20-03-2019

Trabalho 2:
Caracterização
de aminoácidos e
PL21 – GRUPO 5

proteínas
MARIANA SANTOS 52690
MARIANA SANTOS 52719

Página de

BIOQUÍMICA I | DOCENTE: SUSANA MARINHO

Índice
Resumo......................................................................................................................... 2
Apresentação, tratamento e discussão de resultados:...................................................3
1. Estudo das reações da ninidrina e do biureto.........................................................3
1.1. Reação da ninidrina.........................................................................................3
1.2. Reação do biureto............................................................................................3
1.3. Tratamento de resultados das reações da ninidrina e do biureto.....................4
2. Isolamento das ficobiliproteínas.............................................................................7
3. Agentes desnaturantes de proteínas......................................................................8
3.1. Testes qualificativos de desnaturação das ficobiliproteínas por diversos agentes químicos
............................................................................................................................... 8
3.2. Efeito da temperatura e da agitação mecânica na estrutura das proteínas......8
3.3. Tratamento de resultados dos agentes desnaturantes de proteínas................8
Conclusão.................................................................................................................... 13
Bibliografia................................................................................................................... 14

Página de
Resumo
O trabalho desenvolvido tinha como objetivo a observação de algumas reações coradas
características de aminoácidos e proteínas (reações da ninidrina e do biureto, respetivamente) e o
estudo da ação de vários agentes desnaturantes sobre as ficocianobilinas, proteínas isoladas a partir
de células de Spirulina desidratadas. Para observarmos a reação da ninidrina com os aminoácidos
adicionámos 1 mL de ninidrina a soluções neutras de glicina, albumina, clara de ovo e água destilada
e aquecemos até 100 ℃ . Concluímos que a ninidrina reage com as soluções que contém
aminoácidos (glicina, albumina e clara de ovo) adquirindo uma cor púrpura. Para observarmos a
reação do biureto com as proteínas preparámos uma solução de biureto (por adição de sulfato de
cobre a hidróxido de sódio) e adicionámos 2 mL desta solução a soluções de glicina, albumina, clara
de ovo e água destilada. Concluímos que o biureto só reage com soluções que contenham ligações
peptídicas (visto que reagiu com todas as soluções que a ninidrina reagiu exceto a glicina, que é um
aminoácido e portanto não tem ligações peptídicas) adquirindo uma cor violeta. Para estudarmos a
ação de vários agentes desnaturantes sobre as ficocianobilinas procedemos à isolação das mesmas
a partir de células de Spirulina e sujeitámo-las à ação dos vários agentes desnaturantes. Concluímos
que os solventes orgânicos (como a acetona e o etanol), a ureia, os ácidos e bases fortes (como o
ácido tricloroacético, o ácido clorídrico e o hidróxido de sódio) e o aumento da temperatura são
agentes desnaturantes das proteínas.

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Apresentação, tratamento e discussão de resultados:
1. Estudo das reações da ninidrina e do biureto

1.1. Reação da ninidrina

Inicialmente procedemos à adição de 2 mL das soluções seguintes a tubos de ensaio:

- Solução de glicina 0,5% (m/v)

- Solução de albumina 10 mg/mL

- Solução de clara de ovo 5% (v/v)

- Água destilada (tubo de ensaio de controlo da reação)

Dado que todas as soluções anteriormente referidas apresentavam um valor de pH neutro não
recorremos à adição de NaOH 0,1 M ou HCl 0,1 M para o seu ajuste.

Procedemos então à adição de 1 mL de ninidrina 1% (m/v) a cada uma das soluções e registámos as
alterações ocorridas.

Finalmente, colocámos os 4 tubos de ensaio, em simultâneo e durante 10 minutos, num banho

termostatizado a 100ºC e registámos o que se observou, assim como a ordem de aparecimento das
cores.

1.2. Reação do biureto

Adicionámos num erlenmeyer 15 gotas de uma solução de sulfato de cobre a 2% (m/v) a 12 mL de

NaOH a 10% (m/v). Após agitarmos bem a preparação observámos o aparecimento de uma cor
azulada.
Seguidamente adicionámos 2 mL desta solução a 2 mL de cada uma das soluções seguintes:
- Solução de glicina 0,5% (m/v)
- Solução de albumina 10 mg/mL
- Solução de clara de ovo 5% (v/v)
- Água destilada (tubo de ensaio de controlo da reação)
Finalmente anotámos o resultados referentes à cor apresentada por cada tubo de ensaio.
Os resultados obtidos no decorrer do estudo das reações da ninidrina e do biureto encontram-se
registadas no Quadro 1.

