estas diluciones se pueden
presentar dos situaciones a saber:
A. EL factor de dilución utilizado en todas las diluciones es el mismo, por lo tanto
el volumen de la solución concentrada para extraer de cada tubo es el mismo y el del
solvente también lo es.
B. El factor de dilución varía de un tubo a otro y por lo tanto el volumen de la
solución concentrada es diferente y por lo tanto el volumen del solvente varía para
cada tubo.
En este ejemplo vamos a utilizar un ejemplo para la situación A:
La muestra del ejemplo Nº 1 que se diluyó debe diluirse más, si seguimos utilizando el
mismo factor de dilución ½ y utilizando un volumen final de 5ml, siempre debemos
medir del tubo anterior 2.5ml y en todos los tubos adicionar 2.5ml del solvente ver
esquema.
Si se requiere conocer las concentraciones de cada tubo se pueden presentar dos
situaciones:
a. Que se conozca la concentración de la solución stock.
b. Desconocer la contracción de la solución stock y sólo conocer la contracción de la
última solución.
Se desea conocer la concentración de las diluciones siguientes a la solución stock a la

cual se le conoce la concentración:
Para solucionar el primer caso recurrimos a la fórmula:
Cd= Cc x fd
Para el tubo Nº 1
Cd= *400mg/dl x ½ Cd= 200mg/dl
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Para el tubo Nº 2
Cd = 200mg/dl x ½ Cd= 100mg/dl
Para el tubo Nº 3
Cd = 100mg/dl x ½ Cd = 50mg/dl
Para el tubo Nº 4
Vd= 50mg/dl x ½ Vd = 25mg/dl
*Recuerde que esos datos provienen del ejemplo Nº 1
Si vamos a resolver la segunda situación en donde se desconoce la contracción de la

solución stock y sólo se conoce la contracción de la última solución. que en este caso
seria de 25mg/dl se procede así:
Cc = Cd
fd
Cc = 25
½
25 x *2 = 50 mg/dl
* En este caso recuerde que al dividir por un fraccionario se multiplica por su

denominador.
2. Diluciones de reactivos químicos con concentraciones conocidas.

En este caso partimos de reactivo de concentración conocida y se requiere preparar o
llegar a otra concentración.
Se desea preparar una solución de HCL 5% y se parte de una solución de 10%. Para
este caso es necesario conocer cual es el volumen que necesito medir de la solución
concentrada, debo definir los dos parámetros el factor de dilución y el volumen final, a
diferencia de los otros problemas en el caso experimental el factor de dilución no lo
defino yo, en este caso debe hallarse teniendo en cuanta las dos concentraciones así:
fd = Cd
Cc
fd= 5%
10%
fd=1/2
Teniendo el factor de dilución entonces podemos fijar un volumen final cualquiera por
ejemplo 2 ml, entonces hallamos el volumen de la solución concentrada así:
Vc = Vd x fd
Vc= 2ml x ½
Vc= 1 ml de la solución de HCl al 10%
Y adicionamos 1 ml de solvente para completar el volumen final
3. Preparación de patrones para elaboración de curvas de calibración

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El primer ejemplo que veremos es una proteína. La albúmina sérica bovina es la

proteína que más usualmente se emplea como patrón para calcular la cantidad de
proteínas totales en una muestra incógnita. Las unidades que habitualmente se usan
para la solución de stock son mg/ml, y en general una solución de 10 mg/ml puede
resultar adecuada para realizar diluciones seriadas y medir luego la concentración de
proteínas en una muestra. En este caso se pueden presentar dos situaciones:
a. Diluciones NO en serie o no seriadas a partir siempre de la solución stock
conociendo las concentraciones a las que queremos llegar
b. Diluciones en serie sin conocer las concentraciones a las que se desea llegar.
Diluciones no seriadas: es decir que el volumen inicial siempre se extrae de la

solución stock
Para el primer caso se procede así: Las diluciones se harán al medio en una serie de
tubos rotulados con las concentraciones 5 mg/ml; 2 mg/ml; 1 mg/ml; 0.5 mg/ml;
hallamos el factor de dilución con la fórmula del ejemplo Nº 3 para conocer el volumen
a tomar de la solución stock (Vc) en cada dilución y fijamos un volumen final de 1ml;
aplicamos la fórmula del ejemplo Nº1
Tubo Concentración ml de H2O ml solución x Dilución

1 5 mg/ml 0.5 ml 0.5ml solución stock 1/2
2 2mg/ml 0.8 ml 0.2 ml de la solución stock 1/5
Diluciones en serie: cuyo volumen inicial se extrae de la dilución anterior

Para el segundo caso se van a preparar 4 patrones y se van a realizar 4 diluciones en
serie a partir de la misma solución stock anterior de 10 mg/dl. En este caso yo decido
el factor de dilución y el volumen final de cada dilución. Para este caso determiné que
voy a diluir a ½ y el volumen final es de 2 ml aplico la fórmula del ejemplo Nº 1.
Vc = Vd x fd.
Vc= 2ml x ½.
Vc= 1 ml de la solución concentrada.
Como es el mismo factor de dilución para todos los tubos entonces voy a extraer del
tubo anterior a la siguiente dilución 1 ml. y adiciono 1ml del solvente.
Tubo Concentración ml de H2O ml de solución x Dilución

1 1ml 1ml 1/2
2 1ml 1ml 1/2
3 1ml 1ml 1/2
4 1ml 1ml 1/2
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Para determinar las concentraciones entonces aplico la fórmula Vd = CC x fd,

teniendo en cuenta que siempre la dilución anterior al ultimo tubo que le voy a hallar la
concentración es la solución concentrada respecto a esta. Así como se hizo en el
ejemplo Nº 2.
4.Materiales
1 Vaso de precipitado de 50 ml.
1 Balón aforado de 50ml.
1 Vidrio d reloj
1 Espátula.
1 Agitador.
1 Pipeta graduada 5 ml.
1 Pipeta graduada de 1 ml.
6 Tubos de ensayo.
1 Pera.
1 Churrusco.
1 Gradilla.
Equipos
Balanza analítica
5. Reactivos
Agua destilada.
NaOH.
KOH
NaCl.
Glucosa.
Sacarosa.
Azul de metileno.
Procedimiento
A. Preparación de soluciones.
1. Preparar 50ml de una solución de glucosa 0.1 M. Exprese la concentración en
%p/v.
2. Preparar 50ml de una solución de sacarosa 0.5 M. Exprese la concentración en
%p/v.
3. Preparar 50ml de una solución de NaOH 0.25 M. Exprese la concentración en
%p/v.
4. Preparar 50ml de una solución de NaCl 0.2 M. Exprese la concentración en %p/v.
5. Preparar 50ml de una solución de KOH 0.15 M. Exprese la concentración en %p/v.
6. Preparar 50ml de una solución de glucosa 0.5 M. Exprese la concentración en
%p/v.
7. Preparar 50ml de una solución de sacarosa 0.1 M. Exprese la concentración en
%p/v.
8. Preparar 50ml de una solución de NaOH 0.2 M. Exprese la concentración en %p/v.
9. Preparar 50ml de una solución de NaCl 0.15 M. Exprese la concentración en %p/v.
10. Preparar 50ml de una solución de KOH 0.25 M. Exprese la concentración en %p/v.
B. Diagrama de proceso de trabajo

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Una vez realizada la lectura del problema realice un esquema donde se observe paso
a paso la preparación de la solución y los cálculos correspondientes.
C. Reproducción experimental del problema propuesto

Por cada grupo de trabajo prepararán las soluciones de forma experimental.
Ejercicios de aplicación
Lea atentamente los siguientes ejercicios que se presentan a continuación:
1. Se necesita inyectarle al paciente un antibiótico que contiene 250.000 unidades

internacionales (U.I) Usted lo encuentra en su mesa. El médico ordena que se le debe
suministrar sólo una concentración de 250 U.I Realice la dilución adecuada esta
concentración teniendo en cuenta que se disuelve en agua esterilizada hasta 5 ml. Si
se mezclan 5 ml de la solución anterior con 5ml de agua (solución 2). ¿Cuál es la
concentración de esta ultima solución?
2. En un laboratorio clínico se necesita preparar un patrón de glucosa. Cuántos

gramos tiene que pasar para preparar 10 ml de una solución stock o patrón de glucosa
de 0.15M:
 Prepare la solución, calcule y redacte como la hace mediante un esquema
 Exprese la solución preparada en % (P/V)
 A partir de solución stock preparar cuatro diluciones en serie aplicando un factor de
dilución 1/2 y con un volumen final de 5 ml: Hacer los cálculos respectivos y hallar las
concentraciones de cada dilución
3. Realice una dilución 1/5, 1/8, 1/10 del antibiótico anterior halle las concentraciones
de cada una.
4. Usted encuentra una muestra de suero de un paciente que se observa lechosa y

muy viscosa debido a la alta cantidad de triglicéridos de la muestra, para el análisis es
necesario realizar 4 diluciones en serie aplicando un factor de dilución de 1/10 y con
un volumen final de 4.5 ml en cada una. ¿Cuántos ml tiene que sacar del suero para
poder obtener la primera dilución: es la misma cantidad para las demás diluciones?
Determine las concentraciones de cada dilución teniendo en cuenta que la primera
tiene una concentración de 500mg/dl
5. Se necesita conocer la concentración de proteínas en el suero de un paciente:

para esto diluya el suero 1/3 y este a su vez ½. Cómo realiza las diluciones. Si la
última dilución presenta una concentración de 8mg/dl de proteínas; ¿Cuál es la
concentración de proteínas en la segunda dilución y en la muestra original?
6. Se le entrega la muestra de orina de un paciente con elevada concentración de

nitrógeno ureico, el equipo no la puede procesar, debido a la alta concentración. Por lo
tanto, usted de diluir la muestra. Mezcle 5ml de orina con 15 ml de agua y 5 ml de
HNO3. ¿Qué dilución se realizó? A partir de esta dilución prepare dos diluciones en
serie 1:9 tenga en cuenta que la concentración de nitrógeno en la orina es de
200mg%. ¿Cuál será la concentración de la última dilución?
7. Preparar 100ml de una solución de NaOH 0.2 N.

a. A partir de la anterior solución preparar 50ml de otra solución con una concentración
de 0.3g/dl.
b. A partir de la anterior solución realizar 4 diluciones. Realice un esquema y los
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cálculos respectivos para cada dilución.

c. Determine las concentraciones de cada dilución.
8. Cuántos ml de Acido Clorhídrico concentrado de densidad 1,12 y concentración

36,5% (P/P) debe medir para preparar 50 ml una solución 0.3 N. Realice los cálculos
respectivos y explique mediante un esquema.
a. A partir de esta solución prepare 10ml de una solución de acido clorhídrico cuya
concentración sea de 0.75 g/dl.
b. A partir de la anterior solución realizar 4 diluciones. Realice un esquema y los
cálculos respectivos para cada dilución.
c. Determine las concentraciones en molaridad (M) de cada dilución.
7. Nivel de Riesgo:

Manejo de residuos:
 Línea 8
 Línea 4
8. Bibliografías
TORRENEGRA, Rubén. Introducción al Análisis Químico Moderno. Bogotá D.C.

Publicaciones Universidad Javeriana. Pontificia Universidad Javeriana.1990. P. 9-25.
Disponible en Internet: http://es.wikipedia.org/wiki/Concentraci%C3%B3n.
PRACTICA Nº 8
1. DILUCIONES EN SERIE O SERIADAS
2. Objetivos
 Aplicar unidades de concentración en la preparación de soluciones patrón.

