ATIVIDADE 1- CONTAGEM DE MICRORGANISMOS AERÓBIOS MESÓFILOS

Preparo do material: 24/08/2018

Procedimento da análise: 31/08/2018
Horário: 16:00 às 19:20h

OBJETIVO
Determinar o número de microrganismos mesófilos presentes nas amostras analisadas através
dos métodos de contagem em placa empregando Ágar Padrão para Contagem (PCA),
fornecendo informações a respeito do grau de sanidade da mesma.

MATERIAL
Cada grupo receberá o seguinte material:
- Amostras de plantas medicinais (10g /grupo)
- Pipetas estéreis (1 mL)
- Aspiradores para pipetas (pipet pump) e peras
- Agitador de tubos (vórtex)
- Erlenmeyer com 90 mL de água peptonada 0,1%
- Tubos com 9 mL de água peptonada 0,1%
- 6 Placas estéreis vazias/grupo
- Alças de Drigalsky
- Banho-maria para manutenção de ágar PCA a 45°C para plaqueamento pour plate
- Erlenmeyer com 180 mL de PCA estéril mantido em banho-maria (50°C) ou tubos contendo
o meio PCA para verter nas placas;
- Becker com álcool (para flambar alça);
- Caneta de retroprojetor
- Estufa B.O.D a 37°C
- Recipientes para descarte de material

PROCEDIMENTO
Higienização das mãos antes e após o início das atividades.
Pesar assepticamente 10 gramas das amostras e diluir em 90 mL de água peptonada
0,1%. Agitar a mistura. Pipetar assepticamente uma alíquota de 1 mL desta diluição e preparar
diluições seriadas em tubos contendo 9 mL de água peptonada (até 1000 x). Trocar de pipeta
a cada diluição. Cada tubo deverá ser identificado com sua respectiva diluição. Identificar as
placas de Petri com as respectivas diluições.

- Plaqueamento em profundidade (pour plate):

Para o plaqueamento em profundidade pipetar alíquotas de 1 mL de cada diluição e
dispensar a alíquota na placa estéril vazia evitando depositar o inóculo no centro da placa para
facilitar a mistura do mesmo ao ágar. Adicionar à cada placa 20-25 mL de ágar padrão para
contagem, previamente fundido e resfriado à temperatura de 44 a 45°C. Homogeneizar com
movimentos circulares suaves no sentido horário e anti-horário (cerca de 10 vezes) até a
completa solidificação do meio de cultura. Em seguida proceder a incubação das placas
devidamente identificadas em posição invertida em B.O.D a 37°C.

Contagem total de aeróbios mesófilos: 37°C/48h (32°C no caso de derivados de leite), placas
invertidas.
ATIVIDADE 2 – CONTAGEM DE MICRORGANISMOS AERÓBIOS PSICROTRÓFICOS
PLAQUEAMENTO EM SUPERFÍCIE

Preparo do material: 14/09/2018

Procedimento da análise: 21/09/2018
Horário: 16:00 às 19:20h

OBJETIVO
Determinar o número de microrganismos mesófilos presentes nas amostras analisadas através
dos métodos de contagem em placa empregando Ágar Padrão para Contagem (PCA),
fornecendo informações a respeito do grau de sanidade da mesma.

MATERIAL
Cada grupo receberá o seguinte material:
- Amostras de queijo Minas (25g /grupo)
- Pipetas estéreis (1 mL)
- Aspiradores para pipetas (pipet pump) e peras
- Erlenmeyer com 225 mL de citrato de sódio 2%
- Tubos com 9 mL de água peptonada 0,1%
- 6 Placas contendo Ágar Padrão para Contagem (PCA)
- Alças de Drigalsky
- Becker com álcool (para flambar alça);
- Caneta de retroprojetor
- Estufa B.O.D a 37°C
- Recipientes para descarte de material

PROCEDIMENTO
Higienização das mãos antes e após o início das atividades.
Pesar assepticamente 25 gramas das amostras e diluir em 225 mL de citrato de sódio
2%. Agitar a mistura. Pipetar assepticamente uma alíquota de 1 mL desta diluição e preparar
diluições seriadas em tubos contendo 9 mL de água peptonada (até 1000 x). Trocar de pipeta
a cada diluição. Cada tubo deverá ser identificado com sua respectiva diluição. Identificar as
placas de Petri com as respectivas diluições.

- Plaqueamento em superfície (spread plate):

Para o plaqueamento em superfície, pipetar alíquotas de 0,1 mL de cada diluição e
dispensar a alíquota sobre a superfície do ágar PCA. Espalhar com alça de Drigalsky até a
completa absorção do inóculo pelo meio de cultura. Em seguida proceder a incubação das
placas devidamente identificadas em posição invertida em B.O.D a 37°C/48h.
ATIVIDADE 3- CONTAGEM DE FUNGOS FILAMENTOSOS E LEVEDURAS

Preparo do material: 28/09/2018

Procedimento da análise: 05/10/2018
Horário: 16:00 às 19:20h

OBJETIVO
Determinar o número de microrganismos presentes nas amostras analisadas através dos
métodos de contagem em placa de Ágar Batata Dextrose (BDA), fornecendo informações a
respeito do grau de sanidade da mesma.