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1.3. Tratamento de resultados das reações da ninidrina e do biureto

Quadro 1- Estudo das reações da ninidrina e do biureto.

Observações
Teste Solução Resultado
Início Após aquecimento
Água destilada Incolor Incolor Negativo

Glicina Violeta Púrpura e líquido (1º) Positivo

Ninidrina
Albumina Incolor Púrpura e sólido (2º) Positivo

Clara de ovo Incolor Púrpura e sólido (3º) Positivo

Água destilada Incolor Negativo

Glicina Incolor Negativo

Biureto
Albumina Púrpura Positivo

Clara de ovo Púrpura Positivo

A ninidrina (2,2-diidroxi-hidrindeno-1,3-diona), composto heterocíclico oxidante, reage com aminas

primárias livres de aminoácidos produzindo um complexo cuja tonalidade escura se denomina
púrpura de Ruhemann1. A intensidade da cor observada depende da concentração de aminoácidos
na solução.
Em geral a reação da ninidrina com aminoácidos traduz-se da seguinte forma:

Figura 1 - Reação da ninidrina com um aminoácido cujo grupo primário é livre

[ CITATION
1 Púrpura de Ruhemann – A tonalidade Uni19
adquire \l 2070
o nome do] químico Siegfried Ruhemann que descobriu a
ninidrina em 1910 e que mais tarde observou a produção da tonalidade em causa após a reação da ninidrina
com aminoácidos.
Página de
No entanto, é de notar que nem todos os aminoácidos apresentam um
grupo amina primário, por exemplo a prolina (Error: Reference source not
found) cuja cadeia lateral é alifática e apolar apresenta uma estrutura
cíclica, pelo que o seu grupo amina é secundário e não livre. Deste modo
concluímos que a ninidrina não reage com a
prolina[ CITATION Nev19 \l 2070 ] segundo o mecanismo representado
pela Error: Reference source not found uma vez que este não Figura 2 - Estrutura da se adequa ás
prolina
características estruturais do aminoácido em causa, ocorrendo em vez disso a
formação de um complexo amarelo).

Após a execução do procedimento e o registo dos resultados obtidos podemos observar que a adição
de 1 mL de ninidrina às soluções de controlo, glicina, albumina e clara de ovo não conduziu a
qualquer alteração até à colocação das misturas num banho termostatizado cuja temperatura atingia
os 100 ℃ , exceto no tubo onde se encontravam as soluções de glicina e ninidrina que reagiram
ligeiramente á temperatura ambiente.
Era expectável que o tubo de ensaio de controlo (mistura de ninidrina e água destilada) apresentasse
um resultado negativo uma vez que na inexistência de grupos amina em água destilada, não
ocorreria qualquer reação ao lhe ser adicionada uma solução de ninidrina, independentemente da
temperatura do meio. O resultado experimental coincidiu com o esperado, uma vez que não se
observaram quaisquer alterações de cor antes ou após aquecimento.
No tubo de ensaio onde se encontrava a mistura de soluções de ninidrina
e glicina observou-se o aparecimento de um tom violeta após a adição da
solução de ninidrina á temperatura ambiente e, após
aquecimento, a mistura líquida adquiriu a característica tonalidade
púrpura de Ruhemann. Tal resultado está de acordo com o esperado
dado que a glicina (Error: Reference source not found) é um α-
aminoácido cujo grupo amina primário reage com a solução Figura 3 - Estrutura da glicina de
ninidrina de acordo com o mecanismo esquematizado na Error:
Reference source not found.
Por sua vez, a albumina e a clara de ovo (mistura que contém proteínas sendo a albumina a mais
predominante [ CITATION Wik17 \l 2070 ]) registaram um resultado positivo no teste de ninidrina dado
que após aquecimento se observou a cor púrpura de Ruhemann o que comprova a existência de
aminoácidos nas misturas. Por outro lado, ambas as soluções, contrariamente ao que se observou na
mistura de ninidrina e glicina, solidificaram, resultado que advém da desnaturação proteica.
Finalmente, o aumento da temperatura traduz-se no aumento da energia cinética do sistema pelo que
as partículas tendem a deslocar-se mais freneticamente colidindo entre si e permitindo que a ninidrina
reaja melhor com o substrato nestas condições. Este facto permite explicar o porquê da tonalidade
púrpura surgir em todos o tubos de ensaio (exceto no de controlo) apenas após aquecimento. O tom
violeta que surgiu no tubo de ensaio que continha a mistura de ninidrina e glicina indica que a reação
se iniciou á temperatura ambiente, intensificando-se após o aumento da temperatura.