 Preparar en forma correcta una solución patrón de concentración conocida.
de dilución.
mediante la preparación de soluciones utilizado diluciones en serie.
3. Marco Teórico
Preparación de patrones para elaboración de curvas de calibración

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A. Diluciones en serie sin conocer las concentraciones a las que se desea llegar.
B. Diluciones NO en serie o no seriadas a partir siempre de la solución stock
A. Diluciones en serie o seriadas

Vc Vc Vc Vc
fd fd fd fd
Vd1 Vd2 Vd3 Vd4
Se denominan en serie porque la dilución anterior ahora es la solución concentrada de

la siguiente y así sucesivamente como se muestra en el esquema. Para realizar
diluciones en serie al igual que para realizar cualquier dilución se necesita conocer el
factor de dilución y el volumen final (Vd), para así conocer el volumen que debemos
extraer de la muestra concentrada (Vc). Al realizar estas diluciones se pueden
presentar dos situaciones a saber:
C. EL factor de dilución utilizado en todas las diluciones es el mismo, por lo tanto
el volumen de la solución concentrada para extraer de cada tubo es el mismo y el del
solvente también lo es.
D. El factor de dilución varía de un tubo a otro y por lo tanto el volumen de la
solución concentrada es diferente y por lo tanto el volumen del solvente varía para
cada tubo.
En este ejemplo vamos a utilizar un ejemplo para la situación A:
La muestra del ejemplo Nº 1 que se diluyó debe diluirse más, si seguimos utilizando el
mismo factor de dilución ½ y utilizando un volumen final de 5ml, siempre debemos
medir del tubo anterior 2.5ml y en todos los tubos adicionar 2.5ml del solvente ver
esquema.
Si se requiere conocer las concentraciones de cada tubo se pueden presentar dos
situaciones:
c. Que se conozca la concentración de la solución stock.
d. Desconocer la contracción de la solución stock y sólo conocer la contracción de la
última solución.
Se desea conocer la concentración de las diluciones siguientes a la solución stock a la

cual se le conoce la concentración:
Para solucionar el primer caso recurrimos a la fórmula:
Cd= Cc x fd
Para el tubo Nº 1
Cd= *400mg/dl x ½ Cd= 200mg/dl
Para el tubo Nº 2
Cd = 200mg/dl x ½ Cd= 100mg/dl
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Para el tubo Nº 3
Cd = 100mg/dl x ½ Cd = 50mg/dl
Para el tubo Nº 4
Vd= 50mg/dl x ½ Vd = 25mg/dl
*Recuerde que esos datos provienen del ejemplo Nº 1 presentado en soluciones

y diluciones
Si vamos a resolver la segunda situación en donde se desconoce la contracción de la

solución stock y sólo se conoce la contracción de la última solución .que en este caso
seria de 25mg/dl se procede así:
Cc = Cd
fd
Cc = 25
½
25 x *2 = 50 mg/dl
* En este caso recuerde que al dividir por un fraccionario se multiplica por su

denominador.
Diluciones en serie: cuyo volumen inicial se extrae de la dilución anterior

Se van a preparar 4 patrones y se van a realizar 4 diluciones en serie a partir de la
misma solución stock anterior de 10 mg/dl. En este caso yo decido el factor de dilución
y el volumen final de cada dilución. Para este caso determiné que voy a diluir a ½ y el
volumen final es de 2 ml aplico la fórmula del ejemplo Nº 1.
Vc = Vd x fd.
Vc= 2ml x ½.
Vc= 1 ml de la solución concentrada.
Como es el mismo factor de dilución para todos los tubos entonces voy a extraer del
tubo anterior a la siguiente dilución 1 ml. y adiciono 1ml del solvente.
Tubo Concentración ml de H2O ml de solución x Dilución

1 1ml 1ml 1/2
2 1ml 1ml 1/2
3 1ml 1ml 1/2
4 1ml 1ml 1/2
Para determinar las concentraciones entonces aplico la fórmula Vd = CC x fd,

teniendo en cuenta que siempre la dilución anterior al ultimo tubo que le voy a hallar la
concentración es la solución concentrada respecto a esta. Así como se hizo en el
ejemplo Nº 2.
4.Materiales
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1 Vidrio d reloj
1 Espátula.
1 Agitador.
6 Tubos de ensayo.
1 Pera.
1 Churrusco.
1 Gradilla.
Equipos
Balanza analítica
5. Reactivos
Agua destilada.
NaOH.
NaCl.
HCl.
Glucosa.
Sacarosa.
Azul de metileno.
6. Procedimiento
1. Preparar 50ml de una solución de glucosa 0.1 M. A partir de la anterior solución
realizar 2 diluciones, factor de dilución (fd) de 1/2, volumen final de 5ml.
2. Preparar 50ml de una solución de sacarosa 0.5 M. A partir de la anterior solución
3. Preparar 50ml de una solución de NaOH 0.25 M. A partir de la anterior solución
4. Preparar 50ml de una solución de NaCl 0.2 M. A partir de la anterior solución
5. Preparar 50ml de una solución de KOH 0.15 M. A partir de la anterior solución
6. Preparar 50ml de una solución de glucosa 0.5 M. A partir de la anterior solución
7. Preparar 50ml de una solución de sacarosa 0.1 M. A partir de la anterior solución
8. Preparar 50ml de una solución de NaOH 0.2 M. A partir de la anterior solución
9. Preparar 50ml de una solución de NaCl 0.15 M. A partir de la anterior solución
10. Preparar 50ml de una solución de KOH 0.25 M. A partir de la anterior solución

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Por cada grupo de trabajo se prepararán las soluciones de forma experimental.
7. Nivel de Riesgo:

Manejo de residuos:
 Línea 8
 Línea 4
8. Bibliografías

PRACTICA Nº 9
1. DILUCIONES NO SERIADAS
2. Objetivos

de dilución.
mediante la preparación de soluciones utilizado diluciones no seriadas.
3. Marco Teórico
Preparación de patrones para elaboración de curvas de calibración

A. Diluciones en serie sin conocer las concentraciones a las que se desea llegar.
B. Diluciones NO en serie o no seriadas a partir siempre de la solución stock
Diluciones no seriadas: es decir que el volumen inicial siempre se extrae de la

solución stock
Para el primer caso se procede así: Las diluciones se harán al medio en una serie de
tubos rotulados con las concentraciones 5 mg/ml; 2 mg/ml; 1 mg/ml; 0.5 mg/ml;
hallamos el factor de dilución con la fórmula del ejemplo Nº 3 para conocer el volumen
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a tomar de la solución stock (Vc) en cada dilución y fijamos un volumen final de 1ml;
aplicamos la fórmula del ejemplo Nº1
Tubo Concentración ml de H2O ml solución x Dilución

1 5 mg/ml 0.5 ml 0.5ml solución stock 1/2
4.Materiales
1 Vidrio d reloj
1 Espátula.
1 Agitador.
6 Tubos de ensayo.
1 Pera.
1 Churrusco.
1 Gradilla.
Equipos
Balanza analítica
5. Reactivos
Agua destilada.
NaOH.
NaCl.
HCl.
Glucosa.
Sacarosa.
Azul de metileno.
6. Procedimiento
1. Preparar 50ml de una solución de glucosa a una concentración de 5 g/l. A partir de
la solución stok realizar 2 diluciones de 1g/l y de 2g/l, volumen final de 5ml.
2. Preparar 50ml de una solución de sacarosa a una concentración de 10 g/l. A partir
de la solución stok realizar 2 diluciones de 2g/l y de 3g/l, volumen final de 5ml.
3. Preparar 50ml de una solución de NaOH a una concentración de 15 g/l. A partir de
4. Preparar 50ml de una solución de NaCl a una concentración de 20 g/l. A partir de
5. Preparar 50ml de una solución de KOH a una concentración de 25 g/l. A partir de
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6. Preparar 50ml de una solución de glucosa a una concentración de 30 g/l. A partir
7. Preparar 50ml de una solución de sacarosa a una concentración de 35 g/l. A partir
8. Preparar 50ml de una solución de NaOH a una concentración de 10 g/l. A partir de
9. Preparar 50ml de una solución de NaCl a una concentración de 15 g/l. A partir de
10. Preparar 50ml de una solución de KOH a una concentración de 20 g/l. A partir de


Por cada grupo de trabajo se prepararán las soluciones de forma experimental.
7. Nivel de Riesgo:

Manejo de residuos:
 Línea 8
 Línea 4
8. Bibliografías

PRACTICA N 10
1. PREPARACION DE ESTANDARES DE TRABAJO (SOLUCIONES PATRON)
2. Objetivos

 Reconocer la importancia de las soluciones patrón en el trabajo de laboratorio para
determinar concentraciones desconocidas en el ámbito biológico.
3. Marco Teórico
Las soluciones estándar o patrones de calibración son mezclas de cantidades
conocidas de ciertos componentes usados para comparar con concentraciones
desconocidas en la muestra. Los patrones se utilizan principalmente para control y
aseguramiento de la calidad, para hacer medidas y balances, para el análisis
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cuantitativo de muestras, o para conocer la composición de las muestras. La

confiabilidad y la calidad de las sustancias estándar se aseguran mediante el
seguimiento de un protocolo estricto de calidad (QAP) durante su fabricación.
Una solución patrón es una de concentración perfectamente conocida. Hay que tener
mucho cuidado para establecer exactamente la concentración de la solución patrón
porque la exactitud del análisis volumétrico está directamente relacionada con la
calidad de dicho parámetro. La concentración de la solución patrón puede
establecerse de dos formas distintas: 1.Directamente: se disuelve una cantidad
exactamente pesada de un patrón primario, y se diluye hasta un volumen conocido.
2. Indirectamente: se valora la solución que contiene una cantidad pesada de
sustancia pura con una solución patrón. Este tipo de solución se denomina un patrón
secundario. 26
Cuando se requiere conocer la concentración de cualquier analito como glucosa,

proteínas, NaCl, etc; de una muestra X es necesario recurrir a un método
espectrofotométrico que determine la absorbancia de muestras de concentraciones ya
conocidas (soluciones patrón) , y así graficar las absorbancias y concentraciones de
estas soluciones patrón, obteniendo un gráfico denominado curva de calibración
mediante el cual, se puede determinar la concentración de la muestra desconocida
interpolando en la curva.
Para esto usted procede así:
1. Preparación de las soluciones patrón.

2. Lectura de la transmitancia o absorbancia de las soluciones patrón mediante un
método espectrofotométrico.
3. Elaboración de la curva espectral.
4. Elaboración de la curva de Ringbom.
5. Elaboración de la curva de calibración.
6. Lectura de la absorbancia de las muestras de concentración desconocida.
7. Determinación de la concentración de las muestras de concentración desconocida
utilizando la curva de calibración.
4. Materiales Equipos e Insumos
Materiales
6 Tubos de ensayo.
1 Pipeta graduada de 1ml.
1 Vidrio de reloj.
1 Espátula.
1 Agitador.
1 Gradilla.
1 Vaso de precipitado de 100ml.
1 Pipeteador o pera.
1 Churrusco.
Equipos
26
http://es.wikipedia.org/wiki/Soluci%C3%B3n_Est%C3%A1ndar
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Balanza analítica.
5. Reactivos
Agua destilada.
 Metil naranja
 Verde de malaquita.
 Rojo metilo.
 Cristal violeta.
 Eosina.
 Azul de bromofenol.
 Verde de metilo.
 Azul de tripan.
 Fucsina.
 Safranina.
6. Procedimiento
6.1 Preparación de estándares de trabajo o soluciones patrón:
1. Prepare una solución 50ml del colorante asignado a una concentración de 0.1%
P/V.
2. A partir de la solución Stock preparar 5 soluciones patrón de: 0.062 mg/ml, 0.125
mg/ml, 0.250 mg/m, 0.500 mg/ml, 1.0 mg/ml. Con un volumen final de 5 ml. Calcule el
volumen de la solución Stock que va a agregar a cada tubo.
Cuestionario
1. ¿Que se entiende por solución patrón?
2. ¿Porque es importante a nivel biológico realizar soluciones patrón?
3. Dar un ejemplo en cada caso.
7. Nivel de Riesgo:
 Nivel 2: Riesgo Medio (Bata de Laboratorio, Guantes, Cofia,z Tapabocas, Zapato

Manejo de residuos:
 Línea 1
8. Bibliografías
TORRENEGRA, Rubén. Introducción al Análisis Químico Moderno. Pontificia

Universidad Javeriana.1990.
http://es.wikipedia.org/wiki/Soluci%C3%B3n_Est%C3%A1ndar
PRACTICA Nº 11
1. ESPECTROSCOPIA Y ELABORACION DE UNA CURVA ESPECTRAL

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2. Objetivos
Comprender los conceptos básicos de espectroscopía.