MATERIAL
Cada grupo receberá o seguinte material:
- Amostras de plantas medicinais (10g /grupo)
- Pipetas estéreis (1 mL)
- 6 Placas contendo Agar Batata Dextrose (BDA)
- Pipeta Pasteur estéril
- Erlenmeyer com 90 mL de água peptonada 0,1%
- Solução de ácido tartárico a 10%
- Estufa a 25°C
- Aspiradores para pipetas (pipet pump)
- Agitador de tubos (vórtex)
- Tubos contendo 9 mL de água peptonada 0,1%
- Alças de Drigalsky
- Becker com álcool (para flambar alça);
- Caneta de retroprojetor
- Recipientes para descarte de material

PROCEDIMENTO
Para o isolamento de fungos filamentosos e leveduras, as diluições seriadas deverão
ser plaqueadas em Agar Batata Dextrose (BDA) ou DRBC. Em caso de uso do ágar BDA o
meio deve ser acidificado com ácido tartárico durante o preparo do mesmo ou no momento de
utilização, pingando-se 1 a 2 gotas sobre a superfície do ágar. Espalhar o inóculo com alça de
Drigalsky e incubar as placas a 25°C/5 dias.
ATIVIDADE 4- DETERMINAÇÃO DE COLIFORMES TOTAIS, COLIFORMES
TERMOTOLERANTES E Escherichia coli EM ALIMENTOS: TÉCNICA DOS TUBOS
MÚLTIPLOS (NMP)

Preparo do material: 19/10/2018

Procedimento da análise: 26/10/2018
Horário: 16:00 às 19:20h

OBJETIVO
Promover a capacitação de profissionais que atuam em laboratórios de análises
microbiológicas de alimentos e água para a execução da técnica dos tubos múltiplos na
enumeração de coliformes.

MATERIAL
Cada grupo receberá o seguinte material:
- Unidade amostral de plantas medicinais (10 g)
- Erlenmeyer com 90 mL de água peptonada 0,1%
- 3 Tubos contendo 9 mL de água peptonada
- 9 Tubos contendo Caldo Lauril Sulfato Triptose (LST)
- Tubos com Caldo Bile Verde Brilhante (VB)
- Tubos com Caldo EC
- Álcool a 70%
- Tubos contendo ágar nutriente (inclinado)
- 2 Placas de ágar EMB/grupo
- 2 Tubos de Agar Citrato de Simmons
- 2 Tubos contendo Caldo Triptona (indol)
- 4 Tubos contendo caldo VM/VP
- Reagente de Kovacs
- Vermelho de metila
- Solução de α-naftol
- Solução de hidróxido de potássio a 40%
- Banho-maria a 44,5°C
- BOD a 37°C
- Alças de semeadura
- Agulha de semeadura
- Pipetas de 1 mL

PROCEDIMENTO
Higienização das mãos antes e após o início das atividades.
Teste presuntivo:
Pesar assepticamente 10 gramas da amostra e diluir em 90 mL de água peptonada,
homogeneizando a amostra com movimentos circulares suaves. Preparar diluições seriadas
(até 1000x) e em seguida, transferir 1 mL para os tubos contendo Caldo Lauril Sulfato Triptose
e Incubar a 37°C/24-48h. Considerar positivos os tubos com produção de gás nos tubos de
Durham (presença de bolhas).

Teste confirmativo:
A partir de cada tubo positivo de Caldo LST, transferir uma alçada para tubos de Caldo
Bile Verde Brilhante (VB), previamente identificado (diluição correspondente). Incubar em
estufa a 37°C/24-48h. Considerar positivos os tubos com produção de gás no tubo de Durham.
Verificar na tabela de NMP o número correspondente e expressar o resultado em NMP de
coliformes totais por grama ou mL.

Coliformes termotolerantes:
De cada tubo de caldo LST positivo, transferir uma alçada para um tubo de caldo EC
previamente identificado (diluição correspondente). Incubar em banho-maria a 44,5°C/24h.
Considerar positivos os tubos com produção de gás no tubo de Durham. Verificar na tabela de
NMP o número correspondente e expressar o resultado em NMP de coliformes termotolerantes
ou a 44,5°C/g ou mL.