Página de
O biureto é um reagente analítico resultante da adição de hidróxido de sódio (ou potássio) a sulfato
de cobre. Este composto cuja coloração inicial azul dá lugar ao violeta na presença de proteínas e
péptidos com três ou mais resíduos de aminoácidos permite detetar a presença de ligações
peptídicas de forma qualitativa visto que a intensidade da coloração violeta varia de acordo com a
concentração de proteínas na amostra analisada. Assim concluímos que o teste do biureto deu negativo
no tubo de ensaio que continha água destilada e o α-aminoácido glicina (soluções incolores antes e
após a adição do biureto) e positivo nos tubos de ensaio que continham as soluções de clara de ovo
e albumina (soluções incolores antes da adição do biureto e violeta depois da adição do reagente).
Tais resultados resultam do facto de apenas existirem ligações peptídicas na soluções proteicas de
albumina e clara de ovo, o que coincide com o que estávamos à espera, visto que nem a água nem a
glicina (que é um aminoácido) têm ligações peptídicas.
O mecanismo envolvido na reação acima descrita resulta da capacidade do ião Cu 2+ interagir com
átomos de nitrogénio envolvidos em ligações peptídicas formando o complexo seguinte:

Figura 4 - Mecanismo da reação do biureto[ CITATION Uni19 \l 2070 ]

Página de
 2. Isolamento das ficobiliproteínas

Pesar 750 mg de Pesar uma massa

Tarar um vidro células de Spirulina em idêntica de sílica gel
de relógio pó no vidro de relógio 60

Dividir a mistura Triturar a mistura de Colocar as células de

igualmente por encontro aos lados e Spirulina e a sílica gel
quatro tubos de fundo durante 10 60 num almofariz
centrífuga minutos

Adicionar 7 mL de Suspender a mistura na Centrifugar as amostras

tampão de fosfatos solução tampão com o a 2 000 rpm durante 4
(pH 7,0) 100 mM a auxílio de uma vareta minutos
cada tubo de vidro

Remover o Após a centrifugação,

sobrenadante com o elaborar um esquema
Proceder á filtração
auxílio de uma pipeta do tubo de centrífuga
do sobrenadante
de Pasteur para um
tudo de ensaio limpo

Recolher o
aproximadamente 15
mL de filtrado límpido
num Erlenmeyer

Cuidados a ter:

 Os tubos de centrífuga devem estar equilibrados entre

si dois a dois e devem ser colocados no rotor numa
posição simétrica relativamente ao eixo.
 Aquando da remoção do sobrenadante evitar perturbar
o precipitado. Figura 5 - Esquema do tubo de centrífuga
 Humedecer o papel de filtro com água destilada Página
para de
uma maior aderência ao funil a utilizar na filtração

Figura 6 - Fluxograma explicativo do processo de isolamento das ficobiliproteínas

 3. Agentes desnaturantes de proteínas

3.1. Testes qualificativos de desnaturação das ficobiliproteínas por diversos agentes químicos

Adicionámos 1 mL da solução de proteínas preparada anteriormente a diferentes tubos de ensaio

contendo separadamente 5 mL de cada uma das seguintes soluções:
1) Tampão de fosfatos (pH 7,0) 100 mM (tubo de controlo da reação)
2) Água destilada
3) Acetona
4) Etanol
5) SDS 5% (v/v) 100 mM
6) Ureia 8 M em tampão de fosfatos (pH 7,0) 100 mM
7) Ácido tricloroacético a 10% (m/v)
8) HCl 1 M
9) NaOH 1 M
Agitámos cuidadosamente as soluções por inversão e registámos a cor e a transparência final das
várias soluções, comparando-as sempre com o tubo de ensaio controlo (tubo de ensaio nº1).