Reconocer los componentes de un espectrofotómetro para su adecuado manejo.
Relacionar las funciones de los componentes con los conceptos básicos de
espectroscopía.
Comparar los diferentes rangos de longitud de onda de máxima absorción para
diferentes colorantes en el espectro visible.
3. Marco Teórico
Espectroscopía
La luz es de doble naturaleza, CORPUSCULAR Y ONDULATORIA, Con base en su

carácter ondulatorio la luz se comporta como una onda y cumple las leyes que rigen a
los movimientos ondulatorios. Es reflejada, difractada, transmitida etc. 27
Está formada por un componente eléctrico y otro magnético, es decir, es

electromagnético. Estos vectores son perpendiculares entre si.
Cualquier onda electromagnética (luz) se mueve en el vacío con una velocidad (Co) de
300.000.000 metros por segundo aproximadamente, esta depende del medio en que
se mueve la radiación. Cada radiación luminosa está caracterizada por una
frecuencia () que no depende del medio en el cual se transmite; y /o una longitud de
onda () que si depende de él. Estas dos variables están relacionadas por la
ecuación:
Frecuencia (v) = Velocidad de la luz en el medio

Longitud de onda en ese mismo medio
= c

La frecuencia se mide en 1/s = s -1 = Hertz = Hz
La frecuencia sólo depende de la fuente o foco productor de las radiaciones. La

velocidad de la luz en un determinado medio está relacionada con el índice de
refracción de ese medio (n)
ni = índice de refracción = Co
Ci
Donde i se refiere al medio y o al vacío
La longitud de onda () la distancia entre la cresta de una onda y la cresta de la

siguiente, va desde décimas de nanómetro (1 nm = 10-9 m) en los rayos gamma,
hasta kilómetros (1 Km = 103 m) en las ondas de radio baja frecuencia.28
Kilómetros (km).
27
Javeriana. Pontificia Universidad Javeriana.1990. Pág.: 24-64
28
Javeriana. Pontificia Universidad Javeriana.1990. Pág.: 24-64
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Metros (m).
Centímetros (cm).
Micras ( ). 1 = 0.0001 cm
Milimicras (m) = nanómetros (nm) 1 m = 0.001  = 10-9 m
Amstrongs (Å). 1 Å = 0.1 nm = 10-8 nm
Cuando la radiación electromagnética absorbe o emite energía, ocurre una

transferencia permanente de energía al medio absorbente o procedente del objeto
emisor, de aquí la importancia de tratar a la radiación electromagnética como un flujo
de partículas discretas denominadas FOTONES O CUANTOS DE ENERGÍA.
Los fotones, son corpúsculos o paquetes energéticos, indivisibles, unitarios y

característicos de cada frecuencia que se mueven en el espacio sobre las ondas.
Este se define como
E = (h * v)
Donde E = La energía asociada a la radiación de frecuencia

( ) (Un fotón o cuanto de energía)
V = La frecuencia se mide en 1/s ó Hertz (Hz), depende del foco o fuente
productora de la radiación y corresponde a la siguiente ecuación
v = Velocidad de la luz en el medio

Longitud de onda en ese mismo medio
h= La constante de Planck (6.62 x10-34 J.s)
La potencia de una radiación se define como el número de fotones que chocan por
unidad de área y por unidad de tiempo sobre un objeto o la materia en general.
Un rayo de luz puede estar formado por una sola longitud de onda o por un conjunto
de ellas. El primero se denomina monocromático y el segundo policromático.
Cuando un rayo de luz policromático incide sobre un elemento monocromador el rayo
se descompone en sus diferentes longitudes de onda.
La luz blanca está formada por un conjunto de radiaciones monocromáticas, como lo
ha podido observar usted cuando se forma el arco iris en el cielo.
En estos casos los colores que usted ve son la respuesta de su cerebro a los
diferentes rangos de longitudes de onda que forman la luz blanca.
En resumen, se puede decir que un rayo luminoso está descrito en función de la

longitud de onda, la frecuencia y la energía, es decir si un rayo con una longitud de
onda grande atravesará un punto un número de veces menor (menor frecuencia) con
respecto a una onda de longitud pequeña la cual atravesará el mismo punto mayor
número de veces es decir con mayor frecuencia. Por la tanto se puede decir que la
longitud de la onda es inversamente proporcional a la frecuencia y como esta está
directamente relacionada con la energía, entonces la energía es también inversamente
proporcional a la longitud de onda. Es decir, a menor energía mayor longitud de onda y
viceversa.
El Espectro Electromagnético
Se denomina espectro de un rayo luminoso al conjunto de radiaciones

monocromáticas que forman ese rayo, cuando ya hayan sido separadas. El espectro
electromagnético está constituido por todas las longitudes de onda descubiertas; y se
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ha dividido en varias regiones o rangos de longitudes de onda, como se muestra en la

figura 1.
En la Tabla No.1 se puede apreciar que la porción visible del espectro
electromagnético percibida por el ojo humano es muy pequeña si se compara con
otras regiones espectrales.
Figura Nº 1 Regiones del Espectro Electromagnético
Frecuencia (Haz) Radiación Longitud de onda

Mayor 1021 Rayos Cósmicos Menor 10-3 A
2 x 1018 Rayos Gamma 6.1 A
2 x 1016 Rayos X 50ª
2 x 1015 U.V lejano (vacío) 150nm
U.V cercano
8 x 1014 380nm- 700nm
4 x 1014 Visible
Infrarrojo Cercano 2.5 u
Infrarrojo Lejano 60u
Microondas 30cms
Ondas de radio 3 Km.
109
1015
Corriente Alterna
El espectro de un rayo luminoso puede obtenerse por medio de elementos ópticos

denominados monocromadores. Como monocromadores se usan rejillas y prismas de
difracción. Algunos instrumentos utilizan filtros. Los cuales solo transmiten un color y
de él una longitud de onda más interesante. Estos filtros separan rangos más o menos
amplios de longitudes de onda.
Como se puede observar en la figura de izquierda a derecha se observan las ondas
con longitudes de onda más pequeñas hasta las mas grandes por lo tanto las de
mayor a menor frecuencia y de la misma forma de las de mayor a menor energía. Es
decir, el rayo de luz correspondiente a los rayos gamma es el de mayor energía,
menor longitud de onda y mayor frecuencia y el rayo de luz correspondiente a las
ondas de radio es el de mayor longitud de onda menor energía y frecuencia.
Rango Visible
El rango de radiaciones con longitudes de onda entre 400 y 700 nm conforma el
denominado rango visible humano. Como se dijo anteriormente, el ojo humano detecta
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las radiaciones (longitudes de onda) y el cerebro las registra como colores. Estas
sensaciones de color son producidas por las regiones de longitudes de onda del rango
visible, como se indica en el cuadro siguiente:
Color de la Solución Longitud onda
Violeta 400-440
Azul 440-470nm
Verde
470-565nm
Amarillo 565-590nm
Naranja 590-615nm
Rojo 615-700nm
El color es una sensación, una respuesta del cerebro al estímulo eléctrico producido
por una radiación luminosa o un conjunto de ellas. El color es subjetivo, depende de la
persona, sólo se ven las radiaciones del rango visible que llega a nuestro ojo.
La luz blanca es una mezcla de las longitudes de onda indicada en el cuadro anterior.
Si un objeto se ilumina con luz blanca y lo observamos coloreado es porque parte de
los rangos que producen el color han sido absorbidos y se está transmitiendo o
reflejando el color que vemos.
Los objetos transparentes son aquellos que transmiten las radiaciones que inciden
sobre ellos, si algunas longitudes de onda se transmiten con mayor potencia el objeto
será transparente coloreado; por ejemplo, una solución de sangre.
Los objetos opacos son aquellos que se ven por la luz reflejada en ellos. Si se reflejan
todas las radiaciones de 400- 700 nm se verán blancos y si sólo se reflejan unas de
este rango, el objeto se verá coloreado.
Hay que considerar que se ha absorbido parcial o totalmente el otro u otros colores y
que el color que se ve es el que se transmite o refleja con mayor intensidad. De aquí
se deduce que para que un objeto sea coloreado, debe absorber parte de las
longitudes de onda del rango visible. Si la absorción del rango visible fuera total, el
objeto se vería oscuro (negro). Un objeto transparente es aquel que transmite la luz
blanca parcial (coloreado) o totalmente (incoloro) ejemplo sangre diluida y agua pura,
respectivamente.
Una solución de una sustancia presenta color porque al incidir sobre ella la luz blanca,
algunas longitudes de onda son absorbidas más intensamente que otras y las menos
absorbidas que se transmiten con más potencia producen la sensación de color al
incidir sobre el ojo del sujeto que las observa.
Las soluciones coloreadas absorben las radiaciones del color complementario al de
ellas; así, las soluciones que se ven rojas deben absorber radiaciones del rango verde:
El cuadro siguiente se da una lista de los colores de las soluciones y el de radiaciones
que se deben absorber
Color de la Solución Color Absorbido Longitud onda

Violeta Verde - Amarillo 570 - 580nm
Azul Amarillo - Naranja 570 - 600 nm
Verde Naranja - Rojo - 600 - 800nm
Violeta 380 - 450nm
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Amarillo Azul 450 - 470nm