Escherichia coli:
Todas as subculturas positivas em caldo EC serão repicadas para ágar EMB, com
auxílio de alça de platina ou de níquel cromo, fazendo estrias (por esgotamento). Para cada
tubo positivo em caldo EC corresponderá uma placa (ou parte da placa) de ágar EMB,
identificada, para a perfeita correspondência. Incubar a 37°C/18-24h. Transcorrido este tempo,
verificar o crescimento de colônias com características de E. coli, ou seja, 2 a 3 mm de
diâmetro, com brilho metálico esverdeado ou com centro escuro abrangendo praticamente toda
a colônia.
De cada placa correspondente a cada tubo, repicar de 2 a 3 colônias características
para tubo com ágar nutriente inclinado, e incubar por 18-24h a 37°C. Efetuar em cada cultura
em ágar nutriente, as seguintes provas bioquímicas: indol; vermelho de metila-VM; Voges
Proskauer-VP; e citrato. Este grupo de prova é denominado IMVIC.
Considerar a cultura positiva para E. coli, quando forem obtidos os seguintes resultados
para o IMVIC:
Indol VM VP Citrato Tipo
+ + - - E. coli típica
- + - - E. coli atípica

Considerar positivo o tubo de caldo EC para E. coli, quando pelo menos uma cultura
dele proveniente for positiva no teste do IMVIC
ATIVIDADE 5- PESQUISA DE ESTAFILOCOCOS COAGULASE POSITIVO

Preparo do material: 09/11/2018

Procedimento da análise: 16/11/2018
Horário: 16:00 às 19:20h

IMPORTÂNCIA
A presença de Staphylococcus aureus nos alimentos é interpretada, em geral como
indicativo de contaminação a partir da pele, boca, e das fossas nasais dos manipuladores de
alimentos, bem como da limpeza e da sanificação inadequada dos materiais e dos
equipamentos.

OBJETIVO
Determinar o número de estafilococos coagulase positivo presentes nas amostras analisadas
por meio do plaqueamento em Ágar Baird-Parker, fornecendo informações a respeito do grau
de sanidade da mesma.

Material requerido (por grupo)

- Queijo Minas frescal ou muçarela (25 g de amostra)
- Pipetas (1mL)
- Placas contendo Ágar Baird-Parker
- Tubos com 9 mL de água peptonada (0,1%)
- Erlenmeyer com 225 mL de citrato de sódio a 2% (p/v)
- Tubos contendo caldo BHI
- Tubos contendo ágar nutriente (meio inclinado)
- Lâminas de microscopia
- Reagentes para coloração de Gram
- Peróxido de hidrogênio a 3%
- Plasma de coelho-EDTA
- 1 tubo de caldo ou ágar manitol
- Bastão de vidro estéril
Procedimento
Higienização das mãos antes e após o início das atividades.
Pesar assepticamente 25 gramas da amostra e diluir em 225 mL de citrato de sódio,
triturar com bastão de vidro (estéril) homogeneizando a amostra com movimentos circulares
suaves. Preparar diluições seriadas (até 1000 x) e em seguida, transferir 0,1 mL de cada
diluição para as placas contendo ágar Baird-Parker espalhando com alça de Drigalsky até a
secagem do meio. Incubar a 37°C/24-48h. Proceder a contagem de colônias das placas que
apresentarem crescimento entre 20 e 200 colônias.
Contagem das colônias presuntivas:
Contar as colônias típicas de Staphylococcus aureus: colônias circulares, pretas,
pequenas (máximo 1,5 mm em diâmetro), lisas, convexas, com bordas perfeitas, massa de
células esbranquiçada nas bordas, rodeadas por uma zona opaca e/ou um halo transparente
se estendendo para além da zona opaca.
Confirmação das colônias típicas:
Selecionar no mínimo cinco colônias típicas, para o teste de coagulase, e havendo
menos do que cinco, tomar todas. Transferir cada colônia para um tubo de Caldo Infusão
Cérebro Coração (BHI), emulsionar bem a massa de células com o caldo, transferir uma alçada
para um tubo com ágar nutriente (AN) inclinado e incubar ambos os tubos a 37°C/24h.
Teste de coagulase – transferir 0,2 mL de cada cultura obtida em BHI, para um tubo de
10x100mm. Adicionar aos 0,2 mL de cultura 0,3 mL de plasma de coelho com EDTA e misturar
com movimentos de rotação, sem agitar os tubos. Incubar em banho-maria a 37°C/1-4h e
observar se há formação de coágulo. Reações positivas de nível 3 ou 4 são consideradas
confirmativas da presença de Staphylococcus aureus. Culturas com reações positivas de nível
1 ou 2 devem ser submetidas a testes adicionais (termonuclease, catalase e coloração de
Gram), para a confirmação.
Teste de catalase – Adicionar 1,0 mL de água oxigenada (peróxido de hidrogênio) 3% à cultura,
na rampa dos tubos de AN. Observar se ocorre borbulhamento imediato (teste positivo) ou não
(teste negativo). Antes de utilizar a cultura em AN para o teste de catalase, preparar um
esfregaço para a coloração de Gram e repicar uma alçada em caldo BHI, para repetições se
necessárias.