3.2. Efeito da temperatura e da agitação mecânica na estrutura das proteínas

Adicionámos 1 mL da solução de proteínas a 5 mL de tampão de fosfatos (pH 7,0) 100 mM em três

tubos de ensaio distintos.
Colocámos um dos tubos de ensaio num banho de água a ferver durante 5 minutos, outro tubo em
gelo durante 5 minutos e agitámos o terceiro tubo vigorosamente num vórtex durante 5 minutos.
Medimos a temperatura em cada uma das situações.
Finalmente registámos a cor e a transparência final das várias soluções, comparando-as sempre com
o tubo controlo do ensaio anterior.

3.3. Tratamento de resultados dos agentes desnaturantes de proteínas

Os resultados obtidos no decorrer do estudo da ação desnaturante de diversos agentes químicos e

físicos sobre as ficobiliproteínas foram registados no Quadro 2.
Considerámos como tubo controlo do ensaio o tubo 1 (Tampão de fosfatos (pH 7,0) 100 mM), visto
que a solução de ficobiliproteínas que preparámos anteriormente se encontrava numa solução
tampão de fosfatos (pH 7,0) 100 mM, logo a cor e transparência obtidas neste tubo de ensaio
serviram como termo de comparação para os restantes tubos de ensaio.

Página de
Quadro 2 - Estudo da ação desnaturante de diversos agentes químicos e físicos sobre as ficobiliproteínas

Observações Resultado
Ensai Agente
o desnaturante Desnaturaçã Agregaçã
Cor Transparência
o o

1 Tampão de
(controlo fosfatos (pH Azul Transparente Não Não
) 7,0) 100 mM

Água
2 Azul Transparente Não Não
destilada

3 Acetona Azul claro Opaco Sim Sim

4 Etanol Azul claro Opaco Sim Sim

SDS 5% (v/v)
5 Azul Transparente Não Não
100 mM

Ureia 8 M em
tampão de
6 Azul claro Transparente Sim Não
fosfatos (pH
7,0) 100 mM
Ácido
tricloroacétic Precipitado Ligeiramente
7 Sim Sim
o a 10% esverdeado opaco
(m/v)

8 HCl 1 M Azul claro Opaco Sim Sim

Verde
9 NaOH 1 M Transparente Sim Não
amarelado

Azul
10 T=100 ℃ Transparente Sim Não
acinzentado

11 T=0 ℃ Azul Transparente Não Não

Página de
 Agitação
12 Azul Transparente Não Não
mecânica

As ficobiliproteínas contêm um grupo cromóforo chamado ficocianobilina (um tetrapirrolo aberto) que
está ligado covalentemente à proteína através de uma ligação tioéter a um resíduo de cisteína (Figura
7).

Figura 7 - Estrutura da ficocianobilina[ CITATION Hel00 \l 2070 ]

Na proteína nativa, a ficocianobilina é mantida numa conformação planar (o que lhe dá uma cor azul)
através do estabelecimento de ligações de hidrogénio e electroestáticas com as cadeias laterais de
resíduos de aminoácidos próximos – a proteína atua como um esqueleto que mantém o cromatóforo
ligado na posição desejada.
Quando a proteína sofre desnaturação, o centro de ligação do grupo cromóforo sofre alterações e o
tetrapirrolo adquire uma conformação cíclica, o que leva à alteração do seu espetro de absorção e,
por consequência, à diminuição ou desaparecimento da cor azul da proteína. Para além disto, quando
as proteínas desnaturam, tendem a agregar-se de modo a protegerem as suas cadeias laterais
apolares (que passaram a estar expostas) e a precipitar da solução, o que faz com que a solução
adquira um aspeto leitoso.
Ou seja, consideramos que houve desnaturação das proteínas se ocorrer uma mudança de cor na
solução e consideramos que ocorreu agregação se a solução ficar turva após adição de um reagente.
Tendo em conta esta informação, podemos preencher as duas últimas colunas do Quadro 2.