Naranja Azul - Verdoso 460 - 480nm
Rojo Verde 490 - 590nm
Rango Ultravioleta (U.V)
Este rango del espectro electromagnético, está formado por todas las radiaciones
comprendidas entre las que tienen longitudes de onda desde 10nm hasta 400nm y se
divide en dos zonas, la del vacío (10nm -200nm) y la del cuarzo (100nm-400nm). El
rango U.V de vacío se denomina así, ya que los estudios con éstas radiaciones deben
hacerse en ausencia de aire, puesto que el oxígeno, dióxido de carbono y agua
absorben en esta región, en el análisis poco se usan estas radiaciones U.V de vacío.
El rango de 200-400 nm se denomina del cuarzo, puesto que este material no absorbe
éstas longitudes de onda. En la práctica es el rango que se usa para el análisis
químico ultravioleta, cuali o cuantitativo.
Las radiaciones ultravioletas tienen poder bacteriostático y bactericida, el primero para

radiaciones ultravioleta larga, es decir hasta 300nm y el segundo para radiaciones
ultravioleta cortas o sea menor de 300 nm.
Absorción de la radiación electromagnética U.V y visible
Al incidir una radiación electromagnética, sobre una sustancia, la energía asociada a

esta radiación puede ser absorbida por la sustancia, parcial o totalmente, siempre y
cuando esta energía sea igual a la necesitada por la sustancia para excitarse. Cuando
esto ocurre se dice que la radiación, la energía de ella, resuena con la sustancia.
La energía como lo vimos anteriormente asociada a una radiación monocromática se
determina por la ecuación:
E = (h * v)
Al incidir una radiación sobre una sustancia el fotón puede ser absorbido y producir
una excitación en la molécula.
Las excitaciones que puede sufrir una molécula de una sustancia, son tres tipos:
En el análisis clínico de rutina, los procesos de excitación que se tienen en cuenta son
del tipo electrónico, principalmente.
1. Electrónica: se refiere a la Energía de excitación una molécula donde intervienen
principalmente los electrones de enlace, que pasan los electrones de zonas
energéticas bajas a zonas energéticas mayores en la molécula. Las radiaciones que
producen estas excitaciones están comprendidas entre 150nm y 1500nm. La energía
requerida es de 80-800 k.j mol -1.
En partículas monoatómicas, se produce la absorción de unas pocas frecuencias bien
definidas debido al pequeño número de posibles estados energéticos de las partículas
absorbentes. La excitación solo puede producirse mediante este proceso en el que
uno o varios electrones del átomo se promocionan a un nivel de energía más alto.
2. Vibracional: se refiere a la energía de excitación que viene dada por las

interacciones atómicas donde intervienen electrones, átomos y grupos de átomos. Las
radiaciones que producen estos fenómenos están alrededor de los 5000nm. La
energía requerida es de 23 k.j mol – 1.
3. Rotacional: se refiere a la energía debida a los distintos movimientos rotacionales

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dentro de una molécula. Requieren de radiaciones del rango infrarrojo lejano y

microondas (0.03 a 0.3cm). La energía requerida es de 0.04-0.4 k.j mol-1.
Las excitaciones electrónicas ocurren al pasar electrones que ocupan orbítales Sigma
() o Pi () de una molécula a orbítales excitados ((*) (*)) de estos mismos tipos. El
paso de un electrón de un orbital a otro se denomina transición de energía y para que
exista una transición se necesita absorber una cantidad de energía igual a la diferencia
de energía entre los estados normales y excitados, por ejemplo, para que ocurra una
transición Sigma a Sigma activado se necesita absorber una energía igual a:
Energía de transición = E (sigma normal ()) - E (sigma excitado (*))
Si sobre la sustancia incide una radiación que lleve fotones con energía igual a la
energía de transición, entonces esa radiación (longitud de onda) es absorbida mas
intensamente o longitud de onda de máxima absorción.
Para muchas moléculas la diferencia o delta () de E no es la misma puesto que cada
molécula tiene diferente energía, algo mayor o algo menor que la E promedio, por esto
en la absorción de una solución de una sustancia, donde hay muchas moléculas.
En una molécula pueden ocurrir diferentes excitaciones, dependiendo de las
radiaciones que se absorban. La representación gráfica de las absorciones de una
sustancia a diferentes longitudes de onda se denomina espectro de absorción o
curva espectral.
Leyes que rigen la absorción de radiaciones electromagnéticas
La absorción de luz por una solución depende de la potencia de la radiación incidente

(Po). A mayor potencia incidente mayor será la potencia transmitida (Pt).
Pt Po
La relación entre la potencia transmitida y el incidente se denomina transmitancia
Es decir, si se tiene una solución por ejemplo una solución de sangre y se incide sobre
ella un rayo de luz la transmitancia es igual a la relación entre la potencia transmitida
y la incidente así:
Pt
T
Po
Pt
Ó si lo queremos expresar en %. %T  x100
Po
La transmitancia se expresa con relación a1 ó a 100. Se ha definido una variable de
mucha utilidad que se denomina absorbancia (A)
(A) Absorbancia: "Mide" la cantidad de luz absorbida por la solución absorbente.
También se le denomina densidad óptica (D) ó extinción (E). Es una variable y no
tiene unidades.
A  - Log T ó A = 2 - Log %T
También podemos relacionar la T y la absorbancia a través de la expresión:
T = 10 -A o %T = 100 x (10-A)
Así mismo, se tiene la relación de la absorbancia con las unidades de b y c según lo

siguiente:
A=abc
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(a) Absortividad: es una constante de proporcionalidad o coeficiente de extinción y

es característica para cada sustancia. Cambia con la longitud de onda. Se define
como:
A
a
bc
Las unidades de la absortividad dependerán de las unidades de b y c. Sus unidades
generalmente utilizadas para b son centímetros y para c son gramos por litros. Si b
tiene como unidad centímetros y c tiene como unidades moles por litro, entonces se
denomina absortividad molar o coeficiente de extinción molar.
Ley De Beer - Bouguer - Lambert (B.B.L)
Ley fundamental que rige las determinaciones fotométricas basadas en la potencia de

la energía del haz monocromado de radiación atenuado por la solución absorbente
que incidirá sobre el detector del instrumento. Se puede definir así:
"Al incidir un rayo de luz monocromática (de una sola longitud de onda) sobre un
medio absorbente de radiación (solución), la absorbancia por el medio será
directamente proporcional a la concentración de la sustancia responsable de la
absorción, al mantenerse constante la intensidad del rayo incidente (Po), la distancia
recorrida por el rayo (b) y la longitud de onda de esta".
A=abc
De esta ecuación se puede observar que la absorbancia de un medio homogéneo, a

una longitud de onda de máxima absorción constante, es proporcional al paso de la luz
a través del medio (b) y a la concentración de este(C).
La constante de extinción molar (a) es dependiente de la naturaleza de la sustancia y
cambia con la longitud de onda.
Si decimos que b es el trayecto atravesado por la luz en la solución podemos observar
que, si aumentamos b, mayor va a ser el número de centros absorbentes que
encuentra la luz en su paso por la solución y por lo tanto más va as er la luz absorbida.
Número de centros es directamente proporcional a B.
Número de centros es directamente proporcional a A.
Luego A es directamente proporcional a b.
Si se aumenta el número de centros aumentando la concentración, es decir el número
de centros por unidad de volumen. O sea que el número de centros absorbentes es
directamente proporcional a la concentración. Por lo anterior vemos que A es
directamente proporcional.
Finalmente Ab, A C luego A  b.c.
La ecuación A = a.b.c es la ley de Beer-Bouguer-Lambert. y es la base de todo análisis

fotométrico y espectrofotométrico.
Propiedades De La Ley B.B.L
1. La ley de B.B.L se aplica a las soluciones que contengan uno o mas clases de
especies absorbentes.
2. La ley de B.B.L solo describe bien el comportamiento de la absorción en
soluciones diluidas.
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3. A concentraciones diferentes de una sustancia absorbente, se puede observar que

la longitud de onda de máxima absorción y el punto de máxima absorbancia son los
mismos. Se guarda una paralelidad en sus curvas espectrales A vs. longitud de onda.
4. La absorción de luz por una solución depende de la potencia de la radiación
incidente Po. A mayor potencia incidente mayor será la potencia transmitida Pt.
Algunos tipos de instrumentos para la medición de la absorción de radiaciones

monocromáticas.
A. Fotómetros Ó Foto Colorímetros.
Están provistos de detectores eléctricos como foto celdas y filtros que seleccionan
haces de luz de un color determinado. La foto celdas generalmente producen
corrientes altas que mueven al registrador o sea al galvanómetro, directamente a
través de una resistencia. Pueden tener sistemas de detección y registro mas
complicados sobre todo los foto colorímetros modernos. Si para un método, la pureza
espectral no es importante, entonces los análisis cuantitativos se pueden realizar con
gran exactitud en este tipo de instrumento.
Comercialmente podemos encontrar fotómetros para el rango VIS, UV.
B. Espectrofotómetros
Hoy en día existen numerosos espectrofotómetros comerciales, algunos se han

diseñado solo para la región VIS; otros se aplican en las regiones UV y VIS. Unos
pocos pueden realizar medidas desde UV (185nm) hasta el infrarrojo cercano
(3000nm).
Tienen sistemas ópticos mas sofisticados y de mayor resolución que la de un filtro, sus
sistemas de detección y registro son más evolucionados y presentan mejor
sensibilidad. Se diferencian de los foto colorímetros en que el espectrofotómetro tiene
monocromador ya sea rejilla o prisma y el foto colorímetro tiene solo filtros.
Comercialmente los espectrofotómetros pueden ser:
a. De un solo haz para la región UV/VIS.
b. De doble haz.
c.
Los espectrofotómetros de doble haz, pueden ser estáticos o sea que no tienen
sistema automático para el cambio de longitud de onda ó dinámico que si lo tienen,
con estos últimos se obtienen los llamados espectros de absorción.
Funcionamiento
Al encender el instrumento, se prende la lámpara , la cual produce la luz, que es
enfocada por el lente, hacia el elemento monocromador, aquí la luz es descompuesta
en sus diferentes longitudes de onda; y de ellas solo una o un angosto rango de
longitudes de onda coincidirán con la rendija de selección de longitud de onda y de allí
esa longitud de onda seleccionada pasara por el compartimiento de la muestra antes
de llegar al detector, donde se desprenden electrones que generan una pequeña
corriente eléctrica es proporcional a la intensidad de la radiación y que llega al
registrador, y allí la corriente eléctrica, produce el desplazamiento de una aguja sobre
una escala graduada. Este desplazamiento producido es proporcional a la intensidad
de la corriente que llega.
Generalmente, la intensidad incidente de la radiación se lee primero para la celda y el

solvente y el valor obtenido se lleva a 100% por medio de un potenciómetro, así todas
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las otras lecturas estarán relacionadas a la inicial de 100%, o sea que la

Transmitancia se puede leer en %.
Los componentes espectroscópicos característicos incluyen cinco (5) componentes:
a. Una fuente estable de energía radiante.
b. Un recipiente transparente para contener la muestra.
c. Un dispositivo para realizar la medida que aísle una región restringida del espectro.
d. Un detector de radiación
e. Un sistema de tratamiento y lectura de la señal.
Componentes de los instrumentos
Fuentes de Radiación.
Su función es emitir el rayo de luz policromático que después de pasar por el

dispositivo separador de longitud de onda (monocromador) va a incidir sobre la
muestra.
Las lámparas que emiten rayos de longitudes de onda pueden ser de dos tipos
dependiendo de la naturaleza del filamento, las hay lámparas incandescentes y
lámparas de descarga. Así mismo dependiendo de la intensidad con que emitan los
rayos estas pueden ser:
• Continuas: es decir, emiten radiación cuya intensidad varía solo de forma gradual
en función de la longitud de onda.
• Discontinuas o fuentes de líneas: es decir, emiten un número limitado de bandas
de radiación, cada una de las cuales abarca un intervalo muy reducido de longitudes
de onda.
Las lámparas de tungsteno o wolframio proporcionan haces de luz potentes en el
rango visible y las radiaciones mas intensas están comprendidas entre 470 y 525 nm,
estas lámparas trabajan a potenciales de 6V y 12V de corriente continua.
Fuente Tipo Rango Espectro Intensidad

Argón D 100 - U.V vacío Continua
200nm
Hidrogeno D 150 - U.V Continua
390nm
Deuterio D 150 - U.V Continua
390nm
Xenón D 150 - U.V vacío- U.V -VIS Continua
800nm
Tungsteno I 325 - U.V - VIS - I.R cercano Continua
1500nm
Wolframio I 325 - U.V - VIS - I.R cercano Continua
1500nm
Tabla No.4. Algunos tipos de fuentes en los instrumentos espectroscópicos.
Selectores de longitud de onda.
Su función es permitir separar en rayos monocromáticos o en un grupo limitado de

longitudes de onda, el haz de luz policromático proveniente de las fuentes de radiación
o lámpara. El selector ideal seria aquel que separara una radiación única con una
única longitud de onda o frecuencia.
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Existen dos clases de selectores de longitud de onda, los monocromadores y los

filtros.
Los Monocromadores.
Además de separar las longitudes de ondas, permiten variar de forma continua y en un
amplio intervalo la longitud de onda de la radiación.
Los monocromadores están constituidos por rendijas, lentes, espejos, redes de

difracción o prismas de refracción, que garantizan la banda de longitud de onda
deseada. El poder de resolución de un monocromador, no solo esta determinado por
la dispersión del elemento monocromador, sino también por las características de los
materiales con que se construya y las rendijas principalmente las de salida.
Prismas de Refracción
Son poliedros, generalmente con dos caras triangulares y tres rectangulares. Estos
prismas separan las radiaciones, que forman un haz incidente en una de sus caras
rectangulares, basado en el cambio del índice de refracción para cada longitud de
onda. El material de que están construidos los prismas depende de la región del
espectro que se tenga que estudiar. Para la región del U.V vacío suele emplearse
prisma construidos con fluorita. Los prismas construidos cuarzo o sílice fundida suelen
emplearse para las zonas U.V - VIS - I.R cercano. En la región I.R donde el vidrio y el
cuarzo no son transparentes, se emplean prismas construidos de NaCl. Fli, CaF2 ó
KBr.
1 2 3 4 5 6
. de Prisma. de refracción .
Fig.2: Monocromador . . .
1. Rayo policromático. 2. Rendija de entrada. 3. Lente de colimación. 4. Prisma de
refracción. 5. Lente de enfoque. 6. Rendija de salida 7. Rayo monocromático
El ángulo de desviación de un rayo es función del índice de refracción del material del
que esta hecho el prisma. De acuerdo a lo anterior cada radiación con longitud de
onda diferente será desviada en un ángulo distinto, puesto que, a diferente longitud de
onda, diferente índice de refracción. Por lo tanto, un rayo policromático puede ser
separado por el prisma en un conjunto de rayos monocromáticos que luego pueden
ser seleccionados a través de una rendija.
Monocromadores de Red.
Rejillas de Reflexión.
Fig.3 Rejilla de reflexión.

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Son láminas de material óptico con un determinado número de rayas, separadas una
distancia (d). A mayor numero de rayas por mm, mayor separación de longitudes de
onda, ósea mayor resolución.
Rejillas de Difracción.
Rayo policromático Rayo monocromático
Fig. 4: Esquema rejilla de difracción tipo escalerilla
Son implementos ópticos a la que se le han hecho surcos o estrías de forma que tiene
caras bastantes anchas en la que se produce la reflexión y caras estrechas no
utilizadas. Esta geometría proporciona una difracción muy eficiente de la radiación.
Rendijas.
Las rendijas de un monocromador son unos bordes agudos que se forman mediante
un cuidadoso proceso mecánico a partir de dos piezas de metal. Sus bordes son
exactamente paralelos uno con respecto al otro y se encuentran en un mismo plano.
La rendija de entrada sirva como fuente de radiación; su imagen se enfoca, al final, en

el plano focal que contiene la rendija de salida
Filtros.
Algunos instrumentos utilizan filtros, los cuales solo transmiten un color, y de la una
longitud de onda más intensamente. Estos filtros separan rangos más o menos
amplios de longitudes de onda, pero no monocroman la radiación, los filtros son vidrios
o plásticos coloreados.
Dos tipos de filtros se emplean para la selección de la longitud de onda, los de
interferencia y los de absorción.
Filtros de Interferencia
Luz blanca
Banda estrecha e
radiación
Placa de
vidrioPelícula capa del
metálica dieléctrico
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Fig.5: Filtro de Interferencia.
Están constituidos por dos placas semitransparentes de metal, generalmente de plata,

que encierran una capa de un dieléctrico que puede ser CaF2 o MgF2 de espesor
determinado "T" y protegidos por láminas delgadas de vidrio duro. Estos filtros
producen un haz filtrado de un ancho de banda lo bastante angosto, más
monocromático que otros filtros.
Decir, para anchos de bandas estrechos, la fracción de la luz transmitida también es

menor.
Recipientes para la Muestra
1 2 3
. .
Tipos de celdas.
1. Rectangular 2. Cilíndrica 3. Celda de flujo continúo
Todos los estudios espectroscópicos, con excepción de la espectroscopia de emisión,

precisan de recipientes que contengan la muestra. Estas celdas o cubetas deben
fabricarse en un material que permita el paso de la radiación de la región espectral de
interés. Ver tabla No.6
Región Espectral Material celda

U.V Cuarzo, Sílice fundida. LiF
VIS Vidrio corex, Cuarzo, plástico, vidrio de silicato
Infrarrojo NaCl, KBr, TIBr, TII u otro haluro alcalino
Tabla No.5: Materiales para cubetas - celdas
La forma de las celdas es muy variada, pueden ser cilíndricas, hexagonales o

rectangulares. Las celdas deben estar construidas de tal manera que sus caras
opuestas sean perfectamente paralelas esto con el fin de que el haz de luz incida
perpendicularmente a la muestra y no pierda potencia radiante por reflexión.
Detectores de Radiación.
Detector o receptor es el dispositivo que recibe la radiación y produce una señal. Estos
dispositivos de detección se han sustituido en gran parte por transductores que
convierten la energía radiante en señal eléctrica.
Detectores de Fotones.
Celdas Fotovoltaicas
La celda fotovoltaica se usa principalmente para detectar y medir la radiación de la
región visible comprendida entre 350 y 750nm. Consiste en un electrodo plano de
cobre o hierro en el que se deposita una capa de material semiconductor como
selenio. La superficie externa del semiconductor se recubre con una fina película
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metálica transparente de oro o plata que sirve como electrodo colector. Todo el
conjunto se protege con una envoltura transparente.
Cuando a este semiconductor le llega una radiación de suficiente energía, se rompen
los enlaces covalentes y se forman electrones y agujeros conductores. Los electrones
migran hacia la película metálica y los agujeros hacia la base en la que se depositó el
semiconductor. Los electrones liberados migran libremente a través del circuito
externo para interaccionar con estos agujeros. El resultado es una corriente eléctrica
cuya magnitud es proporcional al número de fotones que inciden sobre la superficie
del semiconductor.
Tubos Fotomultiplicadores
Los tubos fotomultiplicadores son muy sensibles a las radiaciones U.V y VIS, además
tienen tiempos de respuestas extremadamente rápidos, se limitan a medir radiaciones
de baja potencia pues la luz intensa causa daños irreversibles a la superficie
fotoeléctrica. En estos tubos, la superficie catódica es de composición similar a la de
los fototubos descritos anteriormente. Además contiene unos electrodos adicionales
(nueve en total) llamados dinodos.
Procedimiento para la estandarización de un método espectrofotométrico
Para poder determinar si la solución cumple la ley de B.B.L, lo primero que se debe
hacer es:
1. Averiguar la LONGITUD DE ONDA DE MÁXIMA ABSORCIÓN - CURVA
ESPECTRAL. Es decir, la longitud de onda a la cual la solución presenta la
máxima absorbancia o la mínima transmitancia. Para determinar lo anterior se lee,
la transmitancia o absorbancia que presenta la solución coloreada y de
concentración constante a diferentes longitudes de onda.
Posteriormente se puede determinar por observación de los datos o realizando una
curva entre absorbancia ó porcentaje de transmitancia y longitud de onda, la cual
se denomina CURVA ESPECTRAL.
2. DETERMINACIÓN DE UN RANGO OPTIMO DE CONCENTRACIÓN - CURVA DE

RINGBOM
Un sistema cumple, la Ley de B.B.L. SOLO en un determinado rango de
concentraciones.
Este rango se puede determinar haciendo una curva de la A (absorvancia), o % T
(llamado también Porcentaje de Transmitancia) vs. LOGARITMO DE LA
CONCENTRACIÓN O Log C, y a esto se le denomina CURVA DE RINGBOM.
Esta Curva tiene una parte recta la cual esta delimitada por las Concentraciones
mínima y Concentración máxima del rango optimo.
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Para la determinación de la concentración de una sustancia por colorimetría, y

hablando concretamente de la espectrofotometría visible, se hace necesario que
esta sustancia sea coloreada, o pueda ser convertida en una nueva sustancia
coloreada, cuya concentración es proporcional a la de la sustancia incolora.
SISTEMA INCOLORO + REACTIVO ======= COMPUESTO COLOREADO
Este proceso se denomina revelado.

Para la determinación de la concentración de una sustancia desconocida se
utilizan dos métodos espectrofotometricos:
1. El método de la curva de calibración.
2. El método del patrón.
1. METODO DE LA CURVA DE CALIBRACIÓN

Habiendo conseguido esta longitud de onda de máxima absorción (CURVA
ESPECTRAL) y el rango de concentración donde se cumple la ley de BEER.
(CURVA DE RINGBOM).
Se determina la transmitancia o absorbancia que presentan las soluciones de
diferentes concentraciones a esta longitud de onda y se hace una gráfica de
ABSORBANCIA VS CONCENTRACIÓN.
Si la gráfica resulta una línea recta, se dice que el sistema o la solución coloreada,
cumple la ley de Beer- Bouguer-Lambert., en ese rango de concentraciones.
Teniendo esta curva, a cualquier solución de esta sustancia, se le puede
determinar su concentración por interpolación.
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2. EL MÉTODO DEL PATRÓN.29

Otro método usado para calcular la concentración de una muestra se basa en esta
relación lineal. Se utiliza una o dos soluciones patrón y se aplica la relación:
Cm =Cp/ Ap x Am
Donde:
Cm : Concentración de la muestra
Cp : Concentración del patrón
Am : Absorbancia de la muestra
Ap : Absorbancia del patrón
Materiales
6 Tubos de ensayo.
1 Vidrio de reloj.
1 Espátula.
1 Agitador.
1 Gradilla.
1 Churrusco.
Equipos
Balanza analítica.
Espectrofotómetro.
5. Reactivos
Agua destilada.
 Metil naranja
 Rojo metilo.
 Eosina.
 Azul de tripan.
 Fucsina.
 Safranina.
6. Procedimiento
29
Javeriana. Pontificia Universidad Javeriana.1990. Pág.: 24-64.
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ELABORACION DE UNA CURVA ESPECTRAL
P/V.
4. A partir de la solución Stock preparar 5 soluciones patrón de: 0.062 mg/ml, 0.125
mg/ml, 0.250 mg/m, 0.500 mg/ml, 1.0 mg/ml. Con un volumen final de10 ml. Calcule el
volumen de la solución Stock que va a agregar a cada tubo.
5. Con el tubo número 3 que contiene la solución de concentración 0.250 mg/ml
realice los siguientes pasos:
1. Encender el espectrofotómetro y dejar calentar por 15 minutos.
2. Ubique 400nm con el selector de la longitud de onda.
3. Utilizar como blanco 5 ml de agua destilada para llevar el equipo al 100%
de transmitancia.
4. Sacar el tubo del blanco, colocar en el compartimiento 5 ml de la solución
coloreada y leer en la escala como porcentaje de transmitancia.
5. Varíe la longitud de onda con intervalos de 20 en 20nm hasta 700nm.
6. Cada vez que varíe la longitud de onda se hace la misma operación de los
pasos 3, 4, 5.
7. Anotar en la tabla los valores de % de transmitancia y absorbancia dados
en escala.
Solución coloreada de:
LECTURA DE % T LECTURA (A) (A) TEORICA= 2-Log %t
8. Comparar los valores de la absorbancia obtenidos en la escala con los

valores obtenidos teóricamente (A= 2-log%T).
9. En un papel milimetrado graficar:
• Longitud de onda (eje de X) vs. %T (eje Y).
• Longitud de onda (eje de X) vs. A (eje de Y).
10. Determine la longitud de onda máxima absorción para el colorante
asignado y compárelo con el que se reporta en la bibliografía.
11. Una vez hechas las 2 gráficas haga una comparación de ellas y concluya.
7. Nivel de Riesgo:

Manejo de residuos:
 Línea 7
8. Bibliografía

Publicaciones Universidad Javeriana. Pontificia Universidad Javeriana.1990. P. 24-64
PRACTICA Nº 12
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1. ELABORACIÓN DE UNA CURVA DE CALIBRACIÓN
2. Objetivo
 Determinar las absorbancias de diferentes patrones de concentración conocida a
una longitud de onda determinada para la elaboración de una curva de calibración.
 Determinar la concentración de una muestra desconocida mediante la utilización
de una curva de calibración.
 Conocer la utilidad de la espectrofotometría como herramienta en el análisis
cuantitativo del laboratorio.
3. Marco Teórico
Curva de calibración
Una curva de calibración se trata de una curva de referencia construida con

cantidades conocidas de una sustancia, que se utiliza para determinar la cantidad de
esta sustancia (proteínas, carbohidratos (glucosa) etc) presente en una muestra
incógnita. En muchas determinaciones se cumple una relación proporcional entre la
magnitud o intensidad de color que da una reacción y la cantidad del reactivo que
la provoca; o la absorbancia de la radiación en relación a la concentración de la
muestra. Por ejemplo: si la presencia de 10 ug de proteínas en una solución genera la
aparición de un color azul pálido cuando es agregada a una mezcla reactiva, la
presencia de 20 ug de proteína dará lugar a que la solución se torne azul más oscuro y
así sucesivamente.30
Para realizar una curva de calibración es necesario llevar a cabo los siguientes pasos:
1. Preparación de las soluciones patrón.
2. En algunos casos es necesario agregar un reactivo que al reaccionar con la
muestra para dar un color.
3. Lectura de la transmitancia y absorbancia de las soluciones patrón mediante un
método espectrofotométrico.
4. Elaboración de la curva de calibración.
5. Lectura de la transmitancia y absorbancia de las muestras de concentración
desconocida.
6. Determinación de la concentración de las muestras utilizando la curva de
calibración.
Con un ejemplo trataremos de realizar una curva de calibración llevando a cabo los
pasos anteriores.
1. Preparación de las soluciones patrón:

En este caso vamos a utilizar un ejemplo en donde se desea conocer la concentración
de proteínas de una muestra desconocida, para esto es necesario preparar una
solución stock a partir de una muestra sólida o tener un stock líquido ya preparado a la
cual ya se le sabe la concentración, de igual modo se parte de una solución stock y se
realizan diluciones para preparar patrones de concentraciones conocida
aproximadamente 5 o 6 patrones.
30
http://www.quimicaviva.qb.fcen.uba.ar/contratapa/calibracion/calibracion.htm
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En este caso se prepararon 6 patrones diluyendo a partir de la solución stock con

concentraciones de 0.062 mg/ml, 0.125mg/ml,0.25mg/ml,0.50mg/ml y 1.0mg/ml como
se observa en la figura anterior.
2. Adición de un reactivo que al reaccionar con la muestra para dar un color
En este caso como estamos determinando proteínas, se utiliza un reactivo que puede
reaccionar con las proteínas en este caso puede ser Biuret, el cual al reaccionar con
las proteínas da un color violeta a mayor concentración de proteínas mayor el color
visualizado. (Como se observa en la figura anterior). Se puede buscar cualquier
reactivo depende del analito o sustancia a analizar.
En conclusión simplemente se adiciona un reactivo que reaccione con el analito a
determinar y que pueda dar color.
3. Lectura de la absorbancia de las soluciones patrón mediante un método

espectrofotométrico
Para este paso se toman los tubos que ya tienen el reactivo y en un espectrofotómetro
o colorímetro utilizando un blanco de reactivo, se procede a leer las transmitancias y
absorbancias de cada tubo, es de esperarse la relación directamente proporcional
entre o intensidad de color que da una reacción y la cantidad del reactivo que la
provoca; o la absorbancia de la radiación en relación a la concentración de la
muestra como lo muestra al tabla siguiente: 31
Absorbancia (A) Concentración

0.04 0.062 mg/ml
0.09 0.125mg/ml
0.18 0.25mg/ml
0.31 0.50mg/ml
0.58 1.0mg/ml
Es recomendable leer las transmitancias y convertirlas a absorbancias mediante la

fórmula A= 2-log %T
4. Elaboración de la curva de calibración
La relación entre intensidad de color y concentración de la sustancia (una medida de la

cantidad de esa sustancia) es proporcional y así, si se grafica el valor de intensidad de
color medido con un aparato adecuado (espectrofotómetro o colorímetro) es
proporcional a la absorbancia en función de las concentraciones crecientes de la
sustancia se obtiene una recta. (Figura abajo) Es decir, a mayor cantidad de proteína,
mayor cantidad de producto de reacción y por lo tanto, mayor intensidad de color.
31
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Hay que advertir que una respuesta lineal no se obtiene en todo el rango de
concentraciones posibles sino dentro de un conjunto de valores que dependen de
numerosos factores dependientes del método de medición. Por otra parte, este tipo de
curvas no se limita solamente a la determinación de un elemento o compuesto químico
sino que tiene múltiples aplicaciones.
5. Lectura de la transmitancia y absorbancia de las muestras de concentración

desconocida
Para determinar la transmitancia y absorbancia de la muestra desconocida, esta se

trata como una solución normal a la que se le adiciona la misma cantidad de reactivo y
se lee al igual que cualquier patrón.
6. Determinación de la concentración de las muestras utilizando la curva de

calibración
Cada vez que se necesite conocer la cantidad de de una sustancia presente en una
muestra desconocida, una vez que se realiza la reacción y se lee la absorbancia, se
procede a ubicar la absorbancia arrojada por la muestra desconocida en el eje Y trazar
una línea desde el valor del eje Y hasta intersectar la curva y luego desde el punto de
intersección se baja una recta hasta X , como en este eje se conocen las
concentraciones expresadas en mg podremos conocer cuánto proteína había en
nuestra muestra. En la figura abajo. Se presenta un ejemplo hipotético en el que la
lectura de la absorbancia corresponde a un valor de 0.23, la línea de intersección con
el eje X nos dice que la muestra tiene una cantidad de cobre equivalente a 0.36 mg/dl
ya que el punto cae equidistante entre los valores correspondientes a los tubos 4 y 5
conteniendo 0.25 y 0.50 mg/dl de proteínas respectivamente. 32
32
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0.25
0.36mg/dl
Ajuste de curvas de calibración
Los datos de absorbancia que se obtienen de los patrones que se preparan para una
curva de calibración, llevan asociados errores del analista los cuales hacen que éstos
datos no produzcan una línea recta, con el fin de ajustar estos datos a una línea recta
se ha ideado el siguiente procedimiento:33
Los datos de absorbancia obtenidos para los respectivos patrones se multiplican por la
concentración de estos (AxC), la concentración de cada patrón se eleva al cuadrado
(C2), se obtienen las sumatorias y se dividen  A.C por  C2 para obtener un factor de
corrección (W) el cual se multiplica por cada concentración para obtener la
absorbancia corregida. (A)*, Así:
C A AC C2 A *= W.C
C1 A1 A1 C1 C12 A1*
C2 A2 A2 C2 C2 2 A2*
2
C3 A3 A3 C3 C3 A3*
. . .
. . .
. . .
Cn An An Cn C2n An*
 A.C  C2
 A.C
W=
 C2
Se deben tener en cuanta los valores límites del rango óptimo, para eliminar datos
muy dispersos.
Este factor W se usa para calcular la concentración de una muestra a partir de su
absorbancia. (2).
Cx = 1 x Ax
w
ó Cx = f. Ax
Donde f = 1
w
33
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Con este factor se pueden elaborar tablas de absorbancia, concentración, que facilitan
la determinación de la concentración de una muestra, por localización de la
absorbancia de la muestra en la tabla y la lectura de la concentración.
Materiales
6 Tubos de ensayo.
1 Vidrio de reloj.
1 Espátula.
1 Agitador.
1 Gradilla.
1 Churrusco.
Equipos
Balanza analítica.
Espectrofotómetro.
5. Reactivos
Agua destilada.
 Metil naranja
 Rojo metilo.
 Eosina.
 Azul de tripan.
 Fucsina.
 Safranina.
6. Procedimiento
ELABORACION DE UNA CURVA DE CALIBRACION

P/V.
6. Realice 5 diluciones no seriadas con concentraciones de: 0.062 mg/ml, 0.125
mg/ml, 0.250 mg/m, 0.500 mg/ml, 1.0 mg/ml. Con un volumen final de 5 ml. Calcule los
volúmenes para cada tubo.
7. Con cada uno de los 5 tubos que contienen la solución del colorante asignado
realice los siguientes pasos:
1. Encender el espectrofotómetro y dejar calentar por 15 minutos.
2. Ubique con el selector de la longitud de onda de máxima absorción
determinado en la clase anterior para el colorante en la curva espectral o en su
defecto la longitud de onda reportado en la bibliografía.
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3. Utilizar como blanco un tubo con 5 ml de agua destilada para llevar el equipo
al 100% de transmitancia.
4. Sacar el tubo del blanco, colocar en el compartimiento un tubo con 5 ml de la
solución coloreada de más baja concentración y leer en la escala como
porcentaje de transmitancia y la absorbancia.
5. Luego continuar colocando los tubos con la solución coloreada el ultimo será
el de mayor concentración y después de cada lectura se hace la misma
operación de los pasos 3 y 4.
6. Anotar en la tabla valores obtenidos:

Longitud Concentración %T (A) (A) TEORICA= 2-Log %t A.C C2 A *= W.C
de onda DILUCIONES
 A.C  C2
7. Utilizar como blanco un tubo con 5 ml de agua destilada para llevar el equipo
al 100% de transmitancia.
8. Colocar en un tubo 5 ml de la solución coloreada de concentración
desconocida en la celda (suministrada por el docente) y leer % de transmitancia
y la absorbancia.
9. Anotar en la tabla valores obtenidos.