No tubo de ensaio nº2, adicionámos água destilada à solução de proteínas e observámos que não
ocorreu qualquer alteração à sua cor ou transparência, ou seja não ocorreu desnaturação das
proteínas e a água limitou-se a diluir a solução.
Nos tubos nº3 e 4, adicionámos à solução de proteínas acetona e etanol, respetivamente e
observámos que as soluções adquiriram uma cor azul mais clara e ficaram turvas, ou seja, ocorreu
desnaturação e agregação das proteínas. Isto acontece porque tanto a acetona como o etanol são
solventes orgânicos que possuem um átomo de oxigénio eletronegativo que vai levar à quebra das
ligações de hidrogénio que estabilizam a estrutura da proteína, desnaturando-a.

Página de

Figura 8 - Estrutura da Figura 9 - Estrutura do

acetona[CITATION Wik14 \l 2070 ] etanol[ CITATION Wik18 \l 2070 ]
 No
tubo
nº5

Figura 10 - Estrutura do SDS

adicionámos uma solução de dodecilo sulfato de sódio (SDS) 5% (m/v) à solução de proteínas e não
observámos qualquer alteração na solução, ou seja, não ocorreu desnaturação das proteínas.
O SDS é um composto que pode atuar como detergente, ou seja tem grupos hidrófobos (CH 3 e CH2)
e hidrofílicos (grupos S=O), ou seja, era de esperar que este fosse interagir com as cadeias laterais
hidrófobas das proteínas através do seu grupo hidrófobo e com as cadeias laterais hidrofílicas e com
as moléculas de água através do seu grupo hidrofílico, alterando a estrutura da proteína e causando
a sua desnaturação[ CITATION Quo17 \l 2070 ], mas tal não aconteceu experimentalmente, o que se
deve ter dado à má preparação da solução de SDS.
No tubo nº6, adicionámos à solução de proteínas uma solução de ureia 8
M em tampão de fosfatos (pH 7,0) 100 mM e observámos uma
mudança de cor para azul claro, ou seja, ocorreu desnaturação das
proteínas, mas como a solução continuou transparente concluímos que não
ocorreu agregação. Isto pode acontecer porque a ureia compete com a
proteína pela ligação por pontes de hidrogénio à água[ CITATION
Figura 11 - Estrutura da
Bow00 \l 2070 ] ou porque a ureia forma ligações de hidrogénio com ureia[ CITATION Wik181 os
resíduos de aminoácidos das proteínas que competem com as \l 2070 ]
ligações de hidrogénio que mantêm a estrutura da proteína,
quebrando-as[CITATION Quo16 \l 2070 ].
No tubo nº7, adicionámos ácido tricloroacético a 10% (m/v) à solução de
proteínas e observámos a formação de um precipitado esverdeado que deu à
solução um aspeto ligeiramente opaco, ou seja, ocorreu desnaturação e
agregação das proteínas. Isto deve-se ao facto de o ácido
tricloroacético ser um ácido forte e a sua adição à solução de proteínas vai provocar uma alteração
de pH, que leva a alterações na carga global dos aminoácidos, que vai Figura 12 - Estrutura do
levar à desnaturação das proteínas. ácido
tricloroacético[ CITATIO
No tubo nº8 adicionámos ácido clorídrico à solução de proteínas e N Wik171 \l 2070 ]

observámos uma mudança de cor para azul claro, ou seja ocorreu desnaturação das proteínas. Como
a solução ficou opaca concluímos que também ocorreu agregação. O ácido clorídrico também é um
ácido forte, logo reage com as proteínas de modo semelhante ao ácido tricloroacético.
No tubo nº9 adicionámos hidróxido de sódio à solução de proteínas e observámos uma mudança de
cor para verde amarelado, ou seja ocorreu desnaturação das proteínas. Como a solução continuou
transparente concluímos que não ocorreu agregação. O hidróxido de sódio é uma base forte, ou seja,
a sua adição à solução de proteínas vai provocar uma alteração de pH, logo este vai reagir com as
proteínas de modo semelhante ao ácido tricloroacético e ao ácido clorídrico.

Página de
No tubo nº10 aquecemos a solução de proteínas a 100 ℃ durante 5 minutos e observámos uma
mudança de cor para azul acinzentado, não houve qualquer alteração na transparência da solução,
logo pudémos concluir que ocorreu desnaturação das proteínas mas não ocorreu agregação. Isto
acontece porque com o aumento da temperatura ocorreu um aumento da energia cinética, o que
levou à quebra das ligações de hidrogénio, o que afetou a estrutura das proteínas.