Concentración LECTURA DE % T LECTURA (A) (A) TEORICA= 2-Log %t
DESCONOCIDA
obtenida por
interpolación en
la grafica.
10. Comparar los valores de la absorbancia obtenidos en la escala con los

valores obtenidos teóricamente (A= 2-log%T).
11. En un papel milimetrado graficar:
• Absorbancia corregida A* (eje y) vs. Concentración (eje x).
• Determine gráficamente la concentración interpolando la A teórica de la
solución de concentración desconocida sobre la recta y luego al eje x de la
concentración. El punto de corte será igual a la concentración de la solución
desconocida.
12. Determine también la concentración de la solución desconocida por el
Método del Factor de Corrección (W)
W =  A.C
 C2
Concentración desconocida Cx = 1 x Ax
w
ó Cx = f. Ax
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Donde f = 1
w
13. Compare las dos concentraciones, la obtenida con la grafica y con el factor
de corrección W.
14. Concluya.
7. Nivel de Riesgo:
Manejo de residuos:
 Línea 7
8. Bibliografía

PRACTICA Nº 12
1. UROANALISIS
2.Objetivos
 Reconocer la importancia del examen de la orina como herramienta diagnostica.
 Estudiar las características, físicas, químicas y microscópicas de la orina.
 Correlacionar los resultados con las diferentes patologías.
3. Marco Teórico
El examen general de orina es una de las pruebas más solicitadas dentro del
laboratorio de análisis clínicos e incluye el análisis físico, químico y análisis
microscópico. En este último, se analiza el sedimento urinario en búsqueda de
distintos elementos formes (leucocitos, cilindros, etc.) con diferente utilidad
diagnostica. El análisis de sedimento urinario se puede valorar mediante métodos
manuales y automatizados.
Nos da idea también de procesos bacterianos, gracias al urocultivo; y, también, a
través de su sedimento podemos distinguir células, cristales, y ver si existen procesos
inflamatorios.
El empleo rutinario del análisis de orina sirve para detectar determinados componentes
no presentes en individuos sanos.
Podemos obtener una información valiosa para la detección, diagnóstico y valoración
de enfermedades nefrourológicas, incluso pudiendo revelar enfermedades
asintomáticas o silenciosas.
La recolección de la muestra es muy importante, determina la fidelidad de los
resultados y su correcta interpretación. Se debe realizar en un recipiente limpio (de
vidrio o plástico), que no contenga restos de detergentes, grasas o agua oxigenada.
No es necesario que sea estéril. Es recomendable una exhaustiva higiene y enjuague
de las manos y genitales. Se debe desechar los primeros mililitros de orina y recoger
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el chorro medio de la micción. Habitualmente, el análisis de orina completo se efectúa

sobre la primera orina de la mañana (de 3 hs. de retención mínima). Algunos análisis
específicos requieren la recolección durante 24 hs (orina de 24 hs.). En este caso es
importante recomendar que una vez obtenida la muestra se la debe conservar en lugar
fresco. Si se debe realizar un cultivo bacteriano de esa muestra (urocultivo), el frasco
debe estar estéril.
El examen de rutina incluye 3 partes

1. examen físico
2. examen químico
3. examen microscópico
1) EL EXAMEN FISICO: comprende la descripción del color, aspecto y olor, así como
la determinación de volumen, densidad y pH.
• Aspecto, color y olor: se realiza por observación directa de la orina en un tubo limpio
de vidrio transparente. Normalmente, la orina posee:
Aspecto: límpido
Color: amarillo ámbar
Olor: sui generis
Espuma: blanca, no persistente
Pueden presentarse anomalías:
Aspecto turbio: debido a proteinuria, bacteriuria, precipitación de sales (fosfatos
Amónicos en orinas alcalinas o uratos en orinas ácidas.
Color:
- Rojizo: por hematuria, hemoglobinuria, mioglobinuria, ingesta de remolacha.
presencia de cristales de uratos amorfos (no patológico)
- Amarillo intenso, verde oscuro hasta amarronado: bilirrubina
- Caoba: pigmentos biliares o porfirias
- Pardo oscuro, negruzco: alcaptonuria
- Anaranjado: estado febril, tratamiento con rifampicina
- Aspecto opalescente y color blanco amarillento: pus, infección urinaria
Olor: dulce, a frutas o cetónico: cuerpos cetónicos, glucosuria
Espuma persistente: proteinuria, resto de detergente en el frasco de muestra o el
tubo.
• Volumen: se determina midiéndolo en una probeta graduada, e indicando el período

de tiempo en que se recolectó la muestra. La diuresis normal es de 1500 ml/24 h.
Debido a que la cantidad de líquido que maneja el riñón es normalmente muy variable,
dicha cifra puede variar en más o en menos.
• Densidad: en condiciones normales, la densidad urinaria tiene un valor entre 1015 y

1025 g/l. Este parámetro hoy en día forma parte de las determinaciones realizadas
utilizando las tirillas reactivas (ver más abajo).
La densidad urinaria aporta información sobre la función renal de concentración
dilución de la orina. Como resultado se pueden obtener orinas de tonicidad
(concentración de solutos) variada, con el objetivo de conservar el equilibrio del agua
corporal.
Orinas muy concentradas (hipertónicas con respecto al plasma) aparecen cuando el
riñón tiende a conservar agua por disminución del aporte hídrico, estados febriles,
pérdidas gastrointestinales, diabetes sacarina.
El uso de diuréticos, disminución, ausencia o falta de acción de la hormona
antidiurética, mala nutrición proteica y diabetes insípida son factores que resultan en la
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formación de orinas diluidas (hipotónicas con respecto al plasma).
• pH: el riñón es uno de los órganos que junto con el pulmón interviene en la
regulación de la concentración de H+ en el líquido extracelular y lo hace
fundamentalmente regulando la concentración de HCO3 plasmático. Esta función se
ejerce a través de la recuperación de bicarbonato filtrado, producción de nuevo
bicarbonato, excreción de NH4+, H2PO4.
2) EL EXAMEN QUÍMICO: rutinariamente se analiza la presencia de proteínas,

hemoglobina, glucosa, cuerpos cetónicos, sales biliares y bilirrubina. Todas estas
pruebas están incluidas en las tirillas reactivas y normalmente la reacción debe ser
negativa. En caso de observarse reacción positiva, se informa con una a cuatro cruces
(+ a ++++), según la intensidad del color desarrollado. Cabe destacar que esta técnica
aporta resultados semicuantitativos, debiéndose procesar la muestra por métodos de
tipo cuantitativo si se desea establecer la concentración exacta de tales sustancias.
Tirillas reactivas en el laboratorio de análisis clínicos es corriente su uso para
investigar la presencia de varios elementos químicos en la orina.
Las tiras reactivas de orina consisten en unas pequeñas cintas de plástico rígido a las
que van pegados unos cuadraditos impregnados de reactivos, que son diferentes
dependiendo de lo que se quiera analizar. Si el compuesto que se quiere analizar se
encuentra en la muestra, se pone en contacto con los reactivos presentes en el
cuadradito, produciendo una reacción de color fácilmente observable. Además de ser
positivo (cambio de color) o negativo (sin cambio), las diferentes intensidades de color
darán idea de la cantidad de compuesto analizado presente en la muestra, permitiendo
una semicuantificación de dicho compuesto. La semicuantificación se logra por
comparación del color desarrollado por la muestra con una curva de calibración que
provee el fabricante como 5-6 recuadros con tonalidades relacionadas con la
concentración correspondiente a cada metabolito que se quiere analizar. Si el análisis
de un metabolito da positivo con las tirillas reactivas, su cuantificación exacta deberá
realizarse con otro método químico, más específico y sensible.
De esta manera se puede determinar: densidad, pH, leucocitos, nitritos, proteínas,
glucosa, cuerpos cetónicos, urobilinógenos, bilirrubina, hemoglobina y sangre.
La ventaja de este método es que es muy rápido y muy específico ya que cada tira
tiene diversos segmentos en los cuáles está el reactivo apropiado para cada
determinación.
Descripción de las determinaciones incluidas en las tirillas reactivas
− pH: la tirilla contiene una mezcla de indicadores de pH que en contacto con la orina
dan una nítida graduación de colores, desde el naranja (pH 5) al azul (pH 9).
Resultado normal: 5-6 en orina fresca.
− Leucocitos: los granulocitos (un tipo de leucocitos) poseen la enzima esterasa, que
reacciona con los reactivos de la tirilla dando un producto de color violeta.
Resultado normal: negativo (no existe límite definido entre la excreción fisiológica y
patológicamente elevada de leucocitos. Mayormente se indica 10 a 20 leucocitos/ul
como síntoma sospechoso y más de 20 como hallazgo patológico).
− Nitritos: se utiliza una amina que en medio ácido reacciona con dando una sal de
diazonio, que reacciona con un cromógeno para formar color rosado.
Resultado normal: negativo.
− Proteínas: la tirilla contiene un indicador que en presencia de proteínas vira del
amarillo al verde.
Resultado normal: negativo (hasta 30 mg% en orina matinal, la tirilla no detecta esta
cantidad).
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La excreción de proteínas por orina debe ser menor a 150 mg/día. Este valor da una
reacción negativa con los métodos usuales de determinación cualitativa. Si la reacción
da positiva, se debe determinar la concentración en una muestra de orina de 24 hs con
un método químico.
La proteinuria suele deberse a las siguientes causas:
- Aumento de proteínas plasmáticas normales y anormales.
- Aumento de permeabilidad glomerular
- Disminución de la reabsorción de polipéptidos y proteínas de bajo PM que
normalmente filtran por el glomérulo.
- Alteraciones hemodinámicas, entre las que cabe destacar el ejercicio, cambios de
posición de decúbito a erecta, fiebre, etc.
La proteinuria no siempre se acompaña de lesiones en el parénquima renal. Sin
embargo, la proteinuria persistente que supera los 750 mg/24 hs es un indicador de
lesión en el parénquima renal.
− Glucosa: La glucosa, por la glucosa oxidasa presente en la tira, se oxida a

gluconolactona y peróxido de hidrógeno. El agua oxigenada, en presencia de la
peroxidasa también presente en la tirilla, oxida a su vez un indicador. La cantidad de
producto formado da una gama de color entre amarillo al verde.
Resultado normal: negativo (glucosuria fisiológica hasta 15 mg% en orina matinal, la
tirilla no la detecta).
La glucosa filtrada en el glomérulo se reabsorbe casi completamente en el túbulo
contorneado proximal. Este proceso es realizado por un transportador de membrana
que se satura con concentraciones de glucosa superiores a 180 mg%; en estas
circunstancias la glucosa no reabsorbida permanece en líquido luminal y se excreta
por orina. La causa más común de glucosuria es la diabetes mellitus no controlada.
Dado que la glucemia normal está comprendida entre 70 y 110 mg%, la presencia de
glucosuria es indicativa de hiperglucemia en caso de indemnidad tubular. Existen un
número de entidades caracterizadas por anomalías a nivel tubular que presentan
intensa glucosuria sin la coexistencia de hiperglucemia.
− Cuerpos cetónicos: sólo el acetoacetato y la acetona reaccionan con nitroprusiato

de sodio y glicina en medio alcalino dando un complejo de color violeta. El β-
hidroxibutirato no reacciona.
Resultado normal: negativo (hasta 5 mg% en orina matinal, la tirilla no los detecta)
Los cuerpos cetónicos se forman cuando el aporte de ácidos grasos al hígado supera
su capacidad de utilización del Acetil-CoA. Se vierten entonces a sangre desde donde
son captados por órganos aeróbicos para su oxidación y obtención de energía. La
acetona se elimina por el aliento, mientras que el acetoacetato y el β-hidroxibutirato lo
hacen por orina. Su eliminación sólo ocurre en cantidades apreciables cuando su
síntesis es desmedida, como ocurre en la diabetes mellitus descompensada, en el
ayuno prolongado y procesos febriles. En estos casos se detecta cetonemia
(presencia en sangre en cantidades elevadas) y cetonuria (presencia en orina).
− Urobilinógeno: el urobilinógeno reacciona en medio ácido con una sal de diazonio,

dando un compuesto rojo.
Resultado normal: hasta 1 mg%.
Urobilina y urobilinógeno aumentan por hemólisis y trastornos hepáticos.
− Bilirrubina: la bilirrubina reacciona con una sal de diazonio en medio ácido, dando
un compuesto rosa violáceo.
Resultado normal: negativo.
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La bilirrubina presente en orina es de tipo conjugada, forma hidrosoluble que se filtra

en el glomérulo renal, al que llega luego de pasar por la circulación enterohepática.
La bilirrubina está ausente en la orina en casos de ictericia hemolítica y aumentada en
casos de hepatitis, ictericia obstructiva o neoplasias de cabeza de páncreas.
− Sangre: la hemoglobina tiene actividad seudo-peroxidásica, por eso es capaz de

liberar O2 a partir del H2O2. En las tirillas reactivas se acopla esta producción de
oxígeno a la oxidación del indicador bencidina (forma oxidada azul verdoso). Si la
muestra contiene eritrocitos intactos (hematuria), se ven como puntos verdes aislados
o en grupos sobre el fondo amarillo. Si hay hemoglobinuria (hemoglobina libre en
orina) el color verde es homogéneo. Estos resultados se deben corroborar con la
observación del sedimento urinario.
Resultado normal: negativo (hasta 5 eritrocitos/ul).
En situaciones específicas y obedeciendo a patologías diagnosticadas o presuntivas
puede determinarse la concentración de ciertos componentes urinarios, como o
Electrolitos (Ionograma urinario): Na+ o No electrolitos: urea, creatinina, ácido úrico,
hormonas y sus metabolitos, enzimas, fármacos y sus metabolitos, tóxicos y sus
metabolitos, etc.
• Urea: es la principal forma de excreción del grupo amino de los aminoácidos. La

misma se filtra libremente por el glomérulo y es parcialmente secretada y reabsorbida
a nivel de los túbulos. Su excreción urinaria depende de las proteínas de la dieta, por
tal motivo el aclaramiento renal de la misma no es una expresión fidedigna del
funcionamiento renal. Por ello, el clearance de urea no se usa para evaluar el
funcionamiento renal. Cabe acotar que la concentración plasmática de urea se elevará
recién cuando el deterioro renal afecte a más del 50% del parénquima.
La excreción de urea se incrementa fisiológicamente por ejercicio y dietas ricas en
proteínas y patológicamente en estados febriles y catabólicos.
Durante el crecimiento, embarazo y bajo consumo de proteínas en la dieta disminuye
la concentración de urea urinaria. Estados patológicos hepáticos y renales tienen la
misma consecuencia.
• Creatinina: resultado de la transformación espontánea de la fosfocreatina muscular.

Este compuesto filtra libremente en glomérulo y prácticamente no es secretada o
reabsorbida a nivel de los túbulos. A diferencia de la urea, la excreción de creatinina
no depende de la proteína dietaría, encontrándose sujeta únicamente a la masa
muscular.
Estas circunstancias hacen que el aclaramiento renal de creatinina (clearance) sea un
recurso clínico para el diagnóstico y control evolutivo de la insuficiencia renal. Sumado
a esta característica se asocia la buena relación entre la disminución del clearance de
creatinina y la elevación de su concentración en plasma.
Pacientes obesos, asténicos, hipertiroideos, insuficientes renales o con distrofias
musculares tienen una baja excreción urinaria de creatinina. Por el contrario, este
parámetro aumenta en el hipotiroidismo, diabetes y en individuos musculosos.
• Ácido úrico: producto final del catabolismo de las bases púricas, excretado por
orina.
Debido a que el pKa del N9 es 5.5 y el del N1 es 10.3, a pH plasmático fisiológico se
encuentra en forma de urato monosódico. En orina, el estado iónico dependerá del pH:
si el pH urinario es menor que 5.75, se encontrará predominantemente como ácido
úrico y si es mayor en forma de urato. El ácido es soluble hasta concentraciones de 6-
7 mg%, precipitando en concentraciones mayores. En esa situación se puede
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precipitar en el parénquima renal o en las vías urinarias, llevando a cambios

histológicos que conducen a nefropatías o a urolitiasis, respectivamente.
Fisiológicamente, la uricosuria aumenta con la ingesta de proteínas y disminuye con
dietas ricas en glúcidos y grasas o pobres en proteínas. En patologías hepáticas y
leucemia aumentan los valores de concentración urinaria de úrico. Durante el ataque
agudo de gota, la uricosuria está disminuida, al igual que en casos de insuficiencia
renal.
3) EXAMEN MICROSCÓPICO (Sedimento urinario)

El examen del sedimento presente en una orina recién emitida o conservada
cuidadosamente puede constituirse en lo más importante del análisis de orina ya que
puede proveer datos precisos sobre la existencia de una enfermedad renal y sobre la
naturaleza y extensión de la lesión.
La orina previamente homogeneizada en forma suave se pasa a un tubo cónico y se la
centrifuga a baja velocidad, para evitar la deformación exagerada de los elementos a
investigar. Luego se elimina el sobrenadante por inversión del tubo, y se resuspende el
precipitado en la pequeña cantidad de orina que queda en el tubo. Esta muestra se
coloca entre porta y cubreobjetos limpios, observando al microscopio. La observación
del sedimento debe ser hecha en lo posible sobre la orina fresca, con no más de 6 h
de emitida, con preferencia sobre la orina de la mañana que es más concentrada. Es
recomendable guardar la muestra en la nevera si el examen no se realiza en forma
inmediata.
En el sedimento urinario podemos distinguir cualitativamente:
• Componentes inorgánicos: cristales inorgánicos de diferentes tipos.
• Componentes orgánicos: distintos tipos de células y cilindros, cristales orgánicos y
microorganismos.
4. Materiales, Equipos e insumos

 Tubos para centrifuga
 Cubreobjetos
 Portaobjetos
 Pipetas Pasteur
Equipos
Centrifuga
Microscopio
5. Reactivos
 Tiras reactivas
6. Procedimiento
A. Examen físico:
- Tome la orina y deposítela en un tubo para centrifuga, observe el color y anótelo en
la tabla de resultados.
B. Examen Químico
- Sumerja totalmente la tirilla hasta el último cuadro reactivo.

- Un minuto después se comparan los diferentes reactivos sometidos a la muestra con
el ítem estandarizado respectivo que aparece en el envase de las tirillas.
- Anote los resultados en la tabla.
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C. Examen microscópico
- Posteriormente rotulamos el tubo de ensayo y lo colocamos en la centrifugadora
durante 10minutos a 3000 revoluciones/minuto.
- Pasados los 10 minutos, vaciamos la orina en el grifo, y el sedimento que queda en
el fondo del tubo, lo depositamos en una lámina, cubrimos con una laminilla y queda
listo para el análisis directo al microscopio. Observe en objetivo de 10X y luego pase a
40X, para observar mejor las estructuras.
D. Interpretación de Resultados
- El examen químico arrojo parámetros consignados en la tabla, como puede

explicar los resultados?
- Cuales fueron las estructuras que se encontraron al examen microscópico y que
interés clínico poseen?
- Observando todos los resultados que puede concluir?
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Cuestionario
1. ¿Qué patologías se pueden asociar al análisis de orina?
2. ¿Cómo puede correlacionar con los resultados una infección renal?
3. ¿Qué biomarcadores se pueden obtener de la orina como una opción alterna a la
biopsia renal?
7. Nivel de Riesgo:
 Nivel 2: Riesgo Medio (Bata de Laboratorio, Guantes, Cofia, Tapabocas,

Zapato Cerrado Bajo, Pantalón Largo)
Manejo de residuos:
 Línea 19
8. Bibliografías
Laso Maria del Carmen. Interpretación del análisis de orina. Pediatria práctica.
2002. Arch.argent.pediatr ; 100(2) / 179.
Martha E. Baños-Laredo, Carlos A. Nuñez Alvarez, Javier Cabiedes. Análisis de

sedimento urinario. Reumatología clínica. 268-272.
Campuzano Maya Germán, Arbeláez Gómez Mario. El uroanalísis, un gran aliado

del médico. Urología Colombiana. 67.92.

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María del Pilar Trujillo

CARMEN ROSA CONTRERAS MONTAÑEZ

Practica 2: Soluciones Buffer 9

Practica 3: Precipitación diferencial de Proteínas 12

Practica 4: Reacciones Enzimáticas 16

Practica 5: Factores que afectan las reacciones Enzimáticas 18

Practica 6: Fermentación Alcohólica 22

Practica 7: Soluciones y diluciones 26

Practica 8: Diluciones en serie 37

Practica 9: Diluciones no seriadas 41

Practica 10: Preparación de estándares de trabajo 43

Practica 11: Espectroscopía y elaboración de una curva espectral 45

Practica 12: Elaboración de una curva de calibración 61

Practica 13: Separación de lípidos por cromatografía en capa fina 67

Normas de bioseguridad en el laboratorio:

 Se exige puntual asistencia.

los lugares indicados.

 Nivel 1: Riesgo Bajo (Bata de Laboratorio Manga Larga, Zapato Cerrado

 Nivel 2: Riesgo Medio (Bata de Laboratorio, Guantes, Cofia, Tapabocas,

 Nivel 3: Riesgo Alto (Bata, Mascara Respiratorias, Guantes, Cofia, Gafas

Sistema de precauciones universales.

Este sistema fue establecido por el Centro de Control de Enfermedades (C.D.C) de

Las precauciones universales parten del siguiente principio:

“Todos los pacientes y sus fluidos corporales independientemente del

Líquidos de precaución universal

La bioseguridad en el laboratorio se refiere a un conjunto de protocolos de trabajo que

Tipos de daños o lesiones

Señalización, signos y recomendaciones

Algunos símbolos designan peligros:

 Atención a sustancias inflamables.

Primarias: Localizadas en torno al origen del riesgo. Ejemplo, hacer la práctica

Secundarias: Localizadas en el círculo del practicante. Ejemplo, la relacionada con la

Terciarias: Localizadas alrededor del laboratorio. Ejemplo, material tóxico del

Disponible en Internet: http://www.qo.fcen.uba.ar/normas.htm.

Sistemas de Tampón - Soluciones Buffer – Sistemas Amortiguadores

Una solución amortiguadora consiste en una mezcla de un ácido débil y su base

Las soluciones amortiguadoras pueden mantener el pH en un valor relativamente

pH por arriba del pKa predomina la forma básica.

La condición de que un amortiguador contenga cantidades apreciables tanto de ácido

Cuando estudiamos los amortiguadores en teoría, es común usar la ecuación de

La proporción de ácido fórmico/formiato necesaria para mantener el ph de 4.0 se

Ph= pka+log base conjugada/ácido débil.

4.0=3.75 +log  HCOO / HCOOH .

Para calcular la proporción base/ácido, restamos 3.75 de 4.0, y tomamos el

 HCOO / HCOOH = 100.25= 1.78 6

Este amortiguador puede obtenerse, por ejemplo, mezclando volúmenes iguales de

Una buena parte de la bioquímica se estudia efectuando reacciones enzimáticas en un

A. Cálculos para preparar la siguiente solución amortiguadora

pH = pKa + log A-/AH

B. Medición de pH de las soluciones sin ácido y sin base

C. Medición de pH de las soluciones con ácido

D. Medición de pH de las soluciones con base

 Nivel 2: Riesgo Medio (Bata de Laboratorio, Guantes, Cofia, Tapabocas, Zapato

CAMPBELL, M. K, Farell, S. O. Bioquímica.4ª Ed .México. Thomson. 2004. P. -53-55.

1. PRECIPITACIÓN DIFERENCIAL DE PROTEÍNAS

La sangre está constituida por formas celulares en suspensión (eritrocitos, leucocitos y

Precipitación con fuerza iónica

Las proteínas se mantienen disueltas gracias a las interacciones no covalentes

El aumento de la fuerza iónica hasta un determinado punto aumenta la solubilidad de

A partir de una mezcla de proteínas, en esta práctica se harán precipitaciones al 40%

El volumen de la solución saturada de sulfato de amonio necesario para una

Identificación de proteínas mediante la reacción con el reactivo de Biuret

La presencia de proteínas en una mezcla se puede determinar mediante la reacción