No tubo nº11 arrefecemos a solução de proteínas até 0 ℃ durante 5 minutos e não observámos
qualquer alteração na cor ou na transparência da solução, ou seja, não ocorreu desnaturação das
proteínas. Não houve qualquer alteração porque com a diminuição da temperatura ocorreu também
uma diminuição da energia cinética, logo não havia energia suficiente para quebrar as ligações de
hidrogénio e a proteína manteve a sua conformação.
No tubo nº12 agitámos vigorosamente a solução de proteínas num vórtex durante 5 minutos e
também não observámos qualquer alteração, ou seja, também não ocorreu desnaturação de
proteínas. Não houve qualquer alteração porque a potência do vórtex não foi suficiente para atingir a
energia cinética necessária para quebrar as ligações de hidrogénio e alterar a estrutura das
proteínas.

Página de
Conclusão
Em geral, concluímos que a maioria dos resultados experimentais obtidos estão de acordo com os
resultados teóricos esperados.
Ao nível do estudo das reações da ninidrina e do biureto percebemos que a primeira solução permite
a deteção de aminoácidos presentes numa dada mistura e a segunda solução permite a deteção da
presença de ligações peptídicas, podendo ser útil na determinação da concentração de proteínas em
solução. Assim observámos que a ninidrina reagiu com a glicina, com a albumina e com a solução de
clara de ovo, mas não reagiu com a água destilada. Por sua vez, observámos que o biureto reagiu
com as soluções de albumina e clara de ovo, mas não com a solução de glicina e água destilada.
Resultados experimentais concordantes com as expectativas teóricas.
Relativamente ao estudo de agentes desnaturantes de proteínas concluímos, através da execução de
testes qualitativos com diversos agentes químicos e físicos, que as ficobiliproteínas sofreram
desnaturação ao reagirem com a acetona, o etanol, a ureia, o ácido tricloroacético, o ácido clorídrico
e o hidróxido de sódio, além de desnaturarem após aquecimento. A desnaturação proteica é visível
através da alteração da cor da mistura, dado que o centro de ligação do grupo cromóforo sofre
alterações levando à modificação do seu espetro de absorção.
Por outro lado, a mistura pode também adquirir um aspeto opaco ou turvo que remete para a
agregação proteica resultante da proteção das cadeias hidrofóbicas após a desnaturação. Os
reagentes químicos que conduziram á agregação proteica da ficobiliproteínas foram a acetona, o
etanol, o ácido tricloroacético e o ácido clorídrico.
Todos os resultados anteriormente descritos eram expectáveis, no entanto seria de esperar que a
solução de SDS e o efeito da agitação mecânica tivessem também capacidade para desnaturar as
proteínas em estudo, este resultado não foi observado experimentalmente provavelmente devido a
uma incorreta preparação das soluções em causa e da baixa potência do vórtex.
Por fim, a água destilada, a solução tampão de fosfatos e a diminuição da temperatura a que a
mistura proteica foi sujeita não contribuíram para a desnaturação e agregação proteicas uma vez que
a água e a solução tampão não são agentes caotrópicos2 e a baixa temperatura, ao fazer diminuir a
energia cinética do sistema não contribui para esse efeito.

2 Agente caotrópico – Substância que interfere em ligações intramoleculares não covalentes contribuindo para a
desnaturação de macromoléculas como por exemplo proteínas.
Página de
Bibliografia

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http://www.fcfar.unesp.br/alimentos/bioquimica/praticas_proteinas/reacoes_coradas.htm.
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[Acedido em 23 Março 2019].

[3] Universidade Estadual Paulista, [Online]. Available:

http://www.fcav.unesp.br/Home/departamentos/tecnologia/luciamariacararetoalves/aula-pratica-
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[10] Wikipedia, “Ureia,” 2018. [Online]. Available: https://pt.wikipedia.org/wiki/Ureia. [Acedido em 24

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[11] Wikipedia, “Ácido tricloroacético,” 2017. [Online]. Available: https://pt.wikipedia.org/wiki/

%C3%81cido_tricloroac%C3%A9tico. [Acedido em 24 Março 2019].

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